水貂源牛分枝桿菌的分離與熒光PCR鑒定

王春雨，楊 莉，王全凱，王海軍，劉金華，周 亮，王振國（.吉林農(nóng)業(yè)大學，吉林長春 308；.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林長春 3006）

水貂作為主要毛皮動物，在我國北部地區(qū)廣泛養(yǎng)殖，每年產(chǎn)皮數(shù)百萬張，年經(jīng)濟產(chǎn)值達億元，是特種動物養(yǎng)殖業(yè)的主要支柱[1]。由于各地區(qū)養(yǎng)殖規(guī)模大小不一，管理水平良莠不齊，對水貂疾病的防治的能力和條件普遍較差，難以保證實際生產(chǎn)對疾病防控的要求。水貂結(jié)核病在上世紀就被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）報道[2]，水貂的養(yǎng)殖密度較大，配種時需要人工協(xié)助，結(jié)核病一旦發(fā)生就可能大范圍流行，并威脅到養(yǎng)殖人員健康，進而影響社會公共衛(wèi)生安全。

結(jié)核病是一種慢性人獸共患傳染病，其潛伏期長，檢疫和診斷的研究進展緩慢。目前結(jié)核病的診斷主要還是靠臨床癥狀和涂片染色以及細菌培養(yǎng)[3]，由于結(jié)核桿菌生長速度慢，所以菌種的鑒定，費時、費力、敏感性差 ，不利于結(jié)核病的凈化。熒光探針PCR是近期開始流行的一種微生物檢測技術(shù)，具有準確性高、重現(xiàn)性好等特點，已廣泛用于基因表達、病原體檢測等諸多研究領(lǐng)域[4-6]。本研究采用熒光探針PCR對水貂源牛分枝桿菌進行鑒定，可以縮短檢測時間，有利于水貂群中結(jié)核病的及時控制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 大連某貂場死亡水貂10只，ELISA檢測結(jié)核陽性。

1.1.2 標準菌株 人型結(jié)核分枝桿菌 H37Rv （（M.tuberculosis，ATCC25618）、牛分枝桿菌（M.bovis，ATCC19210）、草分枝桿菌（M.phlei，ATCC607）、恥垢分枝桿菌（M.smegmatis，ATCC607），胃分枝桿菌（M.gastri，ATCC15754），購自北京中原經(jīng)貿(mào)公司（ATCC菌種保存中心中國代理）。

1.1.3 主要試劑與儀器 7H9培養(yǎng)基、7H10培養(yǎng)基、OADC增菌劑均購自美國BD公司；Ex 2×Taq酶購自寶生物工程（大連）有限公司；ABI7000實時熒光PCR儀為美國應用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品；超純水器Mill—Q Elix 10購自Millipore公司。

1.1.4 引物、探針的設(shè)計與合成采用Primer Express2.0軟件，設(shè)計熒光PCR探針和引物。根據(jù)GenBank登錄的結(jié)核桿菌RD1編碼區(qū)設(shè)計合成引物及探針，5’端標記FAM熒光基團，3’端標記BHQ-1（上游引物GGCTTCTGACCCGCTAATAC，下游引物ACGTGACATTTCCCTGG ATT，探針 CCGCGAAATTCCACTG CTGC）；根據(jù)牛分枝桿菌基因組中特有序列（GenBank No：AJ003103） 設(shè)計合成引物及探針，5’端標記HEX熒光基團，3’端標記BHQ-1（上游引物GTCATGACGCCTTCCTAACC，下游引物CTCCAAGAGTGTTGCG CTT，探針 TGAATTCATACAAGC CGTAGTCGTGCA）。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng) 采集水貂的肺、脾、淋巴結(jié)樣品，將樣品進行勻漿處理后使用4%NaOH進行消化處理，再用相同濃度的弱酸進行中和，將處理后的組織漿液接種于7H10培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)，接種后3 d、7 d后分別觀察結(jié)果一次，以后每周定期觀察結(jié)果兩次。

1.2.2 抗酸染色 取采集病料的觸片，用萋—尼二氏（Zehl-Neelson）染色法染色，光學顯微鏡觀察。

1.2.3 細菌DNA的提取 取2-3個菌落的放入離心管中，加入200 μL TE緩沖液，85~90℃煮10 min后，立即-20℃冷凍15 min，加入40 μL（20 mg/mL）溶菌酶，混勻，37 ℃孵化2 h后迅速加熱到65℃。再加入250μg/mL蛋白酶K和終濃度1%SDS，震蕩30 min，加入終濃度為1%的 CTAB和 NaCl混合液（CTAB 10%;NaCl 0.7 M），65℃孵化 20 min。加入等體積的氯仿/異戊醇（24/1）提取，離心后取上清液，加入0.6體積的異丙醇沉淀，離心去掉上清，自然干燥，加入25μL無菌蒸餾水溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 TaqMan熒光PCR擴增體系和反應條件 TaqMan熒光定量PCR反應體系為25μL，其中ddH2O 13 μL，10×Ex PCR buffer（含 5 mM MgCl2）5μL，dNTP（2.5 mM）2μL，引物 （10 pmol/μL） 和探針（10 pmol/μL）各 0.5 μL，Ex Taq 熱啟動酶（5 u/μL）0.5 μL，DNA3 μL。，按下列反應參數(shù)進行：95℃預變性4 min；95 ℃變性 15 s，60 ℃退火延伸30 s，40個循環(huán)；退火延伸檢測熒光信號。

2 結(jié)果

2.1 鏡檢結(jié)果 采集病料的觸片經(jīng)萋—尼二氏染色，為短桿狀紅色抗酸桿菌（圖1）。

2.2 分離培養(yǎng)結(jié)果 經(jīng)過堿處理的病料接種到7H10固體培養(yǎng)基，45 d后有一只水貂的肺臟和淋巴結(jié)樣本長出菌落，將菌落轉(zhuǎn)接到7H9和7H10固體培養(yǎng)基進行純化培養(yǎng)。

2.3 熒光探針檢測結(jié)果

2.3.1 結(jié)核分枝桿菌復合群檢測根據(jù)致病性結(jié)核桿菌復合群特有的RD1序列區(qū)域設(shè)計引物和探針，對所分離的病原菌進行檢測。以H37Rv、牛分枝桿菌為陽性質(zhì)控菌株，BCG和其他分枝桿菌為陰性質(zhì)控菌株。所分離的病原出現(xiàn)擴增曲線，證明所分離的菌株是致病性結(jié)核桿菌（圖2）。

2.3.2 牛分枝桿菌檢測以牛分枝桿菌為陽性質(zhì)控菌株，H37Rv、草分枝桿菌、恥垢核分枝桿菌為陰性質(zhì)控菌株。對分離病原進行亞種鑒定，出現(xiàn)陽性擴增曲線，說明所分離的水貂結(jié)核病原菌屬于牛分枝桿菌亞種（圖3）。

3 討論

結(jié)核桿菌的分離培養(yǎng)對病料的前處理要求較高，我們處理了十只水貂的內(nèi)臟樣品，但只從一只水貂樣本中分離得到牛分枝桿菌，原因可能是由于樣品處理時間不當。不同亞種分枝桿菌對培養(yǎng)基敏感性存在差異，通常使用的L-J培養(yǎng)基對于牛分枝桿菌的檢出率比較低[7]，所以本研究使用7H10培養(yǎng)基添加OADC增菌劑進行初代分離培養(yǎng)，菌落較L-J培養(yǎng)基小，但是菌落在整個培養(yǎng)基斜面分布更加均勻，菌落數(shù)量增多，有利于進一步純化培養(yǎng)。

結(jié)核桿菌的常規(guī)檢測方法為生化鑒定等，屬于表型分類法，是以形態(tài)和理化特征為依據(jù)，近年來變異株的出現(xiàn)，導致了生化檢測的特異性降低，讓MTC物種級鑒定依然存在較大難度[8-9]。分子生物學技術(shù)應用在疾病的診斷逐漸被人們所認可，特別是對于體外培養(yǎng)困難的病原微生物的診斷具有重要的作用[10-11]。結(jié)核桿菌復合群熒光PCR檢測研究較多主要是IS6110插入序列，該序列在部分牛分枝桿菌中只存在單一拷貝[12]，這就導致以IS6110片段為模板動物結(jié)核病病原檢測時存在弊端。本研究應用的結(jié)核桿菌RD1序列只存在于結(jié)核桿菌復合群致病株中，基于該位點的熒光PCR檢測技術(shù)可以增加檢測的特異性，能夠?qū)⒅虏⌒越Y(jié)核桿菌與BCG以及其他非致病性結(jié)核桿菌區(qū)別，根據(jù)牛分枝桿菌基因組中特有的229 bp序列設(shè)計引物與探針可以對結(jié)核桿菌復合群直接進行亞種鑒定，有利于結(jié)核桿菌的快速檢測，縮短動物檢驗檢疫時間，促進動物結(jié)核病的防治。

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