應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的研究

唐夢(mèng)君 ，高玉時(shí) ，周 生 ，張小燕 ，唐修君 ，蒲俊華 ，葛慶聯(lián)

（1.農(nóng)業(yè)部家禽品質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，江蘇揚(yáng)州 225003；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，江蘇揚(yáng)州 225003）

單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria.monocytogenes LM）是李斯特菌屬中的一種，LM廣泛分布于自然界，在肉類、蛋類、禽類、海產(chǎn)品、乳制品和蔬菜類都能檢出[1-2]。該菌為重要人獸共患和食源性病原菌，可引起人和多種動(dòng)物的胃炎、腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等。新生兒、老人及免疫低下者更易感染發(fā)病，病死率高達(dá)30%[2]。因此，建立一種快速、有效的檢測(cè)方法對(duì)各種食品進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)督，及時(shí)檢測(cè)出食品中是否含有該菌非常重要。

目前LM快速檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定、免疫檢測(cè)、PCR方法等。細(xì)菌分離鑒定法操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)；免疫檢測(cè)操作簡(jiǎn)便，可在同一時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量樣品，但由于存在菌體及鞭毛抗原交叉反應(yīng)，難以進(jìn)行李斯特菌種間特異性鑒別[3]；PCR法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和速度快等優(yōu)點(diǎn)，但因PCR技術(shù)對(duì)模板DNA的質(zhì)量有較高要求，需要的熱循環(huán)設(shè)備價(jià)格昂貴而很難得到推廣。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated isothermal amplication，LAMP)是 Notomi等在2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其原理是針對(duì)目的基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNApolymerase）在等溫65℃左右，幾十分鐘，即可實(shí)現(xiàn)核酸的高效擴(kuò)增[4]。4條引物對(duì)靶序列的6個(gè)特異序列區(qū)域的識(shí)別，保證了LAMP擴(kuò)增的高度特異性。LAMP不需要模版的熱變性[5]，長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)，在等溫條件下擴(kuò)增，不會(huì)因溫度改變而浪費(fèi)時(shí)間。有無肉眼可見的焦磷酸鎂的白色沉淀[6-7]，成為判斷核酸是否擴(kuò)增的最簡(jiǎn)單的方法。增加環(huán)引物的LAMP方法，使反應(yīng)速度可提高1/2~1/3[8]。因此，LAMP與PCR方法相比具有更高的特異性和高效性[9-11]。近來研究表明，LAMP已成功應(yīng)用于各種細(xì)菌和病毒的快速檢測(cè)[12-14]。本實(shí)驗(yàn)以單核細(xì)胞增生李斯特菌的hlyA基因?yàn)榘行蛄性O(shè)計(jì)三對(duì)引物（包括內(nèi)外引物和一對(duì)環(huán)引物），并比較了LAMP和PCR方法的特異性與靈敏性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備和試劑 電熱恒溫水浴鍋、高速冷凍離心機(jī)（HITACHI）、PCR 擴(kuò)增儀（eppendorf）、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫培養(yǎng)箱、電泳儀等；Bst DNA聚合酶購自New England Biolab 公司；甜菜堿（Betain），購自Sigma 公 司 ；TaqDNA、dNTP、DNA Marker、Cla I酶等分子生物學(xué)試劑購自大連寶生物試劑有限公司。

1.2 菌種 單增李斯特菌（GIM1.229）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538)、鼠傷寒沙門氏菌（CMCC50115)、痢疾志賀氏菌（CMCC51252)、豬霍亂沙門氏菌（ATCC13312）、福氏志賀氏菌（CMCC51572）、宋氏志賀氏菌（CMCC51592）購自廣東省微生物菌種保藏中心；副溶血性弧菌（ATCC17802）、豬霍亂沙門氏菌（ATCC14028）、 大 腸 桿 菌（ATCC8739）購自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Gen-Bank公布的單核細(xì)胞增生李斯特菌hlyA基因序列中的保守序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer4.0進(jìn)行設(shè)計(jì)，得到一套特異性的LAMP引物，包括外引物 F3、B3和內(nèi)引物FIP、BIP以及環(huán)引物L(fēng)F、LB，引物序列見表1。引物委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

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1.4 DNA模版的制備 細(xì)菌基因組DNA提取方法參照文獻(xiàn)[15]，具體步驟為：取一接種環(huán)的細(xì)菌培養(yǎng)物（約10μL）于1.5 mL離心管中，加入 50μL NaOH（25 mmol/L）混勻，100℃水浴 10 min，加入 4μL Tris-HCl（1 M，pH8.0）進(jìn)行中和，混懸液4℃20 000 g離心5 min，去沉淀，上清作為L(zhǎng)AMP和PCR的DNA模板。

1.5 LAMP擴(kuò)增 配制LAMP反應(yīng)體系25μL，包括：10xbst buffer 2.5 μL，MgSO4（25 mmol／L）4 μL、dNTP（10 mmol／L）4 μL、Betaine（5 mol／L）4μL、內(nèi)引物（20 μmol／L）各 1.5μL、外引物（10 μmol／L）各 0.5μL、環(huán)引物（10μmol／L）各0.5μL、Bst DNA 聚合酶大片段（8 U／μL）1μL、DNA模板 2μL以及ddH2O 2.5μL?；靹颍?5℃溫育60 min，80℃滅活10 min中止反應(yīng)。產(chǎn)物于2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，同時(shí)通過向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1μL SYBRGREEN I，觀察顏色變化判斷擴(kuò)增與否。

1.6 LAMP產(chǎn)物的酶切鑒定 取2 μL LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1μL ClaI、2μL緩沖液及 ddH2O 15μL，輕輕地混合后離心，在37℃酶切1 h，2.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.7 PCR擴(kuò)增 單核細(xì)胞增生李斯特菌PCR反應(yīng)的引物是檢測(cè)LM的LAMP反應(yīng)的兩條外引物（F3和B3），見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10 ×PCR Buffer 2.5 μL、MgCl2（25 mmol/L）2 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2 μL、Taq酶 0.25μL、F3和 B3各 1 μL、模板 2μL，ddH2O 為 14.25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性 30 s，56 ℃退火 30 s，72℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.8 LAMP方法特異性試驗(yàn) 以10株實(shí)驗(yàn)菌株的基因組DNA為模板，用建立的LAMP方法進(jìn)行擴(kuò)增，電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，驗(yàn)證方法特異性。同時(shí)用PCR法進(jìn)行平行檢測(cè)。

1.9 LAMP方法靈敏度試驗(yàn)

1.9.1 細(xì)菌純培養(yǎng)檢測(cè)靈敏度 單核細(xì)胞增生李斯特菌接種于新鮮的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h。用生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋。采用稀釋平板法，測(cè)定其純培養(yǎng)物活菌數(shù);同時(shí)從每稀釋度菌液中取100 μL菌液離心去上清，再加入50μL NaOH（25 mmol/L）混勻，100 ℃水浴10 min， 加 入 4 μL Tris-HCl（1 mol/L，pH8.0）進(jìn)行中和，混懸液 4 ℃20 000 g離心5 min，去細(xì)胞沉淀，取2μL上清作為DNA模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。

1.9.2 人工污染樣的檢測(cè)靈敏度 取經(jīng)傳統(tǒng)方法和常規(guī)PCR方法預(yù)檢單核細(xì)胞增生李斯特菌陰性的禽肉25 g，放入225mLLB1培養(yǎng)基中進(jìn)行均質(zhì)，取100μL稀釋菌液分別接種到900μL均質(zhì)液中，旋渦混勻，900g離心1 min，上清轉(zhuǎn)入一干凈EP管中，再10 000 g離心5 min，去上清，沉淀加入 100μL NaOH（25 mmol/L）混勻，100℃水浴 10min，加入 8μL Tris-HCl（1 M，pH8.0）進(jìn)行中和，混懸液4℃20 000 g離心5 min，去沉淀，取4μL上清作為L(zhǎng)AMP和PCR的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 LAMP檢測(cè)方法的建立 本研究以設(shè)計(jì)的一套特異性引物對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組DNA泳道產(chǎn)生階梯狀條帶，以水作為模板的陰性對(duì)照未有條帶出現(xiàn)（圖1A）；另外，向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入 1μL SYBR GREEN I，單核細(xì)胞增生李斯特菌擴(kuò)增產(chǎn)物與染料混合后顏色由橙色變?yōu)榫G色，而陰性對(duì)照仍為橙色（如圖1B）。結(jié)果表明此套LAMP引物能夠有效擴(kuò)增單核細(xì)胞增生李斯特菌hlyA基因。

2.2 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定圖2顯示了單核細(xì)胞增生李斯特菌LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)ClaI酶切消化后的結(jié)果。理論計(jì)算，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶ClaI消化后應(yīng)為2條分子量約為250 bp和150 bp條帶。圖中結(jié)果與理論值基本相符。

2.3 LAMP檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的特異性結(jié)果 用建立的LAMP方法分別對(duì)10株實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行擴(kuò)增，特異性試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，LAMP法和PCR法均具有高特異性，僅單核細(xì)胞增生李斯特菌得到陽性結(jié)果，其它9株非單核細(xì)胞增生均為陰性。

2.4 LAMP檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的靈敏度結(jié)果 經(jīng)平板計(jì)數(shù)，原始菌液濃度為5.44×108cfu／mL。10倍系列稀釋菌液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，LAMP法細(xì)菌純培養(yǎng)物和人工污染樣品的檢測(cè)限約為5.44×102cfu／mL，PCR法細(xì)菌純養(yǎng)物和人工污染樣品的檢測(cè)限為5.44×104cfu／mL（圖4）。

3 討論

單核細(xì)胞增生李斯特菌廣泛存在于自然界中，可在極端的環(huán)境（低溫和高鹽）中生長(zhǎng)，使它很難在食物鏈中被去除，所以單增李斯特菌在各種食品中均可造成污染，歐美國(guó)家曾因此發(fā)生多次單增李斯特菌引起的食物中毒，食源性的李斯特菌病已成為一個(gè)公共衛(wèi)生問題。目前我國(guó)主要的檢測(cè)方法為傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法結(jié)合顯色培養(yǎng)基和基于生化反應(yīng)的VITEK系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，操作較復(fù)雜，時(shí)間較長(zhǎng)，而ELISA試劑盒盡管快速、簡(jiǎn)便、靈敏，但成本較高。近年來隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展，PCR[16-18]、多重 PCR[19-20]、實(shí)時(shí)熒光PCR[21-22]等在單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)研究中得到了應(yīng)用。但這些方法都要耗時(shí)4~5 h，并且既要昂貴的儀器設(shè)備用于擴(kuò)增，又要用復(fù)雜的方法對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，從而限制了它們?cè)诨鶎訉?shí)驗(yàn)室的推廣。因此，亟需開發(fā)一種快速、靈敏、方便、價(jià)廉的檢測(cè)方法，以滿足對(duì)食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的實(shí)時(shí)檢測(cè)。最近研究表明LAMP方法檢測(cè)各種食源性致病菌方面具有良好潛力。因此，本研究以單核細(xì)胞增生李斯特菌的hlyA基因?yàn)榘行蛄?，建立了帶?條環(huán)引物的LAMP方法。

單核細(xì)胞增生李斯特菌主要的毒力因子有：hlyA、actA、plcA、plcB、prfA、mpl。而檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌常用的靶基因主要有iap、hly、Inl基因[23]。hly基因主要是編碼溶血素O的基因，溶血素為李斯特菌的主要致病因子。hly基因是單核細(xì)胞增生李斯特菌比較保守的基因，目前多數(shù)研究都使用hly基因用以檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌。本研究選擇單核細(xì)胞增生李斯特菌hlyA基因作為靶基因建立LAMP檢測(cè)方法，對(duì)10株實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行擴(kuò)增，只有單核細(xì)胞增生李斯特菌得到陽性結(jié)果，而其它菌株均為陰性結(jié)果，因此該方法特異性強(qiáng)。本方法靈敏度高，對(duì)于細(xì)菌純培養(yǎng)物和人工染菌的檢測(cè)限約為5.44×102cfu／mL，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[15，24]的檢測(cè)限基本相符，且該方法的檢測(cè)靈敏度是常規(guī)PCR的100倍，研究表明，LAMP技術(shù)可檢測(cè)到10個(gè)拷貝數(shù)甚至更低的靶標(biāo)，在檢測(cè)靈敏度上具有更大的優(yōu)勢(shì)[25-26]。同時(shí)，本研究在LAMP反應(yīng)中添加2條環(huán)引物，環(huán)狀引物與莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合的區(qū)域在F2和Fl之間（或是B2和B1之間），以F1到F2的方向或是B1到B2的方向結(jié)合。這樣，莖環(huán)DNA或者與內(nèi)引物雜交，或者與環(huán)狀引物雜交來啟動(dòng)鏈置換DNA的合成，從而加快了反應(yīng)速度，使擴(kuò)增時(shí)間從60 min縮至30 min，與 Hong 和 Yano 等[27-28]的研究報(bào)道相符。

綜上所述，本研究建立的單核細(xì)胞增生李斯特菌LAMP檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷、成本低等特點(diǎn)，為單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)提供了新的發(fā)展方向，有望成為簡(jiǎn)易的常規(guī)檢測(cè)手段，適用于大批量樣品的初篩或野外現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行定性檢測(cè)。

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