吡咯喹啉醌對肝纖維化大鼠作用的初步研究

邱秀芹,王澤榮,徐 嵐,劉春亮,吳士良

(1.蘇州大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,江蘇 蘇州 215123;2.蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇 蘇州 215009;3.蘇州市第五人民醫(yī)院,江蘇 蘇州 215007)

肝纖維化是多種慢性肝病進(jìn)展的共同通路。其發(fā)生機(jī)制極為復(fù)雜,氧化應(yīng)激是其重要原因之一。當(dāng)肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡壞死后,激活肝星狀細(xì)胞分泌大量基質(zhì)蛋白,沉積于細(xì)胞間隙,形成肝纖維化。吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)是一種氧化還原酶的輔基,作為電子的供體和受體參與氧化還原過程[1]。PQQ有很強(qiáng)的自由基清除能力,對CCl4和乙醇引起的肝損傷有一定的保護(hù)作用[2-3]。本實驗旨在通過觀察 PQQ對實驗性CCl4致肝纖維化大鼠的血清及肝內(nèi)氧化及抗氧化體系的影響,肝臟病理學(xué)改變,探討 PQQ是否可通過改善體內(nèi)氧化及抗氧化體系發(fā)揮抗纖維化作用。

1 材 料

PQQ(含量98%),上海復(fù)旦大學(xué)生物化學(xué)教研室惠贈;丙二醛(MDA)、總抗氧化力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒,南京建成生物工程研究所。

SD大鼠,蘇州大學(xué)實驗動物中心,合格證號:SCXK(蘇)2007-0007。

2 方 法

2.1 動物分組與動物模型制作

雄性 SD大鼠24只,體重220～260g,隨機(jī)分成3組:正常對照組、模型組、PQQ干預(yù)組。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,模型組、PQQ干預(yù)組皮下注射 40%CCl4花生油溶液0.3mL/100 g體重,首次加倍,每周 2次;對照組注射花生油溶液,5周后PQQ干預(yù)組每日同時喂食PQQ2mg/kg體重,連續(xù)3周。各組大鼠均自由進(jìn)食。末次給藥24h后,戊巴比妥鈉麻醉,打開腹腔,腹主動脈采血;取肝臟組織檢測相應(yīng)指標(biāo)。

2.2 血清及肝臟 SOD、MDA、T-AOC的檢測

全血靜置30min后,離心,取上層血清,待測;取適量肝臟組織制成10%肝勻漿,離心,留取上清液備用。SOD、MDA、T-AOC的測定參照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2.3 肝組織病理學(xué)檢查

取肝左葉用10%福爾馬林固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋切片,HE染色,光鏡下觀察,參照肝纖維化組織病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理診斷分析[4]。用V-G膠原纖維染色以突出顯示肝內(nèi)纖維組織,供計算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析肝內(nèi)纖維組織增生情況,顯示肝組織中膠原的相對含量(relative content of collagen,RCC%)[5]。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,計量資料數(shù)據(jù)用(±s)表示,單因素方差分析,兩兩比較用t檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 PQQ對大鼠血清中氧化及抗氧化的影響

結(jié)果見表1。與正常組比較,模型組大鼠血清中 SOD、T-AOC顯著低于正常對照組(P＜0.01);MDA顯著高于正常對照組(P＜0.01)。與模型組相比,PQQ干預(yù)組大鼠血清中 SOD、T-AOC顯著升高(P＜0.05);MDA顯著降低(P＜0.05)。

3.2 PQQ對大鼠肝臟內(nèi)氧化及抗氧化的影響

結(jié)果見表2。與正常組比較,模型組大鼠肝組織中 SOD、T-AOC顯著低于正常對照組(P＜0.01);MDA顯著高于正常對照組(P＜0.01)。與模型組相比,PQQ干預(yù)組大肝組織中 SOD、T-AOC顯著升高(P＜0.05);MDA沒有顯著差異,但有下降趨勢。

表1 血清中SOD、T-AOC及MDA含量(±s,n=8)Tab.1 The activity of SOD,T-AOC and the content of MDA in serum(±s,n=8)

表1 血清中SOD、T-AOC及MDA含量(±s,n=8)Tab.1 The activity of SOD,T-AOC and the content of MDA in serum(±s,n=8)

與正常對照組比較:1P＜0.01;與模型組比較:2 P＜0.051P＜0.01 vs control group;2 P＜0.05 vs pathological group

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表2 肝組織中SOD、T-AOC及MDA含量(±s, n=8)Tab.2 Theactivity of SOD, T-AOCandthecontent of MDAinthelivertissue(±s, n=8)

表2 肝組織中SOD、T-AOC及MDA含量(±s, n=8)Tab.2 Theactivity of SOD, T-AOCandthecontent of MDAinthelivertissue(±s, n=8)

與正常對照組比較:1P＜0.01;與模型組比較:2 P＜0.051P＜0.01 vs control group;2 P＜0.05 vs pathological group

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3.3 組織病理學(xué)檢查

結(jié)果見圖1～2和表3。光鏡結(jié)果顯示,正常對照組大鼠肝細(xì)胞排列規(guī)則,細(xì)胞大小均一,染色均勻。模型組病變明顯,匯管區(qū)絕大部分肝細(xì)胞脂肪變性,胞漿疏松化,并可見明顯纖維組織增生,形成纖維間隔,分隔包繞肝小葉,亦見假小葉形成;靠近中央?yún)^(qū)的肝細(xì)胞索排列極紊亂,肝竇變窄;非實質(zhì)細(xì)胞增生明顯。PQQ干預(yù)組大鼠肝組織病變程度明顯較模型組輕,纖維組織增生程度與模型組相比明顯減輕,罕見假小葉形成。

圖1 大鼠肝組織切片(HE染色,10×10)Fig.1 Histological section of SD rat liver(HE staining,10×10)

圖2 大鼠肝組織切片(VG染色,10×10)Fig.2 Histological section of SD rat liver(VG staining,10×10)

表3 各組肝組織中膠原纖維增生情況(±s,n=8)Tab.3 The proliferation degree of collagenous fibers in the liver(±s,n=8)

表3 各組肝組織中膠原纖維增生情況(±s,n=8)Tab.3 The proliferation degree of collagenous fibers in the liver(±s,n=8)

與正常對照組比較:1P＜0.01;與模型組比較:2 P＜0.051 P＜0.01 vs control group;2P＜0.05 vs pathological group

組別 RCC/% 數(shù)量/只-++++++正常對照組 1.5±0.3 8 0 0 0模型組 14.8±3.11 0 2 4 2 PQQ干預(yù)組 8.6±2.21、2 0 5 2 1

4 討 論

肝纖維化形成和發(fā)展是一個極其復(fù)雜的過程,現(xiàn)已經(jīng)證實自由基脂質(zhì)過氧化起著重要作用。肝內(nèi)氧化及抗氧化體系的失衡引起氧化應(yīng)激是肝纖維化形成和發(fā)展的重要原因之一。SOD是機(jī)體重要的抗氧化系統(tǒng)成員,它能抑制自由基啟動的脂質(zhì)過氧化,其變化可間接反映疾病情況下自由基的變化。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,可嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致細(xì)胞腫脹,壞死,其含量反映了組織過氧化的損傷程度,SOD和MDA的聯(lián)合應(yīng)用,既反映了機(jī)體清除氧自由基的能力,又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。有研究顯示肝纖維化程度與MDA呈正相關(guān),而與SOD、過氧化氫酶、維生素E呈負(fù)相關(guān)[6]。肝硬化時血清透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、MDA的含量隨著肝功能分級的加重而升高,SOD因消耗而降低[7]。在肝纖維化狀態(tài)下血清及肝組織中 T-AOC、SOD均表現(xiàn)為活性降低,MDA均顯著升高。說明肝功能不全、肝纖維化時,機(jī)體的抗氧化功能明顯減弱。

很多研究顯示適當(dāng)補(bǔ)充抗氧化劑,可通過影響體內(nèi)氧應(yīng)激狀態(tài),降低體內(nèi)自由基的水平,能夠有效減輕脂質(zhì)過氧化,繼而影響到肝星狀細(xì)胞的激活和膠原基因的表達(dá),使膠原蛋白減少分泌,減輕肝纖維化的程度。動物體內(nèi) PQQ可作為一種新型的B族維生素參與機(jī)體代謝、促進(jìn)生長發(fā)育[8],動物模型研究顯示 PQQ具有促神經(jīng)生長因子產(chǎn)生,修復(fù)離斷或損傷神經(jīng)功能[9]。國外許多研究發(fā)現(xiàn) PQQ能直接清除活性氧自由基,同時調(diào)動了其它自由基清除系統(tǒng),保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受自由基攻擊,促進(jìn)損傷組織器官的修復(fù)[10]。本研究結(jié)果顯示,PQQ干預(yù)組TAOC、SOD活性與模型組比較明顯升高,MDA含量降低,而且從肝組織結(jié)構(gòu)觀察,PQQ干預(yù)組大鼠纖維化程度明顯較模型組大鼠低。提示在肝纖維化大鼠模型中,PQQ有清除活性氧及抗脂質(zhì)過氧化作用,能夠拮抗 CCl4的毒性,降低纖維化程度。

本研究初步顯示了PQQ能通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力,保護(hù)機(jī)體免受自由基攻擊,發(fā)揮抗肝纖維化的作用。肝纖維化的形成是以肝損傷為起點,激活肝內(nèi)的巨噬細(xì)胞,使其釋放各種細(xì)胞因子。釋放的細(xì)胞因子進(jìn)一步激活靜息狀態(tài)的肝星狀細(xì)胞,發(fā)生活化、增殖及分化,產(chǎn)生致纖維化的因子和Ⅰ、Ⅲ型膠原等。這是一個多環(huán)節(jié),多因素的過程,涉及到多條信號傳導(dǎo)通路。進(jìn)一步研究 PQQ在肝纖維化形成及發(fā)展中的作用機(jī)制,將為臨床抗纖維化治療提供新的思路。

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