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    免疫組化法檢測大鼠肝臟組織中的乙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒

    2010-11-18 06:29:22佘銳萍夏抗抗李文貴韓德平
    中國動物檢疫 2010年9期
    關(guān)鍵詞:乙肝病毒肝炎肝細(xì)胞

    于 品,佘銳萍,夏抗抗,李文貴,丁 葉,岳 卓,韓德平

    (中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京100193)

    乙型肝炎是一種廣泛流行、嚴(yán)重危害人類健康的病毒性傳染病,其病原為乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)。乙肝病毒屬于嗜肝病毒科(hepadnaviridae),正嗜肝病毒屬(Orthohepadnavirus)的一員。全球范圍內(nèi)約有3.5億乙型肝炎感染者,每年有近100萬人死于由乙型肝炎引起的慢性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌[1-2]。而在中國,普通人群中大約有10%攜帶HBsAg,有些地區(qū)人乙型肝炎的感染率已達(dá)50%以上,在某些人群中甚至高達(dá)79%,HBV感染是肝硬化與肝癌的形成和發(fā)展重要原因之一,HBV感染成為了我國重癥肝炎的主要原因,病死率高達(dá) 80%[3]。Brumberg(1965)首次發(fā)現(xiàn)澳大利亞土著人血清中的抗原(澳抗),1968年證實(shí)該抗原與肝炎有關(guān),現(xiàn)稱之為乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。此后免疫電鏡用于澳抗的檢查,觀察到病毒顆粒,Dane(1970)報(bào)道了完整的HBV顆粒。近幾年來,陸續(xù)有從豬,牛,羊,雞,鴨,野生鼠類等動物體內(nèi)檢出人乙型肝炎病毒相關(guān)抗原的研究報(bào)道[4-8],并由此懷疑乙型肝炎是一種人畜共患病。

    戊型肝炎(Hepatitis E)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的一種急性病毒性肝炎。其主要流行于亞洲,非洲和拉丁美洲的發(fā)展中國家[9],在美國和歐洲的一些國家也出現(xiàn)過地方性流行[10]。在普通人群中,戊型肝炎的死亡率不到1%,但其對孕婦的致死率卻高達(dá)28%[11],極大地危害著人類的健康。Meng等2003年首次在豬血清中分離到豬戊型肝炎病毒(SHEV)野毒株[12],又有人從雞、貓、狗、牛、羊和嚙齒類動物體內(nèi)檢測到HEV抗體陽性[13-19],王英華等(2008)在屠宰豬肝中檢出HEV,其結(jié)果從HEV蛋白和基因兩個(gè)角度都證明了屠宰豬肝臟中HEV的存在,并且證明豬的HEV與人的HEV有很大的相關(guān)性[20]。Li等2009年報(bào)道,在北京地區(qū)不同的養(yǎng)殖條件下,屠宰豬HEV血清陽性率高達(dá)到76.6%-90%,其與人源毒株HEV的同源性在96%以上[21]。HEV已經(jīng)作為了一種重要的人畜共患病受到了人們的重視。

    SD大鼠作為一種常用的實(shí)驗(yàn)動物,其病原的控制不僅關(guān)系到相關(guān)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,而且會影響到實(shí)驗(yàn)人員等暴露人群的健康。而SD大鼠HBV和HEV的感染情況并未見有報(bào)道,本研究通過對53例SD大鼠肝臟進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色、HE染色和Mallory三色染色,統(tǒng)計(jì)SD大鼠肝臟內(nèi)乙型肝炎和戊型肝炎相關(guān)抗原的陽性率,以及乙肝病毒和戊肝病毒感染對肝臟造成的病理損傷等,初步了解SD大鼠肝臟內(nèi)HBV和HEV感染情況,為進(jìn)一步揭示人類乙型肝炎和戊型肝炎的發(fā)病機(jī)理提供基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 購自某實(shí)驗(yàn)動物中心,共計(jì)53只21日齡清潔級SD大鼠。

    1.1.2 試劑 兔抗人乙肝病毒核心抗原(HBcAg)多克隆抗體,鼠抗人乙肝病毒表面抗原(HBsAg)單克隆抗體,兔抗人HEV單克隆抗體,SP免疫組化染色試劑盒,均購自北京中山金橋生物制品公司。

    1.2 方法

    1.2.1 樣品處理 SD大鼠經(jīng)頸靜脈放血處死,無菌采集其肝臟(約1 cm×1 cm×2 cm)樣本,用2.5%多聚甲醛-戊二醛混合固定液固定。

    1.2.2 切片制作 固定好的肝組織經(jīng)修塊、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋,然后制作5張厚4μm的連續(xù)切片,備用。

    1.2.3 免疫組化染色 切片經(jīng)二甲苯脫蠟后,用PBS沖洗5 min×3次;3%H2O2室溫孵育10 min;蒸餾水沖洗,PBS浸泡5 min×3次;正常牛血清白蛋白工作液封閉15 min,傾去血清,滴加一抗工作液,37℃孵育2 h;PBS沖洗5 min×3次,滴加生物素標(biāo)記二抗工作液,37℃孵育30 min;PBS沖洗5 min×3次,滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液,37℃孵育 30 min;PBS沖洗 5 min×3次,DAB顯色液顯色;用蘇木素襯染后,按常規(guī)石蠟切片制作方法脫水、封片后,顯微鏡下觀察。

    1.2.4 蘇木素-伊紅(HE)染色和Mallory三色染色法 對 HBcAg、HBsAg和HEV免疫組化檢測結(jié)果呈陽性反應(yīng)的肝臟再進(jìn)行HE染色和Mallory三色染色,觀察其組織病理學(xué)變化。

    1.2.5 免疫組化染色結(jié)果判定 鏡下肝組織中乙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒相關(guān)抗原陽性信號呈現(xiàn)棕紅色或棕黃色顆?;驁F(tuán)塊狀。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 肝臟中HBcAg、HBsAg免疫組化檢測結(jié)果

    53例SD大鼠肝臟中HBcAg、HBsAg免疫組化檢測結(jié)果見下表1和表2。由表1可見,在被檢的53例SD大鼠肝臟中,檢出了HBcAg、HB-sAg雙陽性的有34例,占被檢樣品總數(shù)的66.15%;HBsAg陽性但HBcAg呈陰性的有13例,占總數(shù)的24.53%;HBcAg陽性但HBsAg為陰性的有4例,占總數(shù)的7.55%;HBcAg、HBsAg雙陰性的有2例,占總數(shù)的3.77%。由表2可見,在被檢的53例SD大鼠肝臟中,有47例呈HBsAg陽性反應(yīng),陽性率為88.68%;有38例呈HBcAg陽性反應(yīng),陽性率為71.70%。這表明,在53例SD大鼠肝臟中乙型肝炎病毒抗原的總檢出率高達(dá)96.23%。

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    2.2 HBV抗原在肝臟中的定位

    顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)HBcAg免疫組化陽性反應(yīng)物主要分布在肝被膜下和肝小葉中央靜脈周圍肝細(xì)胞內(nèi)。以核漿混合型(95%)為主(圖 1,A),其次為胞核型(5%)(圖 1,B),各例肝臟肝細(xì)胞內(nèi)的HBcAg免疫組化陽性反應(yīng)物強(qiáng)度不一。

    HBsAg免疫組化陽性反應(yīng)物主要分布在肝被膜下和肝小葉中央?yún)^(qū)的靜脈周圍肝細(xì)胞內(nèi)。以胞核胞漿胞膜型(68.09%)為主(圖 1,C),其次為胞核胞膜型(31.91%)(圖 1,D),各例肝臟肝細(xì)胞內(nèi)的HBsAg免疫組化陽性反應(yīng)物強(qiáng)度不一。在不加一抗的陰性染色對照片中未見任何棕紅色陽性反應(yīng)信號(圖 1,I)。

    2.3 肝臟中HEV免疫組化檢測結(jié)果

    53例SD大鼠肝臟中HEV免疫組化檢測結(jié)果見下表3。由表3可見,在被檢的53例SD大鼠肝臟中,檢出了HEV陽性的有53例,占被檢樣品總數(shù)的100%。

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    2.4 HEV抗原在肝臟中的定位

    顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)HEV免疫組化陽性反應(yīng)物主要分布在肝被膜下和肝小葉中央靜脈周圍肝細(xì)胞內(nèi)。以核漿膽管混合型(81.13%)為主(圖1,E、G、H),其次為胞核膽管混合型(8%)(圖 1,F(xiàn)),另外胞核型和膽管型各占1.89%,各例肝臟肝細(xì)胞內(nèi)的HEV免疫組化陽性反應(yīng)物強(qiáng)度不一。在不加一抗的陰性染色對照片中未見任何棕紅色陽性反應(yīng)信號(圖1,I)。

    2.5 HE染色結(jié)果

    光鏡觀察發(fā)現(xiàn),免疫組化陽性反應(yīng)的肝臟組織均有不同程度的病理變化。主要表現(xiàn)有:肝細(xì)胞變性,局灶性或散在單個(gè)性壞死(圖 2,B、E);有的肝小葉中央靜脈淤血(圖2,E);常見肝小葉間或小葉內(nèi)淋巴細(xì)胞彌散性或局灶性浸潤(圖2,A);有的可見小葉間膽管增生(圖 2,C、D、E),并常見有纖維結(jié)締組織增生現(xiàn)象(圖2,D、F)。

    統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)在免疫組化陽性的肝臟樣品中,有35%的肝組織中見有淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤;33%的肝臟出現(xiàn)了肝細(xì)胞變性、壞死;17%的肝臟肝細(xì)胞發(fā)生萎縮病變;41%的肝臟匯管區(qū)膽管增生;22%的肝組織中纖維結(jié)締組織增生。說明HBV和HEV感染對大鼠的肝臟造成了明顯的損傷作用。

    2.6 Mallory三色染色法結(jié)果

    在免疫組化陽性反應(yīng)的SD大鼠肝臟中,鏡檢發(fā)現(xiàn)22%(12/53)的肝組織中有纖維結(jié)締組織增生,并且發(fā)現(xiàn)在有些病變比較嚴(yán)重的肝臟中,纖維組織已伸入肝小葉內(nèi),有的肝血竇的網(wǎng)狀纖維有膠原化的趨勢,說明這些SD大鼠肝臟的炎癥已轉(zhuǎn)為慢性。

    3 討論

    肝臟作為動物機(jī)體內(nèi)最大的腺體,具有生物轉(zhuǎn)化、分泌和排泄等多種生物化學(xué)功能,是多種物質(zhì)代謝的中樞。肝臟獨(dú)特的雙重血液供應(yīng),使得肝細(xì)胞可以從肝動脈中獲得充足的氧及代謝物,并且又可以從門靜脈中獲取大量由腸道吸收的各種營養(yǎng)物質(zhì),為肝臟的各種物質(zhì)代謝提供了基礎(chǔ)。肝臟還具有雙重的輸出通道,肝靜脈可以將肝內(nèi)的代謝產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)狡渌M織利用或排除,同時(shí)膽道系統(tǒng)將肝分泌的膽汁及代謝廢物排入腸道。另外,肝組織中還存在多種免疫細(xì)胞,其中包括肝巨噬細(xì)胞(庫普弗細(xì)胞)、大顆粒淋巴細(xì)胞、肝樹突狀細(xì)胞等,這些細(xì)胞能夠捕獲和呈遞血液中的病原微生物及其代謝產(chǎn)物,使肝臟在抗感染免疫中發(fā)揮一定的作用。如此重要的器官,其結(jié)構(gòu)和功能正常與否關(guān)系到整個(gè)機(jī)體的健康狀態(tài),病毒性肝炎是威脅肝臟功能的重要因素之一,嚴(yán)重地威脅著人類和動物的健康,人類病毒性肝炎的蔓延如此之快,可能與動物病毒性肝炎感染情況有關(guān),尤其是家畜、家禽可能在病毒性肝炎的傳播中起到了不可小視的作用。

    自從 Brumberg(1965)首次發(fā)現(xiàn)澳抗,Dane(1970)報(bào)道了完整的HBV顆粒以來,近幾年來,陸續(xù)有從豬,牛,羊,雞,鴨,野生鼠類等動物體內(nèi)檢出人乙型肝炎病毒相關(guān)抗原的研究報(bào)道[1-5],并懷疑乙型肝炎是一種人畜共患病,乙型肝炎是一種世界性的傳染病,是肝硬化和肝癌發(fā)病的重要誘因,其公共衛(wèi)生學(xué)意義也越來越引起人們的重視。

    戊型肝炎已經(jīng)被公認(rèn)是一種人畜共患病,Emerson(2003)報(bào)道豬是戊型肝炎病毒最主要的動物貯存宿主[22],近年來,在牛、羊、雞、犬等畜禽及野生動物中也檢測到抗HEV抗體或HEV RNA[23],動物病毒株是引起人散發(fā)性戊型肝炎的主要病原。

    對于SD大鼠感染HBV和HEV的情況,目前未見報(bào)道,本研究首次采用免疫組化的方法在SD大鼠的肝組織中顯現(xiàn)并定位了人乙肝病毒和戊肝病毒相關(guān)抗原。本研究檢測的53例SD大鼠肝臟中人乙肝病毒抗原的總檢出率達(dá)96.23%,人戊肝病毒抗原的檢出率高達(dá)100%,鏡下顯示,位于肝被膜附近的肝細(xì)胞中,乙型肝炎和戊型肝炎相關(guān)抗原陽性信號主要分布于肝細(xì)胞核中,呈散在分布,而遠(yuǎn)離被膜的肝細(xì)胞胞漿和部分胞核可見陽性信號,胞漿中多呈成片分布,這可能與HBV和HEV感染階段不同,病毒存在的部位不同有關(guān)。所有肝組織的匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞均呈陽性反應(yīng),表明HEV可能是通過膽汁的分泌而進(jìn)入腸道的。這與報(bào)道的豬等動物戊型肝炎病毒抗原分布情況基本一致。組織形態(tài)學(xué)觀察表明,免疫組化陽性的肝臟HE染色切片都具有典型的病毒性肝炎的病變特征:35%的肝組織中見有淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤;33%的肝臟出現(xiàn)了肝細(xì)胞變性、壞死;17%的肝臟肝細(xì)胞發(fā)生萎縮病變;41%的肝臟匯管區(qū)膽管增生;22%的肝組織中纖維結(jié)締組織增生,并常見有不同程度的纖維結(jié)締組織增生現(xiàn)象;Mallory三色染色法22%的肝組織中有纖維結(jié)締組織增生,并有網(wǎng)狀纖維膠原化,提示這些肝組織有轉(zhuǎn)為慢性肝炎的趨勢。這表明SD大鼠的HBV和HEV感染對其肝臟造成了明顯的損傷作用,表現(xiàn)為明顯的病毒性肝炎的病理學(xué)變化。但其病原與人乙肝病毒和戊肝病毒的同源性有待進(jìn)一步研究。

    由于缺乏合適的體內(nèi)外模型,HBV的生物學(xué)研究及治療方法進(jìn)展緩慢,因此,建立一種有效的HBV感染模型,是探索其感染機(jī)制,發(fā)病機(jī)理,尋找有效的防治方法及開展抗HBV藥物的篩選的重要前提。國內(nèi)外學(xué)者普遍采用鴨HBV感染1~3日齡雛鴨建立乙肝動物模型,是研究乙肝發(fā)病機(jī)制、病毒復(fù)制過程及篩選有效治療藥物的理想模型,可作為抗病毒藥物臨床前評價(jià)的工具,用于研究藥物的藥效、藥動學(xué)以及毒理學(xué),也可用于評價(jià)免疫治療的療效[24]。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠模型也應(yīng)用于HBV感染過程和感染后的免疫病理改變,還有助于發(fā)展新的抗病毒治療方法[25]。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠為研究病毒在體內(nèi)的復(fù)制提供了良好的模型,但同時(shí)也具有很多缺陷[26]。HEV多種動物宿主的發(fā)現(xiàn)提供了實(shí)驗(yàn)感染動物模型,其中包括非人類靈長類:猴、食蟹猴、非洲綠猴、短尾猴和黑猩猩[27]。豬作為HEV動物模型,實(shí)驗(yàn)感染了豬HEV和人HEV株,這提供了HEV跨物種傳播的實(shí)驗(yàn)依據(jù)[28]。有研究表明,野生嚙齒類動物體內(nèi)檢測到HBV和HEV的感染,SD大鼠是常用的實(shí)驗(yàn)動物,本研究中檢測到的免疫組化陽性的大鼠肝臟其病理變化與人的病毒性肝炎的病變相似,陽性信號分布也與人的HBV和HEV相似,所以,大鼠能否成為進(jìn)行HBV和HEV研究的動物模型,有待深入研究。

    4 結(jié)論

    SD大鼠可以自然感染HBV和HEV,HBV主要在肝細(xì)胞的胞漿胞核中分布,HEV主要分布于肝細(xì)胞的胞漿胞核和小葉間膽管上皮中,并且會使其肝臟出現(xiàn)典型的病毒性肝炎的病變特征,部分肝臟還表現(xiàn)有纖維化的趨勢。

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