經(jīng)卡介苗活化的負載PANC1裂解產(chǎn)物的樹突狀細胞疫苗體外抗胰腺癌作用

楊德紅 劉文佳 陳敏 吳育美 鄒曉平

·論著·

經(jīng)卡介苗活化的負載PANC1裂解產(chǎn)物的樹突狀細胞疫苗體外抗胰腺癌作用

楊德紅 劉文佳 陳敏 吳育美 鄒曉平

目的探討負載胰腺癌細胞株PANC1裂解產(chǎn)物(tumor lysate,TL)的樹突狀細胞(dendritic cells, DC)經(jīng)卡介苗(CGB)活化后誘導的自體淋巴細胞體外抗胰腺癌效應。方法應用rhGM-CSF和rhIL-4從健康人外周血單個核細胞誘導培養(yǎng)DC,用TL負載DC，并用CGB促其成熟。倒置相差顯微鏡觀察DC形態(tài)，流式細胞儀檢測細胞CD1a、CD83、CD86及HLA-DR表型， ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-12p70含量。CCK-8檢測DC誘導自體混合淋巴細胞的增殖率以及活化淋巴細胞對PANC1、PaTu8988及SCG7901細胞的殺傷率。結(jié)果CGB活化負載TL的DC后，CD83和CD86陽性率分別從(3.7±0.3)%和(38.6±5.0)%顯著增加至(16.5±0.6)%和(76.5±2.5)%(P<0.05)；DC分泌的IL-12p70和TNF-α量分別從(20.18±2.06)pg/ml和(61.38±1.19)pg/ml顯著增加至(62.48±3.80)pg/ml和(592.53±17.96)pg/ml(P<0.01)；DC與自體混合淋巴細胞以1∶100、1∶50、1∶10、1∶5的比例共培養(yǎng)，淋巴細胞增殖率分別從(3.90±1.41)%、(4.07±0.40)%、(3.39±1.05)%、(2.82±0.39)%顯著增加至(55.38±3.58)%、(75.00±2.54)%、(77.07±3.40)%、(99.07±2.40)%(P<0.01)；DC活化淋巴細胞對PANC1細胞的殺傷率在效靶比為1∶5、1∶10、1∶20、1∶50時分別可達(71.73±0.46)%、(49.44±0.98)%、(31.76±2.77)%、(19.03±3.04)%，但對PaTu8988和SCG7901細胞的殺傷率顯著降低。結(jié)論經(jīng)CGB活化的胰腺癌DC疫苗成熟度增加，體外表現(xiàn)出高效特異的抗胰腺癌細胞的效應。

胰腺腫瘤； 樹突細胞； 卡介苗

隨著腫瘤免疫治療的研究進展，承載腫瘤抗原的樹突狀細胞(dendritic cells, DC)疫苗成為治療惡性腫瘤的重要手段。聯(lián)合應用IL-4和GM-CSF培養(yǎng)外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)可誘導出足夠數(shù)量的DC用于臨床治療[1]。DC疫苗治療腫瘤關鍵在于保證DC攝取腫瘤抗原后能夠充分成熟，這樣DC回輸體內(nèi)才能有效激活機體的抗腫瘤免疫反應。為促進DC成熟，可使用免疫佐劑[2]?？ń槊?Calmette-Guerin bacillus，CGB)是其中一種應用較廣的微生物免疫佐劑。本實驗用人胰腺癌細胞株PANC1裂解產(chǎn)物制備DC疫苗，并用CGB進一步促其成熟，觀察DC成熟情況及用DC刺激的自體淋巴細胞對PANC1細胞的殺傷效應。

材料和方法

一、PANC1細胞裂解產(chǎn)物(TL)制備

PANC1胰腺癌細胞株購自上海生命科學院。常規(guī)培養(yǎng)后制成1×107/ml細胞懸液，經(jīng)-80～37℃反復凍融5次，每次10 min后高速離心收集上清液，BCA法測定蛋白含量，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

二、DC體外誘導及自體混合淋巴細胞獲取

健康人外周新鮮白細胞濃縮液(南京市中心血站)用PBS等容積稀釋，采用密度梯度離心法獲取PBMC，進一步用貼壁分離法獲取DC前體細胞和自體混合淋巴細胞。混合淋巴細胞用含rhIL-2(800 μ/ml)的RPMI 1640液培養(yǎng)維持活力。DC前體細胞采用含rhGM-CSF(20 ng/ml)及rhIL-4(10 ng/ml)的RPMI 1640液(DC培養(yǎng)液)培養(yǎng)，第5天的DC為未成熟的DC(imDC)。將imDC分為4組，分別用CGB、TL、CGB+TL及DC培養(yǎng)液(陰性對照)刺激2 d，繼續(xù)用DC培養(yǎng)液培養(yǎng)。為確定CGB最佳刺激劑量，先分別用30、60、90、300、500 μg的CGB刺激相同數(shù)量imDC，2 d后加入FITC標記人CD86單抗孵育，流式細胞儀檢測CD86表型最多的DC組的CGB劑量為最佳刺激劑量。DC功能檢測包括：(1)觀察培養(yǎng)第5、7天DC大小、形態(tài)及集落生長情況；(2)將培養(yǎng)第7天各組DC分別與FITC標記人CD86、CD83、HLA-DR單抗以及PE標記人CD1a單抗共孵后,采用流式細胞儀檢測DC的CD1a、CD83、CD86及HLA-DR表型(重復5次)；(3)ELISA法檢測培養(yǎng)第6天收集的培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-12p70濃度(重復7次)。

三、DC刺激自體混合淋巴細胞的增殖及其對胰腺癌細胞的殺傷效應

在96孔板，將培養(yǎng)第7天各組DC與自體混合淋巴細胞按1∶5、1∶10、1∶50、1∶100的比例共培養(yǎng)4 d，同時設淋巴細胞及DC對照組。應用CCK-8測淋巴細胞活力，按說明書操作，最后測各孔細胞在450 nm波長處A值。按公式計算淋巴細胞增殖率：增殖率=[(實驗組-DC對照組)-淋巴細胞對照組-空白孔]/(淋巴細胞對照組- 空白孔)×100%。

以1∶10共培養(yǎng)的混合淋巴細胞為活化淋巴細胞(效應細胞，E)，以PANC1為靶細胞(T)。按效靶比50∶1、20∶1、10∶1和5∶1共培養(yǎng)于96孔板，同時設單純混合淋巴細胞為對照。培養(yǎng)3 d后應用CCK-8測腫瘤細胞活力，計算淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷率。殺傷率={[靶細胞對照組-(實驗組-效應細胞對照組)]-空白孔}/(靶細胞對照組-空白孔)×100%。同樣以CGB+TL組DC刺激的淋巴細胞與PANC1、PaTu8988、SCG7901細胞不同比例共培養(yǎng)后檢測淋巴細胞對治療細胞的殺傷率。以上實驗均重復6次。

四、統(tǒng)計學方法

結(jié) 果

一、DC形態(tài)變化和DC表型測定

DC培養(yǎng)第5天形成明顯的簇狀細胞集落,懸浮或半懸浮。加入各組刺激后培養(yǎng)至第7天，可見CGB及CGB+TL組DC集落逐步散開，呈均勻散在分布，胞體明顯增大,形狀不規(guī)則,胞質(zhì)豐富、透亮，表面有粗大樹突狀突起，為典型DC形態(tài)，而TL及陰性對照組DC形態(tài)較培養(yǎng)至第5天變化不明顯(圖1)。CGB的刺激劑量以90 μg時最佳(圖2)。與陰性對照組比較，單純TL刺激不增加CD83表型數(shù)量，甚至減少CD86表型數(shù)(P<0.05)。但CGB及CGB+TL組CD83及CD86表型數(shù)較TL組顯著增加(P<0.01)，且CGB+TL組的增加較CGB組更顯著(P<0.05)。而各組CD1a及HLA-DR表型無顯著差異(表1)。

圖1CGB刺激2 d后培養(yǎng)第5天(a, ×200)和第7天的CGB組(b)、CGB+TL組(c)、TL組(d)和陰性對照組(e)的DC形態(tài)(b～e， ×400)

組別例數(shù)CD1aCD83CD86HLA-DR陰性對照組529.7±1.23.7±0.338.6±5.098.1±0.4TL組529.9±1.25.2±0.2a32.9±2.2a98.2±0.4CGB組528.8±0.811.5±1.1abc76.6±2.4ab98.5±0.2TL+CGB組528.3±0.716.5±0.6abc76.5±2.5ab98.6±0.4

注：與陰性對照組比較，aP<0.05；與TL組比較，bP<0.01；與CGB組比較，cP<0.05

二、DC的IL-12p70和TNF-α分泌量的變化

陰性對照組、TL組、CGB組和CGB+TL組培養(yǎng)上清中IL-12p70含量分別為(20.18±2.06)pg/ml、(19.47±4.63)pg/ml、(59.18±2.88)pg/ml、(62.48±3.80)pg/ml；TNF-α含量為(61.38±1.19)pg/ml、(63.32±1.77)pg/ml、(498.23±13.29)pg/ml、(592.53±17.96)pg/ml。TL組與陰性對照組間無顯著差異。但CGB組和CGB+TL組培養(yǎng)上清的IL-12p70和TNF-α含量均較TL組明顯增加(P<0.01)，且CGB+TL組的TNF-α含量又較CGB組增加(P<0.05)。

三、DC對自體混合淋巴細胞增殖的影響

與陰性對照組比較，TL組的DC可顯著增加淋巴細胞增殖率(P<0.01)，CGB組及CGB+TL組DC對自體混合淋巴細胞增殖率的影響又顯著高于TL組DC(圖3，P<0.01)。

四、DC活化的淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷效應

未活化淋巴細胞(L)、陰性對照組(陰性對照-DC-L)及TL組DC活化的淋巴細胞(TL-DC-L)幾乎不能殺傷PANC1細胞，CGB組DC活化的淋巴細胞(CGB-DC-L)較前3組有明顯殺傷率，CGB+TL組DC活化淋巴細胞(CGB+TL-DC-L)則具有更高的殺傷率(表2，P值均<0.01)。雖然CGB+TL-DC-L對PANC1細胞有很高的殺傷率，但對PaTu8988和SCG7901殺傷率顯著降低(表2，P<0.01)。

圖3各組DC與自體混合淋巴細胞以不同比例共培養(yǎng)后的淋巴細胞增殖率

討 論

DC是體內(nèi)功能最強的專職APC,而腫瘤患者體內(nèi)腫瘤細胞常能逃脫機體免疫監(jiān)視，其中主要一個原因是DC數(shù)量明顯減少，且處于免疫耐受狀態(tài)[3]。因此DC疫苗治療腫瘤需解決兩個關鍵問題：一是能夠獲取足夠數(shù)量的DC；二是獲取的DC能激活抗腫瘤免疫反應。本實驗用經(jīng)典細胞因子誘導法培養(yǎng)的DC，CD1a陽性率近30%，并呈典型樹突形態(tài)，表明細胞因子誘導可獲得數(shù)量可觀的DC。因未成熟DC(imDC) 低表達MHC分子及共刺激分子，可誘導免疫耐受，而成熟DC(mDC)高表達MHC分子及共刺激分子，誘導免疫激活[4]，所以DC的成熟度是影響DC效能的關鍵因素。單純腫瘤抗原并不能促進DC成熟，本實驗結(jié)果也如此，故需要免疫佐劑。

CGB是一種應用較廣的微生物免疫佐劑。Kim等[5]研究證實，CGB活菌與imDC相互作用后能顯著上調(diào)CD83、CD80、CD86及HLA-DR的表達。本結(jié)果也顯示，經(jīng)CGB進一步修飾后CD83及CD86表型的DC顯著增加，表明DC明顯成熟。

表2 各組DC活化的淋巴細胞對腫瘤細胞株的殺傷率

注：與TL-DC-L組比較，aP<0.01；與PANC1細胞組比較，bP<0.01

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α在DC成熟過程中有重要作用。用GM-CSF和IL-4刺激培養(yǎng)人外周血PBMC，于第7天加入TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)至第14天，與未加入TNF-α比較，DC表面CD83、CD80和CD86表達增強[6]。去血清培養(yǎng)mDC可使其產(chǎn)生大量活性氧中間產(chǎn)物而誘導自身凋亡，TNF-α可阻斷這一過程[7]。本實驗結(jié)果顯示，CGB促進DC分泌大量TNF-α，提示CGB促進DC表型成熟可能與自身分泌TNF-α有關。但Kim等[5]發(fā)現(xiàn)中和CGB刺激的DC培養(yǎng)上清中的TNF-α，不能使CD83表達下降，得出CGB直接促DC成熟。因此CGB促進DC成熟是否與TNF-α分泌有關還需進一步實驗驗證。

抗腫瘤免疫反應主要為細胞免疫，主要效應細胞是CD8+細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，其發(fā)揮免疫殺傷功能需CD4+輔助性T細胞(T helper，Th)的調(diào)節(jié)。Th細胞可分為Th0、Th1、Th2三種類型，其中Th1激活并增強CTL的殺傷功能，形成激活型Th1反應；相反Th2抑制CTL活性，形成抑制型Th2反應。Th1、Th2由Th0 分化而來[8-9]。DC作用T淋巴細胞時分泌的細胞因子，即構(gòu)成Th0細胞所在細胞因子微環(huán)境，可顯著影響Th0細胞分化方向,其中IL-12p70使Th0顯著向Th1分化，成為產(chǎn)生Th1優(yōu)勢的關鍵細胞因子[10]。本實驗結(jié)果顯示，CGB+TL能明顯提高DC上清IL-12p70的濃度，從而增加向Th1的分化。

此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)：(1)單獨CGB也能促進DC成熟，該組DC活化的淋巴細胞對PANC1細胞也有一定殺傷能力?？紤]其原因為DC攝取CGB非特異性抗原后激活混合淋巴細胞中的NK細胞，可非特異殺傷腫瘤細胞[11]；CGB可誘導DC表達TRAIL[12]，后者與胰腺癌細胞表面的TRAIL受體結(jié)合后可導致腫瘤細胞凋亡[13]。(2)單純TL致敏DC不能促進DC成熟，但可以輕度刺激淋巴細胞增殖，然而誘導的淋巴細胞對腫瘤細胞幾乎無殺傷力。這可能是PANC1裂解產(chǎn)物中的自身抗原成分作用DC，使其誘導調(diào)節(jié)性T細胞及無反應性T細胞增生，從而引起免疫耐受[14]，導致不能殺傷腫瘤細胞。(3)負載PANC1 TL的DC僅對PANC1細胞具有高的殺傷率，顯示其抗腫瘤細胞的特異性。

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2010-03-25)

(本文編輯：呂芳萍)

Invitroanti-tumoreffectofautologousmixedlymphocyteprimedbyBCGactivateddendriticcellsbasedPANC1lysate

YANGDe-hong,LIUWen-jia,CHENMin,WUYu-mei,ZOUXiao-ping.

DepartmentofGastroenterology,DrumTowerHospital,MedicalSchool,NanjingUniversity,Nanjing210008,China

ZOUXiao-ping,Email：zouxiaoping795@hotmail.com

ObjectiveTo evaluate in vitro anti tumor effect of host lymphocyte primed by Calmette-Guerin bacillus (CGB) activated dendritic cells (DC) based PANC1 lysate.MethodsDCs were obtained from peripheral blood mononuclear cells of healthy volunteer and cuitured by rhGM CSF and rhIL 4. DC vaccines for pancreatic cancer were loaded with PANC1 tumor lysate (TL) and were further maturated by CGB. CD1a, CD83, CD86and HLA-DR phenotype was characterized by flow cytometer, and IL-12p70 and TNF-α concentration in DC culture supernatant were measured by ELISA. Autologous mixed lymphocyte proliferation and the cytotoxicity of cytotoxic T lymphocytes primed by activated DCs to PANC1, PaTu8988 and SCG7901 tumor cells was measured by CCK 8 test.ResultsWhen DCs based PANC1 lysate were activated by CGB, the expression rates of CD83and CD86were increased from (3.7±0.3)% and (38.6±5.0)% to (16.5±0.6)% and (76.6±2.5)% (P<0.05). The concentrations of cytokines ILp12p70 and TNF-α were increased from (20.18±2.06)pg/ml and (61.38±1.19)pg/ml to (62.48±3.80)pg/ml and (592.53±17.96)pg/ml (P<0.01). When co-cultured with CGB activated DCs based PANC1 lysate in proportion of 1∶100,1∶50,1∶10 and 1∶5, the proliferation rate of the lymphocytes from (3.90±1.41)%,(4.07±0.40)%, (3.39±1.05)%, (2.82±0.39)% significantly increased to (55.38±3.58)%, (75.0±2.54)%, (77.07±3.4)%, (99.07±2.4)% (P<0.01), respectively. The killing effects of lymphocytes stimulated by DCs at E/T of 1∶5, 1∶10, 1∶20, 1∶50 were (71.73±0.46)%, (49.44±0.98)%, (31.76±2.77)%, (19.03±3.04)%; but the killing effects on PaTu8988 and SCG7901 were significantly decreased.ConclusionsDC vaccines for pancreatic cancer could be more maturated when activated by CGB, and could show a high capability of anti-tumor in vitro.

Pancreatic neoplasms; Dendritic cells; CGB vaccine

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.04.014

210008 南京，南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化科

鄒曉平，Email：zouxiaoping795@hotmail.com