銅綠假單胞菌注射液對術(shù)后早期腹腔化療時結(jié)腸吻合口愈合的影響

孫艷華,董 哲,高成生

(遼寧醫(yī)學(xué)院 第一附屬醫(yī)院 普外科/大腸病區(qū),遼寧 錦州 121001)

Sugarbaker提出的術(shù)后早期腹腔化療理論(early postoperative intraperitoneal chemotherapy,EPIC)較傳統(tǒng)的腹腔化療對預(yù)防結(jié)直腸癌術(shù)后手術(shù)創(chuàng)面、腹膜和肝臟轉(zhuǎn)移具有更重要的意義[1]。臨床研究表明,EPIC可降低局部復(fù)發(fā)率,延長患者的生存期[2]。但 EPIC也有增加術(shù)后并發(fā)癥的風(fēng)險,其中吻合口漏、腹腔膿腫和化學(xué)性腹膜炎比較常見,這也成為其廣泛臨床開展的主要障礙[3]。銅綠假單胞菌注射液(PA-MSHA)是一種生物工程技術(shù)制備的新型菌類制劑[4],不但能直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[5],還能有效激活人體免疫系統(tǒng)[6],已廣泛用于多種惡性腫瘤的輔助治療。PA-MSHA能夠有效防止腫瘤術(shù)后的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[7],降低感染發(fā)生率,延長患者的生存期[8]。為研究 PA-MSHA能否促進術(shù)后早期腹腔化療情況下結(jié)腸吻合口的愈合,我們利用SD大鼠的結(jié)腸切除吻合模型對此進行了研究。

1 材料和方法

1.1 大鼠結(jié)腸吻合模型的建立

雄性 SD大鼠 60只,體重 200～250 g,由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供,合格證號:SYXK(遼)2009-0011。大鼠術(shù)前禁食 12 h,飲水不限。術(shù)前稱體重,10%水合氯醛3mL/kg腹腔內(nèi)麻醉,于劍突下1cm處取長約3cm腹正中切口,逐層切開入腹,切除1cm左結(jié)腸,5-0的無損傷線間斷內(nèi)翻縫合8～10針,1號絲線縫合腹膜、腹部肌肉和皮膚。術(shù)后12 h開始給予常規(guī)鼠飼料,術(shù)后24 h開始給藥。

1.2 實驗分組及給藥方法

大鼠隨機分成3組:A組,術(shù)后1～5d腹腔注射生理鹽水0.8mg/(kg·d);B組,術(shù)后1～5d腹腔內(nèi)注射 5-氟尿嘧啶(5-Fu)20mg/(kg·d);C組,術(shù)前第3天開始雙后肢內(nèi)側(cè)皮下注射 PA-MSHA(北京萬特爾生物制藥有限公司)0.5mL/次,隔日一次,直至處死或?qū)嶒灲Y(jié)束,術(shù)后腹腔化療方法同B組。各組大鼠均不使用抗生素。

1.3 檢查指標(biāo)及方法

1.3.1 一般情況 造模及給藥過程中,密切觀察并記錄各組大鼠的飲食情況、活動、精神狀態(tài)和腹部切口愈合情況等。

1.3.2 吻合口漏發(fā)生率 對治療期間死亡的大鼠進行尸檢,明確其死亡原因。各組大鼠分別于術(shù)后第7和14天,各取10只進行開腹探查,如腹腔內(nèi)有大量滲出液,吻合口與周圍組織及網(wǎng)膜有不同程度粘連,松解粘連,吻合口周圍發(fā)現(xiàn)膿苔、組織壞死或明顯漏口者可判定為吻合口漏,計算各組吻合口漏的總發(fā)生率。

1.3.3 淋巴細(xì)胞計數(shù) 各組大鼠分別于術(shù)后第7和14天開腹抽取下腔靜脈血3mL,進行淋巴細(xì)胞計數(shù)。

1.3.4 吻合口破裂壓力(ABP) 大鼠開腹后,在吻合口遠(yuǎn)近兩端各3cm結(jié)扎腸襪,一端腸襪與壓力換能器連接,另一端與微量輸液泵連接,通過 LMS-2B型二道生理記錄儀記錄壓力曲線。以輸液泵向腸管內(nèi)注入生理鹽水2mL/min,觀察壓力曲線急驟下降前的最大壓力即 ABP。

1.3.5 吻合口羥脯氨酸(HYP)含量 清除吻合口周圍粘連組織,切取以吻合口處組織50～100mg,-80°C冰箱保存待檢,分別按考馬斯亮蘭蛋白試劑盒和HYP試劑盒說明操作。

1.3.6 病理組織學(xué)觀察 取吻合口處組織,10%中性甲醛液內(nèi)固定,常規(guī)石蠟包埋、切片層厚 5μm,行蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學(xué)染色后進行顯微鏡下觀察,免疫組織化學(xué)染色并做圖像分析,結(jié)果取像素和面積平均后的乘積。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

各組大鼠在術(shù)后6h基本恢復(fù)活動力,12 h恢復(fù)飲食。術(shù)后2～7d,B組較其他兩組活動力下降,表現(xiàn)為倦怠,飲食減少,對刺激反應(yīng)遲鈍,術(shù)后8d基本恢復(fù)。各組大鼠均無腹壁切口感染發(fā)生。

2.2 吻合口漏發(fā)生率

術(shù)后各組大鼠腹腔均有不同程度的粘連,以B組最為明顯。A組和C組均無吻合口漏發(fā)生,B組共發(fā)生 6例吻合口漏,其中術(shù)后第4天2例、第5天3例、第7天1例,大鼠均死亡。解剖發(fā)現(xiàn)大鼠均發(fā)生腹腔感染積液甚至腹腔膿腫。B組吻合口漏發(fā)生率為30%,顯著高于A組和C組的0(P＜0.01)。

2.3 外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)、ABP和HYP測定結(jié)果

結(jié)果見表1。術(shù)后第7天,B組外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)顯著低于A組(P＜0.05)和C組(P＜0.01)。術(shù)后第14天,C組外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)顯著高于另外兩組(P＜0.01)。術(shù)后第7天,B組ABP和HYP含量均明顯低于A組和C組(P＜0.01)。術(shù)后第14天,3組之間 ABP和HYP含量比較均無顯著差異(P＞0.05)。

表1 外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)、ABP和HYP測定結(jié)果(±s)Tab.1 Determination results of in peripheral blood lymphocyte count,ABP and HYP(±s)

表1 外周血淋巴細(xì)胞計數(shù)、ABP和HYP測定結(jié)果(±s)Tab.1 Determination results of in peripheral blood lymphocyte count,ABP and HYP(±s)

與B組比較:1P＜0.05,2P＜0.01;與C組比較:3 P＜0.01Compared with B group:1 P＜0.05,2P＜0.01;Compared with C group:3 P＜0.01

組別 n 淋巴細(xì)胞計數(shù)/(109/L)術(shù)后7天術(shù)后14天ABP/(mmHg)術(shù)后7天術(shù)后14天HYP/(μg/mgprot)術(shù)后7天術(shù)后14天A組 10 5.11±0.651 12.09±0.833 132.19±2.551,3 135.92±0.56 3.46±0.371,3 4.06±0.21 B組 7 2.94±2.40 12.04±0.693 92.11±14.40 134.84±2.16 2.81±0.30 3.89±0.19 C組 10 6.49±1.682 18.43±2.65 129.93±5.781 135.73±0.94 3.40±0.301 4.05±0.20

2.4 病理學(xué)觀察

2.4.1 吻合口細(xì)胞浸潤和愈合情況 術(shù)后第7天,吻合口組織切片HE染色,觀察結(jié)果顯示,B組吻合口組織炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、新生血管均較少,周圍黏膜壞死明顯且組織疏松;而A組和C組吻合口組織炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、新生血管較多,黏膜壞死脫落相對較輕,各組織也較為致密(圖1)。術(shù)后第14天,各組吻合口組織更為致密,新生黏膜上皮覆蓋,滲出的炎癥細(xì)胞減少,局部以成纖維細(xì)胞為主,新生血管閉合,3組吻合口均愈合良好(圖2)。

圖1 術(shù)后第7天吻合口組織HE染色(200×)Fig.1 HE staining of Anastomotic on the 7th day after surgery(200×)

圖2 術(shù)后第14天吻合口組織HE染色(200×)Fig.2 HEstaining of Anastomotic on the 14th day after surgery(200×)

2.4.2 吻合口Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達情況 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維呈棕黃色顆粒狀或片狀,顯色在成纖維細(xì)胞胞漿和膠原特定的區(qū)域,且在瘢痕組織中表達更為明顯。術(shù)后第7天,B組吻合口Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維細(xì)小且紊亂,而A和C組則粗大且規(guī)則;A和C組之間膠原的含量沒有差異(P＞0.05),但均顯著高于B組(P＜0.05)(表2)。術(shù)后第14天,3組吻合口Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維更加致密,但 3組之間含量已經(jīng)沒有顯著差異(P＞0.05)(表2)。

3 討 論

PA-MSHA的有效成分是滅活的銅綠假單胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株,其區(qū)別于自然界銅綠假單胞菌的最顯著結(jié)構(gòu)特點是具有周身的甘露糖敏感血凝(MSHA)菌毛[4]。最新研究表明,PA-MSHA的MSHA菌毛能夠與腫瘤細(xì)胞表面 EGFR受體上的甘露糖結(jié)合,進而阻斷 EGFR受體的活化,抑制腫瘤細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡[5]。另一方面,PAMSHA的菌體成分,如 MSHA菌毛能夠激活包括TLR4在內(nèi)的模式識別受體(PRR)[9],活化多種免疫細(xì)胞,如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞,幫助機體重建免疫監(jiān)視和免疫防御功能[6]。

本研究選用目前公認(rèn)為腹腔化療最有效、最常用的化療藥物——5-Fu,以Sugarbaker提出的EPIC理論為依據(jù),從術(shù)后24 h開始,連續(xù) 5 d腹腔內(nèi)注射5-Fu。研究發(fā)現(xiàn),B組的吻合口漏多發(fā)生在術(shù)后4～5d。既往的研究表明,在吻合術(shù)后3～4 d內(nèi),吻合口區(qū)域膠原酶被激活,膠原合成少于膠原降解導(dǎo)致膠原含量減少,吻合口抗張強度明顯下降,這一時期最易于發(fā)生吻合口漏。由于大鼠腹腔注射 5-Fu且術(shù)后未使用抗生素,5-Fu嚴(yán)重阻礙新生膠原纖維的合成,同時 5-Fu抑制機體免疫導(dǎo)致腹腔感染的發(fā)生,也阻礙了膠原纖維合成,使結(jié)腸吻合口漏在B組發(fā)生例數(shù)最多。術(shù)后第7天,B組淋巴細(xì)胞計數(shù)、ABP、HYP較低;顯微鏡下炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、新生血管均較少,周圍黏膜壞死明顯;Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維面積較小且紊亂、細(xì)小。而C組由于預(yù)防性注射 PA-MSHA,拮抗 5-Fu腹腔化療對大鼠免疫系統(tǒng)的直接抑制作用,激活 T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞,研究表明免疫細(xì)胞可分泌一系列的細(xì)胞因子,不僅能促進成纖維細(xì)胞增殖合成膠原纖維,還可以刺激血管內(nèi)皮增殖,促進新生毛細(xì)血管生成,調(diào)節(jié)組織修復(fù)的全過程[10];另外 PA-MSHA通過誘導(dǎo)大鼠機體產(chǎn)生高效價的跨菌屬抗體,增強機體免疫防御功能,有效地預(yù)防腹腔感染的發(fā)生,所以吻合口愈合良好。術(shù)后第14天,大鼠體內(nèi) 5-Fu完全代謝,各項指標(biāo)恢復(fù)與A組無明顯差異,但腹腔粘連明顯重于A組和C組,而腹腔粘連在慢性腸梗阻的發(fā)病機制中占有重要地位;C組只有淋巴細(xì)胞計數(shù)仍高于A組和B組,其他指標(biāo)無明顯差異,可見 PA-MSHA并沒有導(dǎo)致大鼠吻合口產(chǎn)生過度炎癥反應(yīng),形成局部纖維瘢痕,造成吻合口狹窄。這是因為組織修復(fù)過程是各種免疫細(xì)胞及分泌的多種細(xì)胞因子共同作用的結(jié)果,其中既有促進愈合的作用也有抑制愈合的作用。研究發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞因子之間存在著復(fù)雜的相互作用,如巨噬細(xì)胞除了分泌TGF-β1和TGF-β2外,也能分泌 TGF-β3,而TGF-β3可下調(diào) TGF-β1和TGF-β2,從而起到抗瘢痕修復(fù)的作用[11]。

總之,本研究發(fā)現(xiàn) PA-MSHA可以減輕術(shù)后早期腹腔化療對吻合口愈合的不良影響,降低吻合口漏的發(fā)生率。因此,提示 PA-MSHA皮下注射作為一種結(jié)、直腸癌的輔助治療方法,不但能在術(shù)后降低腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),還能促進吻合口的愈合。

表2 吻合口Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維的含量測定結(jié)果(±s)Tab.2 Determination results ofⅠ,Ⅲ collagen fiber content in anastomotic(±s)

表2 吻合口Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維的含量測定結(jié)果(±s)Tab.2 Determination results ofⅠ,Ⅲ collagen fiber content in anastomotic(±s)

與B組比較:1P＜0.05Compared with B group:1 P＜0.05

C組 10 1.44±0.071 2.55±0.08 1.38±0.111 2.24±0.08

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