甲型流感病毒M2e與人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中的分泌表達

牟旭鵬 韋安慧 申茉函 孔 寧 顏煒群 (吉林大學藥學院,吉林 長春 130021)

甲型流感病毒M2e與人血清白蛋白融合蛋白在畢赤酵母中的分泌表達

牟旭鵬 韋安慧 申茉函 孔 寧 顏煒群 (吉林大學藥學院,吉林 長春 130021)

目的 將甲型流感病毒M2蛋白胞外區(qū)(M2e)基因與人血清白蛋白 (HSA)基因融合,以構建高效分泌表達的畢赤酵母菌株。方法

通過 RT-PCR擴增 HSA基因,構建 pPICZα-HSA質粒,將人工合成的M2e序列與 pPICZα-HSA質粒分別經(jīng)BstB I和 KpnI酶切消化后連接,構建真核表達載體 pPICZα-HSA/M2e,線性化后電轉化畢赤酵母 X-33。用 PCR法篩選 Zeocin抗性陽性的克隆,SDS-PAGE和Western印跡法篩選高表達 HSA/M2e菌株。結果 經(jīng) RT-PCR法克隆的 HSA基因序列與 GenBank登錄的 cDNA序列一致,構建的 pPI CZα-HSA/M2e真核表達載體,經(jīng)電轉化獲得Zeocin抗性陽性的克隆。SDS-PAGE和Western印跡分析證實了甲醇誘導的培養(yǎng)基上清中含有 HSA/M2e,分子量約為 68 kD。結論 成功構建了分泌表達重組 HSA/M2e融合蛋白的畢赤酵母菌株,為進一步研究其生物學活性奠定了基礎。

甲型流感病毒;M2e;血清白蛋白;畢赤酵母

M2蛋白是流感病毒主要的膜蛋白之一,由流感病毒基因組第 7節(jié)段編碼,長 97個氨基酸,N末端 24個氨基酸殘基暴露在胞膜外,C端的 54個氨基酸定位于胞漿中,中間 19個氨基酸殘基跨過脂質雙分子層。研究發(fā)現(xiàn)M2蛋白的單克隆抗體具有在細胞培養(yǎng)中抑制病毒復制的功能〔1〕,進一步證明M2蛋白胞外功能區(qū) (extracellular domain ofM2 protein,M2e)誘生的抗體同樣具有保護性〔2〕。由于目前在人群中流行的所有甲型流感病毒,其M2e都未發(fā)現(xiàn)存在明顯差異,認為M2e在流感病毒株間是高度保守的〔3〕。因此,M2e蛋白被認為是可刺激機體產(chǎn)生對不同流感變異株都具有交叉保護效果的保護性抗原。本研究旨在構建 HSA/M2e的真核表達質粒,將M2e與 HSA在畢赤酵母中進行融合表達,為進一步研究M2e蛋白疫苗的免疫效果,開發(fā)和應用具有交叉保護能力的長效廣譜疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

表達載體 pPICZα及畢赤酵母菌株 X-33購自 Invitrogen公司;Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等購自 TaKaRa公司;瓊脂糖 DNA回收試劑盒、質粒提取和純化試劑盒以及大腸桿菌 XL1-Blue購自北京鼎國生物技術公司;引物由上海生物工程公司合成;小鼠抗人血清白蛋白單克隆抗體購自博奧森公司,辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠抗體購自北京鼎國生物技術公司。

主要儀器：PCR儀、孵箱、搖床為 Forma公司產(chǎn)品;電穿孔儀MicroPulser購自 B IO-RAD公司;DNA測序儀為 Beckman公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA的提取和 RT-PCR 用 Trizol法從新鮮分離的胚胎肝組織中提取總 RNA,采用逆轉錄試劑盒和設計的引物(上游引物 ：5′-CAGGAATTCGGCACAATGAGTGGGT-3′,下游引物 ：5′-GCGCTCGAGGTAGATGTTATAAGCCT-3′),以 RT-PCR法擴增 HSA cDNA片段。反應產(chǎn)物做 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 HSA cDNA的克隆及測序 擴增的特異性片段進行回收和純化后,連接于 pMD18-T載體上,將重組質粒 pMD18-THSA轉化大腸桿菌 XL1-Blue,通過α-互補的藍白篩選挑選重組子。經(jīng)酶切電泳鑒定后,選出重組質粒進行測序。

1.2.3 pPICZα-HSA載體的構建 將測序正確的 pMD18-THSA重組質粒進行 PCR(上游引物 5′-GCGTTCGAAATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCC-3′含 BstB I酶切位點 ;下游引物 ：5′-GTCGGTACCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGAC-3′含 KpnI酶 切位點),PCR擴增產(chǎn)物與質粒 pPICZα分別經(jīng) BstB I和 KpnI酶切消化,用 T4 DNA連接酶連接過夜。連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌XL1-Blue,以含 Zeocin(25μg/ml)的平板篩選轉化子,提取質粒,限制酶切鑒定重組質粒。

1.2.4 pPICZα-HSA/M2e表達載體的構建 將人工合成的M2e序列與 pPI CZα-HSA質粒分別經(jīng) Eco81I和 KpnI酶消化并經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳回收特異片段,用 T4 DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌 XL1-Blue,挑取轉化子提取質粒,限制酶切鑒定重組質粒并進行測序。

1.2.5 pPICZα-HSA/M2e轉化畢赤酵母 X-33 用 PmeI線性化 pPI CZα-HSA/M2e,通過電轉化的方法導入酵母 X-33菌株的感受態(tài)細胞。具體操作程序按 Pichia Expression Kit提供的方法。取 50～100μl轉化后的菌液涂布于含 Zeocin(100μg/ml)的 YPD培養(yǎng)板,于 30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng) 2～3 d,觀察轉化子的生長。

1.2.6 酵母工程菌的誘導表達 從轉化菌的 YPD板上挑取10個克隆分別接種于 10 ml BMGY培養(yǎng)基中,30℃震蕩培養(yǎng)(225 r/min)24 h,至 OD600達 2～6。室溫離心 (3 000 r/min)5 min,棄上清。用等體積 (10 ml)BMMY重懸細胞沉淀,30℃震蕩培養(yǎng),誘導表達。在誘導過程中,每 24 h補充 1次甲醇至終濃度 0.5%,同時補充滅菌超純水,使發(fā)酵液總體積保持不變。連續(xù)誘導培養(yǎng) 7 d,每 24 h取 1 ml發(fā)酵液,離心,將菌體沉淀提取基因組 DNA做 PCR鑒定,上清進行 SDS-PAGE及Western印跡分析。

1.2.7 表達產(chǎn)物的Western印跡分析 PCR鑒定陽性的單克隆菌株,誘導 72 h后取培養(yǎng)液上清作 SDS-PAGE電泳 (5%的濃縮膠,10%的分離膠),電泳結束取出凝膠,200 mA恒流 1.5 h,將蛋白印跡于硝酸纖維素濾膜。用兔抗人血清白蛋白單克隆抗體為一抗,辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體為二抗,DAB為顯色底物進行Western印跡分析。

2 結 果

2.1 RT-PCR擴增 cDNA

經(jīng) 1%的瓊脂糖凝膠電泳分析表明,以肝組織 RNA為模板,經(jīng) RT-PCR法克隆到約 1 860 bp的基因片段,DNA測序結果證實所得基因序列與 GenBank登錄的HSA cDNA序列完全一致。見圖 1。

2.2 重組載體 pMD18-T-HSA的酶切鑒定

取重組質粒pMD18-T-HSA用 PstI進行雙酶切,得到約 700 bp的片段。見圖2。

圖 1 HSA RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

圖 2 重組質粒 pMD18-T-HSA酶切鑒定圖譜

2.3 pPI CZα-HSA及 pPI CZα-HSA/M2e載體的酶切鑒定

將pPICZα-HSA及 pPICZα-HSA/M2e重組質粒用 XbaI進行雙酶切消化,分別得到約 700 bp及 793 bp大小的片段。見圖 3。

圖 3 重組質粒 pPICZα-HSA及pPI CZα-HSA/M2e酶切鑒定圖譜

2.4 HSA/M2e在畢赤酵母中的表達及鑒定

提取的酵母基因組 DNA經(jīng) PCR擴增到約 2 000 bp的片段,而對照無此條帶,表明 HSA/M2e基因已整合入酵母基因組中。見圖 4。將 PCR鑒定陽性的酵母菌誘導表達 7 d后取上清進行 SDS-PAGE分析,結果顯示,陽性酵母菌在 68 kD附近有目的條帶出現(xiàn)。見圖 5。Western印跡分析顯示在甲醇誘導表達的上清中產(chǎn)生特異性條帶,表明該蛋白為 HSA/M2e。見圖 6。

圖 4 酵母基因組DNA PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析

圖 5 HSA/M2e的 SDS-PAGE分析

圖 6 HSA/M2e的W estern印跡分析

3 討 論

M2蛋白是一種非糖基化的蛋白,其生物活性形式為四分子M2蛋白亞基依靠二硫鍵構成一個同源四聚體〔4〕。雖然 M2蛋白在病毒粒子內(nèi)表達很少,平均每個病毒粒子大約含有 14～60個M2蛋白分子,但在被流感病毒感染的細胞表面可高效表達M2蛋白〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)用合成的 M2e多肽經(jīng)滴鼻接種小鼠后,也能誘導小鼠產(chǎn)生很明顯的流感病毒抵抗力〔6〕,更重要的是M2e蛋白誘導的保護性免疫是廣譜的,因此M2e被認為是具有交叉保護能力疫苗的最佳候選。

人血清白蛋白是由 585個氨基酸殘基組成的單鏈非糖基化的球形蛋白質,其本身即為許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體,藥物和 HSA結合后,可以減少其生物利用度,同時增加在體內(nèi)的半衰期,從而可以提高療效〔7〕。同時 HSA在畢赤酵母中可以高效分泌表達,且上清雜蛋白含量較少,純化方便,因此更容易實現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)。

本文通過 RT-PCR法擴增 HSA基因,構建 pPICZα-HSA/M2e真核表達載體,并對轉化 pPI CZα-HSA/M2e重組質粒的畢赤酵母分泌表達產(chǎn)物進行檢測。結果表明,HSA/M2e能夠在畢赤酵母菌中實現(xiàn)較高表達,分子量約為 68 kD,為今后開展基因工程疫苗以及通用疫苗的進一步研究打下了基礎。

1 Zebedee SL,Lamb RA.Influenza A virusM2 protein;monoclonal antibody restriction of virus growth and detection ofM2 in virions〔J〕.J Virol,1988;62(8)：2762-72.

2 Neirynck S,Deroo T,Saelens X,et al.A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of theM2 protein〔J〕.NatMed,1999;5(10)：1157-63.

3 LiuWL,Zou P,Ding J,et al.Sequence comparison between the extracellular domain ofM2 protein human and avian influenza A virus provides new information for bivalent influenza vaccine design〔J〕.Microbes Infect,2005;7(2)：1171-7.

4 Sakaguchi T,Tu Q,Pinto LH,et al.The active aligomeric state of the minimalistic influenza virusM2 ion channel is a tetramer〔J〕.Proc Natl Acad SciUSA,1997;94(5)：5000-4.

5 Lamb RA,Zebedee SL,Richardson CD.Influenza virusM2 protein is an integral membrane protein expressed on the infected-cell surface〔J〕.Cell,1985;40(3)：627-33.

6 Mozdzanowska K,Feng JQ,EidM,et al.Induction of influenza type A virus specific resistance by immunization of mice with a synthetic multiple antigenic peptide vaccine that contains ectodomains of matrix protein 2〔J〕.Vaccine,2003;21(20)：2616-26.

7 Zhao HL,Xue C,Wang Y,et al.Circumventing the heterogeneity and instability of human serum albumin-interferon-α2b fusion protein by altering its orientation〔J〕.J Biotechnol,2007;131(3)：245-52.

Secretory expression of HSA/M2e fusion protein in pichia pastoris

M U Xu-Peng,W EIAn-Hui,SHENM o-Han,et al.
School of Pharmaceutical Sciences of Jilin Un iversity,Changchun 130021,Jilin,China

Objective To fuse the gene ofM2e with that of HSA in order to construct a P.pastoris yeast strain with high-efficient expression of HSA/M2e.M ethods The gene of HSA was amplified by RT-PCR and the plasmid of pPI CZα-HSA was constructed.M2e artificial synthesized was digested with Eco81I and KpnI,then ligated to the same sites of pPICZα-HSA and obtained the expression vector pPICZα-HSA/M2e.The recombinant vectorwas linearized and introduced into P.pastoris X-33 by electroporation.Pichia pastoris secreting HSA/M2e were obtained to extract genomic DNA of transfor med X-33 and perfor m PCR.SDS-PAGE and Western blot was used to screen high expressed that HSA/M2e engineering bacteria and to identify HSA/M2e in culture supernatant induced bymethanol.Results The sequence of HSA obtained by RT-PCR was identicalwith that published on GenBank.Recombinant expression vector was constructed.SDSPAGE andWestern blot analysis showed that HSA/M2e was successfully expressed in the culture medium with an apparentmolecularweight of 68 kD.Conclusions Pichia pastoris yeast strain with high-efficient expression of HSA/M2e is successfully constructed,providing a basis for further study of its bioactivity.

Influenza A virus;M2e;Human serum albumin;Pichia pastoris

R373;Q78

A

〕 1005-9202(2010)05-0617-03

國家高技術發(fā)展計劃 (863計劃)項目資助課題

(2004AA205020)

顏煒群 (1958-),男,教授,主要從事生物工程學和再生醫(yī)學研究。

牟旭鵬 (1980-),男,在讀博士,主要從事醫(yī)學生物工程研究。

〔2009-11-18收稿 2009-12-10修回〕

(編輯 張永貴 /胡國義)