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    水貂源牛分枝桿菌的分離與熒光PCR鑒定

    2010-11-18 06:29:20王春雨王全凱王海軍劉金華王振國(guó)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)吉林長(zhǎng)春308吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局吉林長(zhǎng)春3006
    中國(guó)動(dòng)物檢疫 2010年9期
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)

    王春雨,楊 莉,王全凱,王海軍,劉金華,周 亮,王振國(guó)(.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),吉林長(zhǎng)春 308;.吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局,吉林長(zhǎng)春 3006)

    水貂作為主要毛皮動(dòng)物,在我國(guó)北部地區(qū)廣泛養(yǎng)殖,每年產(chǎn)皮數(shù)百萬(wàn)張,年經(jīng)濟(jì)產(chǎn)值達(dá)億元,是特種動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的主要支柱[1]。由于各地區(qū)養(yǎng)殖規(guī)模大小不一,管理水平良莠不齊,對(duì)水貂疾病的防治的能力和條件普遍較差,難以保證實(shí)際生產(chǎn)對(duì)疾病防控的要求。水貂結(jié)核病在上世紀(jì)就被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)報(bào)道[2],水貂的養(yǎng)殖密度較大,配種時(shí)需要人工協(xié)助,結(jié)核病一旦發(fā)生就可能大范圍流行,并威脅到養(yǎng)殖人員健康,進(jìn)而影響社會(huì)公共衛(wèi)生安全。

    結(jié)核病是一種慢性人獸共患傳染病,其潛伏期長(zhǎng),檢疫和診斷的研究進(jìn)展緩慢。目前結(jié)核病的診斷主要還是靠臨床癥狀和涂片染色以及細(xì)菌培養(yǎng)[3],由于結(jié)核桿菌生長(zhǎng)速度慢,所以菌種的鑒定,費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、敏感性差 ,不利于結(jié)核病的凈化。熒光探針PCR是近期開(kāi)始流行的一種微生物檢測(cè)技術(shù),具有準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn),已廣泛用于基因表達(dá)、病原體檢測(cè)等諸多研究領(lǐng)域[4-6]。本研究采用熒光探針PCR對(duì)水貂源牛分枝桿菌進(jìn)行鑒定,可以縮短檢測(cè)時(shí)間,有利于水貂群中結(jié)核病的及時(shí)控制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 動(dòng)物 大連某貂場(chǎng)死亡水貂10只,ELISA檢測(cè)結(jié)核陽(yáng)性。

    1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 人型結(jié)核分枝桿菌 H37Rv ((M.tuberculosis,ATCC25618)、牛分枝桿菌(M.bovis,ATCC19210)、草分枝桿菌(M.phlei,ATCC607)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis,ATCC607),胃分枝桿菌(M.gastri,ATCC15754),購(gòu)自北京中原經(jīng)貿(mào)公司(ATCC菌種保存中心中國(guó)代理)。

    1.1.3 主要試劑與儀器 7H9培養(yǎng)基、7H10培養(yǎng)基、OADC增菌劑均購(gòu)自美國(guó)BD公司;Ex 2×Taq酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;ABI7000實(shí)時(shí)熒光PCR儀為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品;超純水器Mill—Q Elix 10購(gòu)自Millipore公司。

    1.1.4 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成采用Primer Express2.0軟件,設(shè)計(jì)熒光PCR探針和引物。根據(jù)GenBank登錄的結(jié)核桿菌RD1編碼區(qū)設(shè)計(jì)合成引物及探針,5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán),3’端標(biāo)記BHQ-1(上游引物GGCTTCTGACCCGCTAATAC,下游引物ACGTGACATTTCCCTGG ATT,探針 CCGCGAAATTCCACTG CTGC);根據(jù)牛分枝桿菌基因組中特有序列(GenBank No:AJ003103) 設(shè)計(jì)合成引物及探針,5’端標(biāo)記HEX熒光基團(tuán),3’端標(biāo)記BHQ-1(上游引物GTCATGACGCCTTCCTAACC,下游引物CTCCAAGAGTGTTGCG CTT,探針 TGAATTCATACAAGC CGTAGTCGTGCA)。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 采集水貂的肺、脾、淋巴結(jié)樣品,將樣品進(jìn)行勻漿處理后使用4%NaOH進(jìn)行消化處理,再用相同濃度的弱酸進(jìn)行中和,將處理后的組織漿液接種于7H10培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng),接種后3 d、7 d后分別觀察結(jié)果一次,以后每周定期觀察結(jié)果兩次。

    1.2.2 抗酸染色 取采集病料的觸片,用萋—尼二氏(Zehl-Neelson)染色法染色,光學(xué)顯微鏡觀察。

    1.2.3 細(xì)菌DNA的提取 取2-3個(gè)菌落的放入離心管中,加入200 μL TE緩沖液,85~90℃煮10 min后,立即-20℃冷凍15 min,加入40 μL(20 mg/mL)溶菌酶,混勻,37 ℃孵化2 h后迅速加熱到65℃。再加入250μg/mL蛋白酶K和終濃度1%SDS,震蕩30 min,加入終濃度為1%的 CTAB和 NaCl混合液(CTAB 10%;NaCl 0.7 M),65℃孵化 20 min。加入等體積的氯仿/異戊醇(24/1)提取,離心后取上清液,加入0.6體積的異丙醇沉淀,離心去掉上清,自然干燥,加入25μL無(wú)菌蒸餾水溶解DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.4 TaqMan熒光PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件 TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)體系為25μL,其中ddH2O 13 μL,10×Ex PCR buffer(含 5 mM MgCl2)5μL,dNTP(2.5 mM)2μL,引物 (10 pmol/μL) 和探針(10 pmol/μL)各 0.5 μL,Ex Taq 熱啟動(dòng)酶(5 u/μL)0.5 μL,DNA3 μL。,按下列反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行:95℃預(yù)變性4 min;95 ℃變性 15 s,60 ℃退火延伸30 s,40個(gè)循環(huán);退火延伸檢測(cè)熒光信號(hào)。

    2 結(jié)果

    2.1 鏡檢結(jié)果 采集病料的觸片經(jīng)萋—尼二氏染色,為短桿狀紅色抗酸桿菌(圖1)。

    2.2 分離培養(yǎng)結(jié)果 經(jīng)過(guò)堿處理的病料接種到7H10固體培養(yǎng)基,45 d后有一只水貂的肺臟和淋巴結(jié)樣本長(zhǎng)出菌落,將菌落轉(zhuǎn)接到7H9和7H10固體培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)。

    2.3 熒光探針檢測(cè)結(jié)果

    2.3.1 結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測(cè)根據(jù)致病性結(jié)核桿菌復(fù)合群特有的RD1序列區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針,對(duì)所分離的病原菌進(jìn)行檢測(cè)。以H37Rv、牛分枝桿菌為陽(yáng)性質(zhì)控菌株,BCG和其他分枝桿菌為陰性質(zhì)控菌株。所分離的病原出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,證明所分離的菌株是致病性結(jié)核桿菌(圖2)。

    2.3.2 牛分枝桿菌檢測(cè)以牛分枝桿菌為陽(yáng)性質(zhì)控菌株,H37Rv、草分枝桿菌、恥垢核分枝桿菌為陰性質(zhì)控菌株。對(duì)分離病原進(jìn)行亞種鑒定,出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增曲線,說(shuō)明所分離的水貂結(jié)核病原菌屬于牛分枝桿菌亞種(圖3)。

    3 討論

    結(jié)核桿菌的分離培養(yǎng)對(duì)病料的前處理要求較高,我們處理了十只水貂的內(nèi)臟樣品,但只從一只水貂樣本中分離得到牛分枝桿菌,原因可能是由于樣品處理時(shí)間不當(dāng)。不同亞種分枝桿菌對(duì)培養(yǎng)基敏感性存在差異,通常使用的L-J培養(yǎng)基對(duì)于牛分枝桿菌的檢出率比較低[7],所以本研究使用7H10培養(yǎng)基添加OADC增菌劑進(jìn)行初代分離培養(yǎng),菌落較L-J培養(yǎng)基小,但是菌落在整個(gè)培養(yǎng)基斜面分布更加均勻,菌落數(shù)量增多,有利于進(jìn)一步純化培養(yǎng)。

    結(jié)核桿菌的常規(guī)檢測(cè)方法為生化鑒定等,屬于表型分類法,是以形態(tài)和理化特征為依據(jù),近年來(lái)變異株的出現(xiàn),導(dǎo)致了生化檢測(cè)的特異性降低,讓MTC物種級(jí)鑒定依然存在較大難度[8-9]。分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用在疾病的診斷逐漸被人們所認(rèn)可,特別是對(duì)于體外培養(yǎng)困難的病原微生物的診斷具有重要的作用[10-11]。結(jié)核桿菌復(fù)合群熒光PCR檢測(cè)研究較多主要是IS6110插入序列,該序列在部分牛分枝桿菌中只存在單一拷貝[12],這就導(dǎo)致以IS6110片段為模板動(dòng)物結(jié)核病病原檢測(cè)時(shí)存在弊端。本研究應(yīng)用的結(jié)核桿菌RD1序列只存在于結(jié)核桿菌復(fù)合群致病株中,基于該位點(diǎn)的熒光PCR檢測(cè)技術(shù)可以增加檢測(cè)的特異性,能夠?qū)⒅虏⌒越Y(jié)核桿菌與BCG以及其他非致病性結(jié)核桿菌區(qū)別,根據(jù)牛分枝桿菌基因組中特有的229 bp序列設(shè)計(jì)引物與探針可以對(duì)結(jié)核桿菌復(fù)合群直接進(jìn)行亞種鑒定,有利于結(jié)核桿菌的快速檢測(cè),縮短動(dòng)物檢驗(yàn)檢疫時(shí)間,促進(jìn)動(dòng)物結(jié)核病的防治。

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