桔青霉發(fā)酵制備核酸酶P1研究進展

喻 晨，趙 劼，張亞雄，朱昌雄，姚 鵑，李知洪

（1.三峽大學生物工程重點實驗室，湖北宜昌443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003）

桔青霉發(fā)酵制備核酸酶P1研究進展

喻 晨1，趙 劼2，張亞雄1，朱昌雄2，姚 鵑2，李知洪2

（1.三峽大學生物工程重點實驗室，湖北宜昌443002；2.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003）

核酸酶P1是一種重要的工業(yè)酶制劑，可用于水解核酸生產(chǎn)5’-核苷酸。本文綜述了利用桔青霉發(fā)酵得到核酸酶P1的菌種選育、培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵工藝控制、濃縮、相關應用和國內(nèi)外市場狀況。

核酸酶P1，桔青霉，發(fā)酵法

核酸酶P1（Nuclease P1），又名5′-磷酸二酯酶，其作用為水解核酸中的3′，5′-磷酸二酯鍵得到四種5′-核苷酸。核苷酸是生物體內(nèi)重要的低分子化合物，具有許多生理功能，目前，隨著在嬰幼兒奶粉及保健品領域的廣泛應用，核苷酸市場變得越來越大。核酸酶P1在核苷酸工業(yè)化生產(chǎn)中起著至關重要的作用。從目前的研究和工業(yè)化現(xiàn)狀來看，核酸酶P1主要通過桔青霉（Penicillium citrinum）發(fā)酵和麥芽根提?。?］兩種途徑生產(chǎn)，但由于麥芽根中可能含有的N-甲基大麥芽堿、亞硝胺、展青霉毒素、米曲霉毒素和蕁麻青霉菌毒素等物質(zhì)對人體有害，同時麥芽根提取酶活水平較低，原酶液酶活為300U/mL［2］，而且受麥芽根本身品質(zhì)影響較大，目前，麥芽根提取核酸酶P1技術在工業(yè)化生產(chǎn)中沒有任何優(yōu)勢；桔青霉發(fā)酵生產(chǎn)核酸酶越來越受到酶制劑工業(yè)的重視，此外，研究表明桔青霉產(chǎn)生的核酸酶P1在酵母抽提物生產(chǎn)中參與酵母產(chǎn)品風味的提高，對操作工人和消費者是安全的［3］。目前，有關桔青霉發(fā)酵產(chǎn)核酸酶P1的研究主要集中在以下幾個方面。

1 核酸酶P1性質(zhì)研究

核酸酶P1的分子量約為24000，由331個氨基酸多肽單鏈構成，含有2個二硫鍵，并含有3個鋅原子，酶分子含17.4%的碳水化合物（圖1）。

圖1 核酸酶P1結構［4］

核酸酶P1的溫度適用范圍比較廣，是一種熱穩(wěn)定酶，在45～95℃均有催化活性。其最適酶反應溫度為70℃［5］。最適pH因底物而異，一般在pH5～8都有較強的活性。核酸酶P1的最適pH還與溶液中的離子種類和離子強度有關。對于酵母核酸而言，此酶的最合適pH為5.0左右。郭春香［5］等人研究了金屬離子對核酸酶P1催化活性的影響，其結果表明Ti3+、Ce3+在濃度大于 10-3mol/L時，Mn2+、Fe2+、Co2+、Cu2+和Pd2+在濃度10-3～10-5mol/L的范圍時均表現(xiàn)出明顯抑制作用。Mg2+和Ca2+對酶活略有促進的效果［6］（見圖2）。

Zn2+在10-2～10-6mol/L的濃度范圍對該酶的酶活有激活作用，這與核酸酶P1的結構（見圖1）有關，研究表明，核酸酶P1分子結構中含有3個鋅原子，各個鋅原子作用如下［7］：鋅I主要參與維持酶的三級結構從而確保酶與大分子底物如RNA的結合。鋅II用于活性構象的維護。通過圓二色譜在遠紫外區(qū)檢測發(fā)現(xiàn)，鋅I和鋅II并不參與維護二級結構，鋅III主要起維持完整二級結構的決定性作用。

核酸酶P1在部分有機溶劑中，如甲基酰氨、二甲亞砜存在時仍有較高的酶活，在低濃度的變性劑環(huán)境中酶活有一定提高。B.N.Gangadhara［8］等人研究核酸酶 P1在低濃度的尿素（1mol/L）和鹽酸胍（0.5mol/L）條件下酶的活性可以提高3～4倍（見圖3）。

圖2 不同金屬離子對核酸酶活性的影響［5］

圖3 有機溶劑濃度對核酸酶P1活性的影響［7］

2 核酸酶P1的發(fā)酵研究

目前利用桔青霉發(fā)酵法生產(chǎn)核酸酶P1的研究主要集中在高產(chǎn)菌株選育、發(fā)酵工藝優(yōu)化和酶的分離純化濃縮工藝等三個領域。

2.1 菌種選育研究

桔青霉菌種誘變主要采用物理和化學方法，通過物理和化學手段對生物體DNA產(chǎn)生影響，使其發(fā)生變異，得到高產(chǎn)突變菌株。洪亦武［9］等人分別對桔青霉菌種（AS3.2788和AS3.2833）采用紫外線、硫酸二乙酯、亞硝基胍作為誘變劑誘變，發(fā)現(xiàn)亞硝基胍和紫外線作誘變劑效果較好，二者復合誘變效果更佳，采用0.5mg/mL的亞硝基胍處理60min，再經(jīng)紫外線處理60s，對出發(fā)菌株的致死率達到90%，篩選得到了3株高產(chǎn)菌株，酶活達到345U/mL。李科德等人［10］以桔青霉菌株（ATCC14994）為出發(fā)菌株，也采用紫外線與亞硝基胍相結合的方法多次誘變育種，獲得1株高產(chǎn)菌株，酶活達到1329U/mL。

此外，一些新的誘變方式也有報道，蘇龍［11］等人對桔青霉進行微波誘變得到1株核酸酶高產(chǎn)菌株，采用脈沖頻率為2450MHz，功率800W的微波爐，分別對相同濃度和體積的單孢子懸液進行輻射處理，使誘變菌株產(chǎn)酶水平由 667.50U/mL提高到1228.20U/mL，提高了84%。

離子束注入技術是20世紀80年代初材料學中興起的一項高新技術，近幾年逐漸引入到微生物育種［12］。吳永宏［13］采用氮離子束注入對桔青霉 M02進行誘變，確定最佳注入能量為20keV，最佳注入劑量20×1014N+·cm-2，篩選出5株正突變株，發(fā)酵酶活比出發(fā)菌種提高了61%。南京工業(yè)大學應漢杰等人也通過離子束注入對桔青霉菌種進行誘變研究，控制離子注入室的真空度2×10-2～2×10-8，注入能量為0.1～1000keV，劑量為5×1013～500×1013ions· cm-2·s-1，低能離子為N+、Ar+、O6+或C6+，最終獲得了高產(chǎn)核酸酶P1的桔青霉菌株（CGMCC No.2014），采用三級放大發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵終點酶活達到5800U/mL［14］，這也是目前已有報道中見到的最高產(chǎn)酶菌株。

2.2 發(fā)酵工藝研究

從已有文獻來看，目前利用桔青霉發(fā)酵生產(chǎn)核酸酶P1的方式主要有液體深層發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵和固定化細胞培養(yǎng)的方法。

2.2.1 固態(tài)發(fā)酵法 微生物在具有一定溫度和濕度的固體培養(yǎng)基的表面生長、繁殖、代謝的發(fā)酵過程稱作為固態(tài)發(fā)酵。以麩皮為培養(yǎng)基培養(yǎng)桔青霉，操作簡單，成本低，能得到較高酶活的粗酶液。蘇慶輝［1］利用麩皮固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)核酸酶P1，酶活可以達到500U/mL。但是，由于發(fā)酵周期長，占用空間大，且發(fā)酵過程中孢子污染環(huán)境，同時由于麩皮成分非常復雜，要想獲得純的核酸酶P1較為困難和繁瑣。因而，該生產(chǎn)工藝基本沒有被生產(chǎn)廠家采用。

2.2.2 液體深層發(fā)酵法 液體深層發(fā)酵主要研究培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝控制策略。李科德［2］等人對高產(chǎn)核酸酶P1的桔青霉進行了培養(yǎng)基中碳源、氮源、磷源成分篩選，確定了以蔗糖為碳源、酵母膏和蛋白胨為復合氮源、KH2PO4和K2HPO4為復合磷源的培養(yǎng)基。并通過正交實驗得出對酶活的影響順序為蔗糖＞酵母膏+蛋白胨＞MgSO4+ZnSO4＞KH2PO4+ K2HPO4。徐正軍［15］采用中心組合設計對碳源、氮源、磷源進行優(yōu)化以最大限度地提高核酸酶P1的發(fā)酵水平，結果表明，最優(yōu)的碳、氮源組成為葡萄糖3.87%、蛋白胨0.191%、玉米漿0.184%，此時的核酸酶P1的產(chǎn)酶水平最高，模型預測值可以達到661.1U/mL，驗證實驗酶活達到648.3U/mL，比優(yōu)化前提高了70%。此外，金屬離子對桔青霉菌體產(chǎn)酶也有顯著影響，其中，Zn2+對酶活影響較大［16］，研究表明0.04%鋅離子濃度對于核酸酶P1的生成和激活有重要作用。婁永江等人［17］對發(fā)酵培養(yǎng)基中的金屬離子種類進行了研究，得出低濃度的Zn2+能使酶活提高20%左右，F(xiàn)e2+、Sn2+也能小幅提高酶活，在高濃度的 Fe3+、Mn2+、Pb2+下酶活被抑制，Ca2+、Mg2+、 Na+、K+、對菌體產(chǎn)酶影響不大。

梁劍光［18-19］等對桔青霉發(fā)酵的工藝條件進行了相關研究，結果表明，種齡24h，接種量10%，初始pH6.5條件下，較高的發(fā)酵溫度下產(chǎn)酶最高點明顯提前，而在較低溫度下，發(fā)酵周期延長，但有利于菌體產(chǎn)酶。王端好等人［20］研究了溶氧對桔青霉發(fā)酵產(chǎn)核酸酶的影響，發(fā)現(xiàn)搖瓶裝液量為20%時，搖床轉速為180r/min，產(chǎn)酶最好，表明菌體產(chǎn)酶需要較高的溶氧。徐正軍［21］等人利用30L氣升式發(fā)酵罐研究了桔青霉產(chǎn)酶的發(fā)酵動力學，結果表明，核酸酶P1是不完全伴隨菌體生物量生長的產(chǎn)出產(chǎn)物，屬于部分耦聯(lián)，其發(fā)酵過程屬于部分耦聯(lián)型發(fā)酵（圖4）。

圖4 桔青霉發(fā)酵過程中產(chǎn)酶與生物量的關系［21］

此外，梁劍光等在研究中也發(fā)現(xiàn)，核酸酶P1的產(chǎn)酶量和菌體的生長關系不大，但是卻與菌體的生長速率有著一定的相關性，當菌體處于快速生長期時，其產(chǎn)酶也相應進入快速期［19］。

2.2.3 固定化菌體培養(yǎng) 固定化微生物技術是指用物理或化學方法將游離微生物細胞、動植物細胞、細胞器或酶限制或定位在某一特定空間范圍內(nèi)，保留其固有的催化活性，并能被重復和連續(xù)使用的技術［22］。其優(yōu)點在于培養(yǎng)生物密度高、反應迅速、生物流失量少、反應控制容易［23］。固定化細胞技術的關鍵是所用載體材料的性能［24］。夏黎明［25］利用吸附固定在多孔聚酯載體上的桔青霉菌絲生產(chǎn)核酸酶，酶活可高達513.3U/mL，其產(chǎn)酶效率是游離菌絲的3.6倍，而葡萄糖和蛋白陳的用量僅為游離菌絲產(chǎn)酶的1/5，連續(xù)生產(chǎn)28批（56d），產(chǎn)酶水平?jīng)]有下降，平均酶活達到507U/mL。煙臺大學王克明［26］等人通過使用雙載體固定化桔青霉產(chǎn)核酸酶，先使用玉米芯顆粒吸附桔青霉孢子，再用質(zhì)量分數(shù)為1.5%的海藻酸鈉包埋吸附固定化細胞玉米芯顆粒，培養(yǎng)50h后，發(fā)酵液中核酸P1的活力高達503U/mL。河南工業(yè)大學宋威［27］等人采用復合載體固定化細胞的方法，研究不同的材料和材料間不同配比對酶活力的影響，最終得出聚乙烯醇與海藻酸鈉比例為2∶1的復合載體固定桔青霉的孢子，連續(xù)發(fā)酵20個周期后，生產(chǎn)的核酸酶P1酶活力損失不大，始終保持在468.3～501.4U/mL。

復合載體作為一種新的固定化載體，突顯出機械強度大，使用壽命長等優(yōu)點。同時固定化細胞培養(yǎng)方式解決了液體深層發(fā)酵成本高的問題，重復利用率高，具有很好的工業(yè)應用價值。

2.3 酶的分離純化與濃縮工藝研究

呂浩［28］等人將桔青霉發(fā)酵液通過硫酸銨分級沉淀、凝膠層析和離子交換纖維素層析等生化分離步驟，核酸酶 P1的比活力為711U/mg，純化倍數(shù)為1500。廖紅東［29］對桔青霉發(fā)酵液經(jīng)離心、超濾、硫酸銨鹽析、透析和DE-52型樹脂柱色譜分離，純化得到核酸酶P1，比酶活為28490U/mg，純化10.5倍。張一平［30］等采用超濾和鹽析技術，對麥芽根浸提液中核酸酶P1進行純化，酶活比初始提高了15倍，達到1500U/mL，其研究創(chuàng)新地將超濾和鹽析技術相結合，對桔青霉發(fā)酵中核酸酶P1的純化濃縮有指導意義。

3 核酸酶應用研究

目前，核酸酶P1主要是用于酵母核酸水解，一般最適反應溫度在70℃左右，pH6.5，水解時間4～5h。鄧義熹［2］等人研究得出，在3%底物濃度下，加入5%的用酶量，反應2h時補加核酸底物，可以提高酶的利用率，酶解率維持在85%以上。而酶解反應中隨著產(chǎn)物的增加，酶促反應速率也相應地受到影響。楊大令［31］等人在制備5′-核苷酸設備研究中采用了新型的分體式中空纖維酶膜反應器。其優(yōu)點在于反應中形成產(chǎn)物可透過膜分離出來，酶則繼續(xù)參與反應循環(huán)往復，從而提高酶解率，通過優(yōu)化，當核酸底物濃度為2%時，核酸酶P1濃度為100mg/L，pH為5.2，溫度為65℃，過膜壓力為0.1MPa，反應5h酶解率可達85%。

此外還可以通過固定化酶技術來提高酶水解率，邵衛(wèi)祥［32］等人采用磁性納米顆粒與酶蛋白共沉淀后經(jīng)戊二醛交聯(lián)的方法，制備了磁性交聯(lián)核酸酶P1聚集體，結果表明：磁性交聯(lián)核酸酶P1聚集體在熱穩(wěn)定性，耐酸堿性均優(yōu)于游離酶，重復操作性穩(wěn)定，游離酶和磁性交聯(lián)核酸酶P1聚集體的Km值分別為7.27、30.7mmol/L，最適反應溫度分別為75、90℃，最適 pH均為 5.2，連續(xù)使用 6次酶解率仍有70%。

4 展望

隨著我國核酸工業(yè)化的不斷推進，核酸酶P1在核苷酸工業(yè)生產(chǎn)中起到的重要作用，使核酸酶P1的需求量也越來越大。而我國國內(nèi)核酸酶P1生產(chǎn)廠家不多，造成核酸酶P1供應緊缺，目前市場來源主要依靠國外進口。由此可見，該酶市場前景巨大。我國核酸酶P1的開發(fā)和生產(chǎn)以及相關應用研究還須進一步加深。

［1］蘇慶輝，馬興勝，袁艷玲，等.5′-磷酸二酯酶的提?。跩］.釀酒，2004，31（1）：88-90.

［2］鄧義熹，趙劼，張亞雄，等.麥芽根提取5′-磷酸二酯酶對RNA酶解工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2010（1）：207-209.

［3］Mitsuru Kondo，Susumu Nishimura，Noriho Tanaka，et al. Safety Evaluation of Phosphodiesterase Produced from Penicillium citrinum Summary of Toxicological Data［J］.Regulatory Toxicology and Pharmacology，2001，33：2-11.

［4］A Volbeda，A Lahm，F(xiàn) Sakiyama，et al.Crystal structure of Penicillium citrinum P1 nuclease at 2.8 A resolution［J］.The EMBO Journal，1991，10（7）：1607-1618.

［5］郭春香，邵昌平，郭和夫.金屬離子對核酸酶P1催化水解RNA反應的影響及其機理探討［J］.催化學報，1992，13（4）：316-319.

［6］Guo-Qing Ying，Shi Lu-E，Yiyu，et al.Production，purification and characterization of nuclease P1 from Penicillium citrinum［J］.Process Biochemistry，2006，41：1276-1281.

［7］Kyuji Rokuguawa，Masao Fujimoto，Akira Kuninaka，et al. The Role of Zinc in NucleaseP1［J］.Agric Biol Chem，1980，44：1987-1988.

［8］ Gangadhara B N，KumarParigiRamesh，Prakash Vishweshwaraiah.Enhancement of nuclease P1 activity in low concentration ofdenaturants［J］.Enzyme and Microbial Technology，2008，43：336-342.

［9］洪亦武，曹郁生，黃燕方，等.核酸酶P1產(chǎn)生菌的誘變選育［J］.江西科學，1995，13（4）：224-228.

［10］李科德，韓木蘭，柏建玲，等.5′-磷酸二酯酶高產(chǎn)菌株的選育和發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化［J］.微生物學雜志，2001，21（3）：28-30.

［11］蘇龍，陳顯玲.微波誘變選育核酸酶P1高產(chǎn)菌株［J］.中國釀造，2008（5）：62-63.

［12］陳義光，李銘剛，徐麗華，等.新型物理誘變方法及其在微生物誘變育種中的應用進展［J］.長江大學學報：自科版，2005（5）：46-68.

［13］吳永宏.酶法水解DNA制備5′-脫氧核甘酸的研究［D］.南京工業(yè)大學，2005.

［14］應漢杰，楊蘊毅，賀沁婷，等.一株高產(chǎn)核酸酶P1的桔青霉菌及其選育方法［P］.200710022932，2007-11-07.

［15］徐正軍，肖林平，呂浩，等.實驗設計法優(yōu)化核酸酶P1的發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.過程工程學報，2003，3（5）：433-437.

［16］陳珊珊，曹劍紅.Zn2+對5′-磷酸二酯酶活性的影響［J］.福建醫(yī)藥雜志，1994，16（3）：49.

［17］婁永江，吳漢民，王海洪.從桔青霉M71生產(chǎn)核酸酶P1及酶活提高途徑的研究［J］.寧波大學學報，1997，20（3）：21-27.

［18］梁劍光，黃鵬，徐正軍.桔青霉發(fā)酵法生產(chǎn)核酸酶P1工藝條件及影響因素研究［J］.中國釀造，2007（11）：27-30.

［19］梁劍光，黃鵬，徐正軍.呈味酶制劑-核酸酶P1發(fā)酵生產(chǎn)工藝初試［J］.中國調(diào)味品，2007（6）：70-73.

［20］王端好，周河治，張小里.桔青霉生產(chǎn)核酸酶的發(fā)酵條件研究［J］.生物加工過程，2008，6（2）：33-37.

［21］徐正軍，呂浩，何明芳，等.氣升式發(fā)酵罐生產(chǎn)核酸酶P1發(fā)酵過程的動力學［J］.南京工業(yè)大學學報，2004，26（2）：28-32.

［22］夏冰，趙全升，曲洋.固定化微生物技術及其載體在污水處理中的研究進展［J］.科技信息，2010（1）.

［23］王芳，李進，魯敏.固定化微生物技術的發(fā)展及其在印染廢水處理中的應用［J］.紡織科技進展，2010（1）：28-30.

［24］陳娜麗，馮輝霞，王冰，等.固定化細胞載體材料的研究進展［J］.化學與生物工程，2009（10）：13-17.

［25］夏黎明.固定化桔青霉產(chǎn)生核酸酶P1的研究［J］.微生物學報，1998，28（6）：449-453.

［26］王克明.雙載體固定化桔青霉產(chǎn)生核酸酶P1的研究［J］.中國糧油學報，1999，14（5）：44-46.

［27］宋威，張芹，李歡慶，等.復合載體固定化細胞發(fā)酵生產(chǎn)核酸酶P1的對比研究［J］.河南工業(yè)大學學報，2008，29（3）：51-54.

［28］呂浩，應漢杰.核酸酶P1的純化和酶學性質(zhì)研究［J］.南京工業(yè)大學，2002，24（6）：66-69.

［29］廖紅東，莫曉燕，宋威.核酸酶P1的分離純化及部分酶學性質(zhì)研究［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005，36（9）：536-538.

［30］張一平，華洵璐，李靖，等.高活力5′-磷酸二酯酶制備及水解RNA的研究［J］.生物技術，2010（1）：62-65.

［31］楊大令，吳迪，張守海，等.分體式中空纖維酶膜反應器制備5′-核苷酸的研究［J］.食品工業(yè)科技，2007，28（11）：167-169.

［32］邵衛(wèi)祥，莫曉燕，李黎.磁性交聯(lián)核酸酶P1聚集體的制備及性質(zhì)研究［J］.西安交通大學學報，2008，42（8）：1035-1039.

Advances on the nuclease P1 fermented by Penicillium citrinum

YU Chen1，ZHAO Jie2，ZHANG Ya-xiong1，ZHU Chang-xiong2，YAO Juan2，LI Zhi-hong2
（1.Key Laboratory of Bio-engineering，China Three Gorges University，Yichang 443002，China；2.Angel Yeast Co.，Ltd.，Yichang 443003，China）

Nuclease P1 is an important industrial enzyme，it can be used for hydrolyzing nucleic acid to produce 5′-nucleotide.The strain selection，medium optimization，fermentation processcontrol，concentration，related applications and domestic and international market conditions of nuclease P1 produced by Penicillium citrinum were reviewed.

nuclease P1；Penicillium citrinum；fermentation

Q814.4

A

1002-0306（2010）11-0416-04

2010-06-28

喻晨（1985-），男，碩士研究生，研究方向：微生物代謝工程。