木聚糖酶對玉米芯酶水解過程的影響

邢 玲，江 華

（南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇南京210037）

木聚糖酶對玉米芯酶水解過程的影響

邢 玲，江 華*

（南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，江蘇南京210037）

研究了稀酸預(yù)處理過的玉米芯酶水解過程中，木聚糖酶的補充對葡萄糖、木糖得率的影響。結(jié)果表明：玉米芯的酶水解過程中，添加適量的木聚糖酶，可提高葡萄糖和木糖的生成速度，但是，酶解24h之后，木聚糖酶的這種強化作用基本消失，此時葡萄糖和木糖生成速度基本上與初始酶用量無關(guān)。在總蛋白質(zhì)含量不變的情況下，采用含等量蛋白質(zhì)的纖維素酶和木聚糖酶所構(gòu)成的混合酶系，明顯地比單一等量蛋白質(zhì)的纖維素酶提高了單位蛋白質(zhì)的產(chǎn)糖率，有利于降低酶解成本。在纖維素酶量為5～35FPU/g（干原料）范圍內(nèi)，適宜的木聚糖酶添加量為60IU/g（干原料）；在其他條件相同情況下，分別采用35FPU/g（干原料）的纖維素酶和混合酶系［15FPU/g（干原料）的纖維素酶與60IU/g（干原料）木聚糖酶混合］時，72h時的糖得率（葡萄糖和木糖）幾乎相等，因此，采用纖維素酶和少量的木聚糖酶的混合酶系可明顯地降低纖維素酶的使用量，降低酶解成本。

木聚糖酶，纖維素酶，玉米芯，強化作用

隨著經(jīng)濟的持續(xù)增長，能源的需求不斷攀升，化石能源的漸趨枯竭，人們越來越認識到尋求清潔、可再生能源的迫切性。燃料乙醇是重要的可再生能源之一，過去，世界上許多國家的燃料乙醇的生產(chǎn)均以糖類或糧食為原料，燃料乙醇的產(chǎn)量受到糧食資源的限制，難以長期滿足人類對能源的需求［1］?？稍偕闹参锢w維（包括各種農(nóng)林廢棄物）是生產(chǎn)燃料乙醇的重要原料之一，但是，從技術(shù)和經(jīng)濟方面來說，植物纖維原料制備燃料乙醇工業(yè)化推廣條件尚不成熟［2］。其中最為關(guān)鍵的技術(shù)之一是將植物纖維降解為可發(fā)酵的單糖。目前認為酶法水解植物纖維是有效利用植物纖維的重要手段，然而，天然狀態(tài)的植物纖維很難被酶降解，為此，在酶水解之前，常常采用物理、化學(xué)或二者組合方法對植物纖維進行預(yù)處理。酸法預(yù)處理是研究最多的方法之一，這種預(yù)處理過程溶出了大部分的半纖維素，破壞了植物纖維的原始結(jié)構(gòu)，增加酶對底物的可及性，提高了酶解效率［3-4］。然而，劇烈的預(yù)處理導(dǎo)致半纖維素轉(zhuǎn)化為一系列的副產(chǎn)物，它們會抑制后續(xù)糖的發(fā)酵，或者增加后續(xù)的分離工藝難度；同時降低了植物纖維的利用效率。較為緩和的預(yù)處理可明顯減少這些副產(chǎn)物的生成，有利于后續(xù)糖的發(fā)酵和植物纖維的高效利用，降低生產(chǎn)成本，但是，預(yù)處理條件緩和，半纖維素去除率下降，降低了纖維素酶對底物的可及性，為了消除半纖維素對纖維素酶的空間阻礙，可在纖維素酶水解植物纖維的過程中添加適當(dāng)量的半纖維素酶，以便促進纖維素酶的水解速度，提高水解效率，同時有利于提高植物纖維利用率，簡化生產(chǎn)工藝［5-6］。本文采用較溫和的預(yù)處理條件（0.1%的稀硫酸浸漬1h、在120℃蒸煮1h）對玉米芯進行預(yù)處理，保留了其中的絕大部分半纖維素，通過添加木聚糖酶的方法，研究木聚糖酶對植物纖維原料酶水解過程的輔助作用。

表1 纖維素酶和木聚糖酶的活性測定

表2 玉米芯原料的主要成分分析

1 材料與方法

1.1 實驗材料

玉米芯 產(chǎn)自蘇北，粉粹至1～3mm；羧甲基纖維素（CMC） 天津柯密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，分析純；微晶纖維素 上海源聚生物科技有限公司，分析純；水楊苷 陜西慧科植物開發(fā)有限公司，分析純；樺木木聚糖、Trichoderma reesei纖維素酶 sigma公司；Trichoderma viride木聚糖酶 Fluka公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米芯的預(yù)處理與成分分析

1.2.1.1 預(yù)處理 粉碎過的玉米芯經(jīng)0.1%（w/w）的稀硫酸浸泡1h后，120℃下蒸煮1h，過濾，清水洗滌殘渣至中性，40℃烘干備用。

1.2.1.2 原料分析 按文獻［7］進行，本文用木聚糖的含量和轉(zhuǎn)化率代表半纖維素的含量和轉(zhuǎn)化率。所得結(jié)果均為三次實驗的平均值，誤差不超過5%。

1.2.1.3 HPLC分析 采用高效液相色譜（HPLC）法分析酶解液中糖濃度。色譜分析條件如下：色譜儀：Agilent1100型高效液相色譜儀；色譜柱：Aminex HPX-87P；柱溫：80℃；流動相：脫氣超純水；流速：0.4mL/min；監(jiān)測器：折光示差監(jiān)測器；進樣量：0.5μL。

HPLC測定方法：用雙蒸水分別配制濃度為2、1、0.5、0.25g/L的葡萄糖和木糖標(biāo)準溶液；在上述色譜條件下分析；根據(jù)糖濃度和峰面積的關(guān)系繪制標(biāo)準曲線，得到標(biāo)準曲線的方程；酶解液經(jīng)HPLC分析后，經(jīng)過標(biāo)準方程的計算，得出葡萄糖和木糖濃度。

1.2.2 酶活力的測定 測定所有的纖維素酶活力、木聚糖酶活力時，還原糖的生成量均采用DNS法測定按文獻［8］進行。對實驗中使用的纖維素酶和木聚糖酶進行了活性分析，結(jié)果如表1所示。

1.2.3 玉米芯酶水解過程 稱取1.0g預(yù)處理過的玉米芯置于50mL錐形瓶中，加入一定量的纖維素酶、木聚糖酶或兩種酶的混合酶（所加入的酶量均以每克底物計算），同時再加入一定體積的0.05mol/L、pH4.8的檸檬酸-氫氧化鈉緩沖溶液，使得固液比為1∶10，放入恒溫振蕩水浴中酶解，水浴振幅為80r/min，酶解溫度為50℃。酶解一定時間后，取出、離心得上清液，將上清液稀釋一定倍數(shù)后，用HPLC分別測定其中的葡萄糖、木糖濃度。所得結(jié)果均為三次實驗的平均值，誤差不超過5%。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料分析

表2給出了未經(jīng)處理的玉米芯和稀酸預(yù)處理過的玉米芯中纖維素、半纖維素、酸溶木素和酸不溶木素以及熱水抽提物的百分含量（均為100g絕干原料為基準）。

由表2可知，玉米芯經(jīng)過0.1%稀硫酸、120℃下處理過1h之后，纖維素的含量從原來的31.02%增加到37.10%；熱水抽提物含量從9.93%降低到1.26%；半纖維素含量和木素含量幾乎沒變。對于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，半纖維素在酸性條件下最容易被水解，所以，玉米芯經(jīng)稀酸處理之后，熱水抽提物和部分半纖維素溶出，從而增加了纖維素的含量；但是由于上述預(yù)處理條件比較溫和，僅有少量的半纖維素被溶出，其溶出量正好被熱水抽提物去除量相抵消，從而使得半纖維素相對含量基本保持不變，結(jié)果表明，在這樣的預(yù)處理條件下，保留了玉米芯原料中的絕大部分的纖維素和半纖維素。

2.2 葡萄糖得率與纖維素酶用量的關(guān)系

圖1表明：當(dāng)纖維素酶量小于15FPU/g時，隨著纖維素酶量的增加，葡萄糖得率幾乎呈線性增加，而當(dāng)纖維素酶量從15FPU/g增加到25FPU/g時，糖得率的提高逐漸趨于緩慢；當(dāng)纖維素酶用量大于25FPU/g時，葡萄糖得率幾乎不再隨纖維素酶量增加而增加，維持在51.2%左右。在底物濃度一定時，纖維素酶量增加，底物活性位點與酶分子碰撞幾率增加，反應(yīng)速度加快，所以，葡萄糖得率隨之增加；但是，當(dāng)酶量增加至一定程度后，底物中活性位點被纖維素酶飽和，因此，纖維素的轉(zhuǎn)化率不再隨纖維素酶量增加而增加。

2.3 玉米芯酶水解過程中轉(zhuǎn)化率和單糖生成速度與時間之間的關(guān)系

在單一纖維素酶、纖維素酶和木聚糖酶的混合酶分別水解玉米芯過程中，葡萄糖和木糖得率以及葡萄糖、木糖生成速度與酶解時間之間的關(guān)系如圖2所示，糖生成速度是由糖濃度對時間求一階導(dǎo)數(shù)所得。

圖2 酶解過程中轉(zhuǎn)化率和糖生成速度隨時間的變化

圖2表明：無論采用單一的纖維素酶還是纖維素酶和木聚糖酶的混合酶，玉米芯酶解時纖維素和木聚糖轉(zhuǎn)化率均隨著酶解時間的延長而增加，在酶解反應(yīng)的前24h過程中，纖維素和木聚糖的轉(zhuǎn)化率增加較快。之后，轉(zhuǎn)化率的增長開始減緩，這一結(jié)果與文獻報道基本一致［12］。同時，圖2表明，采用混合酶時葡萄糖、木糖得率隨時間的變化規(guī)律與采用單一纖維素酶的類似，在纖維素酶用量為15FPU/g基礎(chǔ)上添加100IU/g木聚糖酶時，酶解72h時的葡萄糖得率從49.5%增加到63.2%，得率提高了27.5%；而木糖得率從 35.6%提高到 44.8%，得率提高了25.8%。由此可見，纖維素酶水解玉米芯過程中，添加木聚糖酶不僅提高木聚糖的轉(zhuǎn)化率，而且可以提高纖維素轉(zhuǎn)化率，因此，纖維素酶水解過程中，補充適量木聚糖酶，可增加總糖回收率，提高底物利用率。

圖2還表明，添加木聚糖酶能有效地提高糖的初始生成速度，在纖維素酶量為15FPU/g的基礎(chǔ)上添加100IU/g木聚糖酶后，葡萄糖初期生成速度從0.48g/（L·h）提高到0.96g/（L·h）；木糖生成速度從0.43g/（L·h）提高到0.72g/（L·h），再根據(jù)圖1結(jié)果，可以看出，隨木聚糖酶帶入的纖維素酶活力非常?。s為1.5FPU/100IU）不可能如此快速提高葡萄糖、木糖生成速度，因此，圖2中葡萄糖和木糖生成速度、得率的提高源于木聚糖酶的補充，這表明木聚糖酶能強化植物纖維的酶水解速度。根據(jù)原料分析可知，玉米芯半纖維素主要為木聚糖，支鏈阿拉伯糖基含量很低（HPLC分析未能測得），因此，在酶水解過程中，添加適量的木聚糖酶可加快底物中木聚糖的水解，消除木聚糖對纖維素酶的阻礙作用，增加了纖維素對纖維素酶的可及性，使得葡萄糖生成速度得以提高。

另外，從圖2還可以看出，隨著酶解反應(yīng)的進行，葡萄糖、木糖的生成速度迅速下降，而且木聚糖酶的強化作用越來越不明顯。當(dāng)反應(yīng)進行到24h時，各條件下的葡萄糖生成速度下降到0.1～0.2 g/（L·h）之間，而木糖生成速度下降到0.1g/（L·h），此時，木聚糖酶的強化作用已經(jīng)不明顯，之后，兩種糖生成速度再繼續(xù)緩慢下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能歸咎于a.產(chǎn)物抑制作用；b.底物結(jié)構(gòu)變化妨礙了酶的水解作用；c.酶組分的活力劇烈下降，至于哪方面的因素起主導(dǎo)作用，有待進一步研究。

2.4 添加等蛋白含量的木聚糖酶和纖維素酶對糖量的影響

為了考察補充木聚糖酶的經(jīng)濟性，在纖維素酶量為5FPU/g和15FPU/g的基礎(chǔ)上，分別再添加與它們蛋白含量相等的纖維素酶或木聚糖酶，對預(yù)處理過的玉米芯進行酶解反應(yīng)，48h時所產(chǎn)生的葡萄糖和木糖的質(zhì)量如圖3所示。

由圖3可見，纖維素酶用量從5FPU/g增加到10FPU/g時，酶解 48h所產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量由102.2mg提高到136.8mg；如果在5FPU/g的纖維素酶中添加與該纖維素酶等蛋白質(zhì)含量的木聚糖酶，此時48h所生成的葡萄糖質(zhì)量即提高到187.5mg，可見，添加木聚糖酶比添加等蛋白質(zhì)含量的纖維素酶多生成了37.1%的葡萄糖。纖維素酶用量從15FPU/g增加到30FPU/g時，酶解48h所生成的葡萄糖質(zhì)量從156.2mg提高到187.3mg；如果在15FPU/g的纖維素酶中添加與該纖維素酶等蛋白質(zhì)的木聚糖酶，此時48h所生成的葡萄糖質(zhì)量提高到237.5mg，可見，添加木聚糖酶比添加等蛋白質(zhì)含量的纖維素酶多生成了26.8%的葡萄糖。結(jié)果表明，在總蛋白質(zhì)含量保持不變的情況下，使用含等量蛋白質(zhì)的纖維素酶和木聚糖酶相混合所構(gòu)成的酶系時，所產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量明顯高于單純使用纖維素酶時所產(chǎn)生的葡萄糖的質(zhì)量。

圖3 在一定纖維素酶基礎(chǔ)上，添加與其等蛋白質(zhì)含量的木聚糖酶時產(chǎn)糖量

在5FPU/g的纖維素酶基礎(chǔ)上，分別添加與其等蛋白質(zhì)含量的纖維素酶和木聚糖酶，48h酶解所產(chǎn)生的木糖質(zhì)量由108.7mg分別提高到121.6mg和140.0mg，因此，添加木聚糖酶比添加等蛋白質(zhì)含量的纖維素酶多生成了15.1%的木糖。同樣，在15FPU/g的纖維素酶基礎(chǔ)上，分別添加與其等蛋白質(zhì)含量的纖維素酶和木聚糖酶，48h酶解所產(chǎn)生的木糖質(zhì)量由84.2mg分別提高到104.4mg和118.5mg，因此，添加木聚糖酶比添加等蛋白質(zhì)含量的纖維素酶多生成了13.5%的木糖。結(jié)果表明，混合酶系還促進了木糖的生成。因此，在總蛋白質(zhì)含量不變的情況下，含等量蛋白質(zhì)的纖維素酶和木聚糖酶所構(gòu)成的混合酶系的酶解效率明顯高于單一纖維素酶的酶解效率。因此，采用纖維素酶與木聚糖酶混合酶系時，單位質(zhì)量蛋白質(zhì)產(chǎn)糖量明顯提高，有利于提高纖維素的酶解效率，降低植物纖維酶水解成本。纖維素酶水解植物纖維過程中，添加適量的木聚糖酶，有利于降解底物中半纖維素，減少空間位阻，使得纖維素酶更加容易吸附于纖維素上；另外，上述結(jié)果還可看出，添加含等量蛋白質(zhì)的木聚糖酶之后，葡萄糖的生成速度比木糖生成速度提高得更快，這說明，消除底物中少量的半纖維素即可明顯提高纖維素的酶水解速率。

2.5 木聚糖酶添加量對糖得率的影響

木聚糖酶添加量對72h時葡萄糖和木糖的酶解得率的影響如圖4所示。由圖可見，隨著木聚糖酶添加量的增加，葡萄糖和木糖的得率均隨之提高，而且，在低纖維素酶量情況下，添加木聚糖酶時，木糖和葡萄糖得率提高尤為明顯，在纖維素酶量為5FPU/g基礎(chǔ)上，添加60IU/g的木聚糖酶時，葡萄糖和木糖得率從 28.4%和 28.5%提高到 48.0%和37.1%，葡萄糖和木糖得率分別提高了 69.0%和30.2%；在纖維素酶量為 35FPU/g基礎(chǔ)上，添加60IU/g的木聚糖酶時，葡萄糖和木糖得率從50.5%和37.8%提高到57.2%和41.9%，葡萄糖和木糖得率分別提高了13.3%和10.8%。同時，圖4還表明，在15FPU/g的纖維素酶基礎(chǔ)上，添加60IU/g木聚糖酶時，葡萄糖和木糖得率分別為51.3%和38.7%；而單一采用35FPU/g的纖維素酶時，葡萄糖和木糖得率分別為50.5%和37.8%，纖維素酶水解玉米芯時，添加適量的木聚糖酶有利于除去覆蓋在纖維素表面的木聚糖，增強底物中纖維素對纖維素酶的可及性，提高葡萄糖得率。但是當(dāng)木聚糖酶添加量超過60IU/g時，葡萄糖和木糖得率增加的不明顯，由于半纖維素結(jié)構(gòu)上的復(fù)雜性，單純地添加木聚糖酶很難徹底地降解底物中半纖維素、提高纖維素酶對底物中纖維素的可及性，因此過多地添加木聚糖酶時，葡萄糖得率提高并不明顯?？梢姡捎美w維素酶和少量的木聚糖酶的混合酶系，可明顯地降低纖維素酶的使用量。同半纖維素酶相比，纖維素酶活力較低［12］，因此，采用兩種酶的混合酶系，有望降低植物纖維酶水解過程的成本。這說明，植物纖維酶水解時，纖維素酶的濾紙酶活力的大小，不是決定酶水解速度的唯一因素，而與適合底物結(jié)構(gòu)的酶系組成也是決定酶水解速率不可忽視的因素之一。

圖4 木聚糖酶的添加量對葡萄糖和木糖得率的影響注：酶解反應(yīng)條件：pH4.80，反應(yīng)溫度50℃，酶解時間72h。

3 結(jié)論

3.1 玉米芯的酶水解過程中，添加適量的木聚糖酶，可提高葡萄糖和木糖的生成速度，從而提高葡萄糖和木糖的得率，但是，酶解24h之后，木聚糖酶的這種強化作用基本消失，此時葡萄糖和木糖生成速度基本上與初始酶用量無關(guān)。

3.2 玉米芯的酶水解過程中，在5FPU/g和15FPU/g基礎(chǔ)上分別添加與它們等蛋白質(zhì)含量的木聚糖酶比添加相應(yīng)量的纖維素酶多生成37.1%和26.8%的葡萄糖；而木糖多生成15.1%和13.5%。因此，在總蛋白質(zhì)含量不變的情況下，采用含等量蛋白質(zhì)的纖維素酶和木聚糖酶所構(gòu)成的混合酶系，明顯地提高了單位蛋白質(zhì)的總產(chǎn)糖率，有利于降低酶解成本。

3.3 在纖維素酶量為5～35FPU/g范圍內(nèi)，木聚糖酶的適宜添加量為60IU/g，木聚糖酶添加量超過60IU/g時，葡萄糖和木糖得率提高不顯著。采用纖維素酶和少量的木聚糖酶的混合酶系時，在保持酶解得率的條件下，可明顯地降低纖維素酶的使用量。

［1］高鳳芹，孫啟忠，刑啟明.木質(zhì)纖維素乙醇的研究進展［J］.農(nóng)業(yè)科技與信息，2009（4）：54-55.

［2］彭源德.纖維質(zhì)生物降解制備燃料乙醇研究現(xiàn)狀［J］.中國麻業(yè)科學(xué)，2009，31（1）：101-103.

［3］武琳，涂國全.玉米芯酶解糖化條件實驗研究［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，30（6）：1117-1119.

［4］杭志喜.植物纖維原料纖維素酶水解的研究［J］.化學(xué)世界，2004（7）：369-371.

［5］ALEXANDER V G，TATYANA N，et al.Design of Highly Efficient Cellulase Mixtures for Enzymatic Hydrolysis of Cellulose［J］.Biotechnology and Bioengineering，2007，97（5）：1028-1032.

［6］MICHAEL J S，KNOSHAUG E P，ADNEY W S，et al. Synergistic enhancement of cellobiohydrolase performance on pretreated corn stover by addition of xylanase and esterase activities［J］.Bioresource Technology，2007：1-4.

［7］OGRENK，BURAR，SADDLERJ，etal.Effectof hemicellulose and lignin emoval on enzymatic hydrolysis of steam pretreated corn stover［J］.Bioresource Technology，2007，98：2503 -2510.

［8］MILLER G L.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar［J］.Analyt Chem，1959，31：426-428.

［9］洪楓.里氏木霉合成木聚糖酶及制備功能性木低聚糖的研究［D］.南京林業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，1997.

［10］GHOSE T K.Measurement of cellulase activities［J］.Pure and App Chem，1987，59（2）：257-268.

［11］于兆海.里氏木霉纖維素酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)研究［D］.南京林業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006.

［12］HAYN M，STEINER W.Basic research and pilot studies on the enzymatic conversion of lignocellulosics In Bioconversion of Forest and Agricultural Plant Residues［M］.Singapore Printed，1993：39-41.

Effect of addition of xylanases on the enzymatic hydrolysis of corncob

XING Ling，JIANG Hua*
（College of Chemical Engineering，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China）

The effect of supplementation of xylanases from Trichoderma viride was investigated on the conversion of the corncob pretreated by diluted sulfuric acid.lt was shown that addition of xylanases increased the initial conversion rate of corncob into glucose and xylose，but the enhancement was insignificant after 24h.lt was demonstrated that conjugated action of cellulases and xylanases resulted in a higher final sugar production as compared to cellulases alone based on per gram of protein.lt was shown that the optimal loading of xylanses was 60lU/g（O D substrate）when cellulase loading from 5 to 35FPU/g was used during the hydrolysis of the pretreated corncob.The yields of glucose and xylose at 72h using the 35FPU/g cellulases were almost equal to those using a mixture of 15FPU/g cellulases and 60lU/g xylanases.Therefore，addition of xylanase would provide an opportunity to decrease cellulase and protein loading at the same hydrolysis extent.

xylanases；cellulases；corncob；enhancement

TS210.1

A

1002-0306（2010）11-0228-04

2009-10-13 *通訊聯(lián)系人

邢玲（1983-），女，碩士研究生，主要從事生化分離的研究。