胰腺細針穿刺活檢組織K-ras突變檢測的診斷價值

王小瑋 高軍 任艷 顧俊駿 金震東 杜奕奇 湛先保 陳潔 黃浩杰 李兆申

·論著·

胰腺細針穿刺活檢組織K-ras突變檢測的診斷價值

王小瑋 高軍 任艷 顧俊駿 金震東 杜奕奇 湛先保 陳潔 黃浩杰 李兆申

目的檢測內(nèi)鏡超聲引導(dǎo)下細針穿刺穿刺物中K-ras基因的突變，探討其對胰腺癌早期診斷的價值。方法收集27例胰腺癌、9例其他惡性腫瘤及14例良性胰腺占位患者的細針穿刺物，應(yīng)用肽核酸(PNA)鉗制PCR法檢測K-ras突變。結(jié)果胰腺癌患者K-ras突變陽性率為88.9%，其他惡性腫瘤為44.4%，良性胰腺占位為35.7%，胰腺癌與其他兩種病變差異顯著(P=0.013，P=0.001)。胰腺癌與其他惡性腫瘤比較，K-ras基因突變的敏感性、特異性、陽性預(yù)測率、陰性預(yù)測率、準確率分別為88.9%、55.6%、85.7%、62.5%、80.6%，差異顯著(P=0.013)；與良性胰腺占位病變比較，分別為88.9%、64.3%、82.8%、75.0%、80.5%，差異亦顯著(P=0.001)。聯(lián)合穿刺物細胞學檢查和K-ras基因突變檢測，胰腺癌的陽性率高達96.3%。結(jié)論胰腺組織穿刺物的K-ras基因突變檢測可提高胰腺癌診斷的陽性率。

胰腺腫瘤； K-ras基因； 肽核酸類； 基因診斷

超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下細針穿刺術(shù)(EUS-FNA)可簡單、安全地獲得胰腺組織的細胞標本。但由于不易操作等多個因素，使EUS-FNA對胰腺癌診斷的敏感性、特異性及準確性存在較大差異[1-2]。 K-ras基因突變與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]，在手術(shù)切除的胰腺癌組織中突變率可達95%[4]，且?guī)缀醵技杏诘?外顯子的12密碼子，以CGT、GTT和GAT三種突變類型最為常見[5]。本文建立一種新的K-ras基因突變的肽核酸(PNA)鉗制PCR檢測方法，提高了檢測靈敏度，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

一、一般資料

收集我院2008年9月至2009年6月對胰腺及鄰近臟器占位性病變進行EUS-FNA檢查的50例患者，其中男26例，女24例，平均年齡59歲。所有患者均檢測血CA19-9和CEA，并行其他影像學檢查。最后確診胰腺癌27例，其他惡性腫瘤9例(肝癌1例，惡性胃間質(zhì)瘤3例，后腹膜腺癌2例，壺腹癌3例)，良性胰腺占位14例(導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤5例，胰腺囊腺瘤3例，非慢性胰腺炎的炎性改變4例，慢性胰腺炎2例)。

二、 FNA標本的收集及DNA的抽提

EUS-FNA由專職醫(yī)師完成。當EUS在胃內(nèi)清楚顯示病灶后，按與病灶最近的距離確定穿刺路徑。用探頭靠近并緊壓病灶相對應(yīng)的胃壁，經(jīng)活檢鉗道插入穿刺套針，用19G或22G穿刺針刺破胃壁至病灶內(nèi)，在10 ml注射器負壓下對腫塊來回抽吸5～10次。細針穿刺所得大部分組織置于10%多聚甲醛中固定，常規(guī)行病理檢查，剩余組織置液氮中保存?zhèn)溆谩Ｎ茨塬@得組織時，用0.5～1 ml的生理鹽水將穿刺物沖入20 ml的液積溶液(安必平，中國)，混勻后取5 ml，離心，沉淀置-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩ＪＳ嘁悍e溶液離心，取沉淀涂片行細胞學檢查。術(shù)后給予患者口服抗生素，無1例出現(xiàn)穿刺并發(fā)癥。

采用QIAamp DNA Micro Kit試劑盒(德國QIAGEN公司)抽提凍存組織或液積沉淀細胞的DNA。應(yīng)用分光光度計測A260和A280值，計算DNA濃度，-20℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

三、K-ras基因突變檢測

采用肽核酸鉗制(PNA)PCR方法。由韓國PNAGENE公司設(shè)計、合成與野生型K-ras基因12、13密碼子完全匹配的PNA。根據(jù)人K-ras基因序列用Primer5.0軟件自行設(shè)計引物序列，P1:ATAGTGTATTAACCTTATGTGTGA，P2：CCTTATGTGTGACATGTTCTAATATAGTC， P3：TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTC，由Invitrogen公司合成。第一輪行鉗制PCR，反應(yīng)體系中含引物P1、P3和PNA。擴增條件：95℃ 3 min，94℃ 20 s、70℃PNA結(jié)合15 s、58℃ 20 s、72℃ 30 s，40個循環(huán)，最后72℃ 5 min。取第一輪產(chǎn)物作為模板進行第二輪PCR，反應(yīng)體系中含引物P3和P2。擴增條件：95℃ 3 min，94℃ 20 s、58℃ 20 s、72℃ 30 s， 35個循環(huán)，最后72℃ 5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、自動成像系統(tǒng)攝影。并將擴增條帶送Invitrogen公司測序。

四、統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS16.0進行數(shù)據(jù)分析，采用Fisher′s Exact Test方法檢驗各自率之間的差異，顯著性差異水準為P<0.05。

結(jié) 果

一、細針穿刺物K-ras基因突變率

胰腺癌的K-ras突變陽性率為88.9%(24/27)，其中GGT→GAT 12例，GGT→GTT 10例，GGT→GCT 1例，GGT→CGT 1例，測序圖見圖1。其他惡性腫瘤的突變陽性率為44.4%(4/9)，其中GGT→GAT 2例，GGT→GTT 1例，GGT→GCT 1例。良性胰腺占位的突變陽性率為35.7%(5/14)，GGT→GAT 3例，GGT→GTT 2例。

圖1 檢測到的4種代表性K-ras 12密碼子突變的測序圖

二、K-ras突變對胰腺占位的診斷價值

本組胰腺癌、其他惡性腫瘤、良性胰腺占位患者的CA19-9的陽性率(≥37 U/L)分別為55.6%(15/27)、22.2%(2/9)、28.6%(4/14)，CEA陽性率(≥10 U/L)分別為25.9%(7/27)、44.4%(4/9)、7.1%(1/14)；其他影像學檢查診斷準確率分別為55.6%(15/27)、22.2%(2/9)、28.6%(4/14)；FNA穿刺物組織細胞學診斷陽性率分別為59.3%(16/27)、22.2%(2/9)、0。聯(lián)合細胞學檢查和K-ras基因突變檢測，胰腺癌的陽性率高達96.3%。胰腺癌與其他惡性腫瘤比較，穿刺物K-ras突變的敏感性、特異性、陽性預(yù)測率、陰性預(yù)測率、準確率分別為88.9%、55.6%、85.7%、62.5%、80.6%，相差顯著(P=0.013)；與良性胰腺占位病變比較，分別為88.9%、64.3%、82.8%、75.0%、80.5%，差異亦顯著(P=0.001)。而其他惡性腫瘤與良性胰腺占位的K-ras突變無顯著差異(P=1.00)。

討 論

由于胰腺癌缺乏特異性癥狀，約有85%的患者失去手術(shù)機會，故如何提高胰腺癌的診斷水平成為改善胰腺癌患者預(yù)后的主要環(huán)節(jié)。腫瘤相關(guān)基因的分子生物學檢測與內(nèi)鏡影像學檢查聯(lián)合診斷方法可能是目前發(fā)現(xiàn)早期胰腺癌的有效方法之一。既往報道[6]，胰腺癌K-ras基因突變率在75%～95%，癌前病變PanIN-1a、1b及2-3標本中K-ras的突變率分別為 36%、44%和87%，所以檢測胰腺組織K-ras突變有助于早期胰腺癌的發(fā)現(xiàn)。

檢測K-ras突變的方法較多，對于EUS-FNA穿刺物主要采用PCR-SSCP和PCR-RELP方法。PCR-RELP僅可檢測12密碼子的突變，需要兩次PCR和兩次酶切，步驟繁瑣[7-8]；PCR-SSCP對于混有大量正常組織的檢測標本易出現(xiàn)假陰性[9]。本研究采用肽核酸鉗制PCR技術(shù)[10]，利用PNA與完全匹配的DNA結(jié)合的穩(wěn)定性遠遠高于不能完全匹配的DNA這一特性[11]，在第一輪PCR引物退火之前引入PNA，使PNA與野生型模板結(jié)合，從而在退火期和延伸期抑制野生型模板的擴增。通過設(shè)計套式擴增引物，在第二輪PCR時將第一輪擴增產(chǎn)物有效放大，且同時檢測K-ras12、13密碼子的突變。應(yīng)用該法，本組胰腺癌的檢測靈敏度為88.9%，明顯高于以往文獻報道，聯(lián)合組織細胞學結(jié)果，靈敏度高達96.3%。在EUS-FNA活檢物檢測K-ras突變對以下患者具有潛在的診斷價值：(1)當找到可疑細胞時，K-ras突變陽性幾乎可確定為惡性腫瘤； (2)當細胞學樣品不足或未找到惡性細胞時，K-ras突變陽性可高度提示惡性腫瘤的診斷，但必須聯(lián)合其他臨床檢測進行綜合診斷。

本組2例未獲得影像學、血清學或組織細胞學的明確診斷，通過檢測穿刺物的K-ras突變而明確診斷，提高了胰腺癌的診斷率。

[1] Harewood GC,Wiersema MJ.Endosonography-guided fine needle aspiration biopsy in the evaluation of pancreatic masses.Am J Gastroenterol,2002,97:1386-1391.

[2] Ylagan LR,Edmundowicz S,Kasal K,et al.Endoscopic ultrasound guided fine-needle aspiration cytology of pancreatic carcinoma:a 3-year experience and review of the literature.Cancer,2002,96:362-369.

[3] Hruban RH,Wilentz RE,Kern SE.Genetic progression in the pancreatic ducts.Am J Pathol,2000,156:1821-1825.

[4] Almoguera C,Shibata D,Forrester K,et al.Most human carcinomas of the exocrine pancreas contain mutant c-K-ras genes.Cell,1988,53:549-554.

[5] Mizumoto K,Tanaka M.Genetic diagnosis of pancreatic cancer.J Hepato-biliary-pancreat Surg,2002,9:39-44.

[6] Kimura W,Zhao B,Futakawa N,et al.Significance of K-ras codon 12 point mutation in pancreatic juice in the diagnosis of carcinoma of the pancreas. Hepatogastroenterology,1999,46:532-539.

[7] Pellise M,Castells A,Gines A,et al.Clinical usefulness of KRAS mutational analysis in the diagnosis of pancreatic adenocarcinoma by means of endosonography-guided fine-needle aspiration biopsy.Aliment Pharmacol Ther,2003,17:1299-1307.

[8] Tada M,Komatsu Y,Kawabe T,et al.Quantitative analysis of K-ras gene mutation in pancreatic tissue obtained by endoscopic ultrasonography-guided fine needle aspiration: clinical utility for diagnosis of pancreatic tumor.Am J Gastroenterol,2002,97:2263-2270.

[9] Takahashi K,Yamao K,Okubo K,et al.Differential diagnosis of pancreatic cancer and focal pancreatitis by using EUS-guided FNA.Gastrointest Endosc,2005,61:76-79.

[10] Taback B,Bilchik AJ,Saha S,et al.Peptide nucleic acid clamp PCR: a novel K-ras mutation detection assay for colorectal cancer micrometastases in lymph nodes.Int J Cancer,2004,111:409-414.

[11] Brandstetter H,Kim JS,Groll M,et al.Crystal structure of the tricorn protease reveals a protein disassembly line.Nature,2001,414:466-470.

2009-10-23)

(本文編輯：呂芳萍)

ThevalueoftheK-rasmutationsinFNAsamplesofpancreasonthediagnosisofpancreaticcancer

WANGXiao-wei,GAOJun,RENYan,GUJun-jun,JINZhen-dong,DUYi-qi,ZHANXian-bao,CHENJie,HUANGHao-jie,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email：lizhaoshen111@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the diagnostic value of the K-ras mutations in FNA samples for early detection of pancreatic cancer.MethodsFNA samples of 27 patients with pancreatic cancers, 9 patients with other malignant tumors and 14 patients with non malignant pancreatic mass (NMPM) were collected. DNA was extracted, and K-ras gene was amplified through PNA-mediated PCR clamping, the products were sequenced to determine the mutation type.ResultsThe positive rate of K-ras mutations in pancreatic cancers, other malignant tumors and NMPM were 88.9%, 44.4%, 35.7%. There was significant difference in K-ras gene mutations in FNA samples between pancreatic cancer and other malignant tumors (P=0.013) and NMPM (P=0.001). The sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, accuracy of K-ras mutations in FNA samples of pancreatic cancers were 88.9%, 55.6%, 85.7%, 62.5%, 80.6% when compared with other malignant tumors, and the difference between the two groups was significant (P=0.013);Those were 88.9%, 64.3%, 82.8%, 75.0%, 80.5% when compared with NMPM, and the difference between the two groups was significant (P=0.001). When cytology of FNA samples and K-ras mutations was combined, the positive rate of pancreatic cancer was up to 96.3%.ConclusionsThe detection of K-ras mutations in EUS-FNA samples helped improve the positive diagnostic rate of pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms; K-ras gene; Peptide nucleic acids; Gene diagnosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.05.008

國家自然科學基金(2006BAI02A12)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院消化內(nèi)科

李兆申，Email：lizhaoshen111@yahoo.com.cn