蛹蟲(chóng)草深層培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶條件的優(yōu)化

陳慧鑫，劉曉蘭，李巍巍，時(shí) 晰，鄭喜群

（齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006）

蛹蟲(chóng)草深層培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶條件的優(yōu)化

陳慧鑫，劉曉蘭*，李巍巍，時(shí) 晰，鄭喜群

（齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006）

蛹蟲(chóng)草是名貴中藥材之一，本課題組發(fā)現(xiàn)其液體發(fā)酵物中含有較強(qiáng)的纖溶活性物質(zhì)，具有開(kāi)發(fā)成溶栓藥物的潛力。以本實(shí)驗(yàn)室已優(yōu)化的蛹蟲(chóng)草深層培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶的培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)，對(duì)蛹蟲(chóng)草深層培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶的條件進(jìn)一步優(yōu)化，并對(duì)其深層培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶過(guò)程從搖瓶條件到10L發(fā)酵罐進(jìn)行比擬放大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：蛹蟲(chóng)草深層培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶的最適培養(yǎng)條件為蔗糖2%、豆餅5%，250mL三角瓶裝液量為50mL，23℃培養(yǎng)5d，培養(yǎng)基初始pH為自然（6.0左右），接菌量為直徑1cm菌片一片（每50mL）或深層培養(yǎng)3～5d的液體菌種0.5%（V/V）；10L發(fā)酵罐在攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量為100r/min，600L/h的條件下纖溶酶活力達(dá)286.21U/mL（尿激酶單位），較搖瓶條件下的酶活力提高了3.2倍，纖溶酶對(duì)菌絲生物量的得率較搖瓶條件下提高了5.5倍。

蛹蟲(chóng)草，深層培養(yǎng)，纖溶酶，發(fā)酵罐

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris（L.）Link）又名北冬蟲(chóng)夏草，隸屬于蟲(chóng)草屬（Cordyceps），在我國(guó)的黑龍江、吉林、遼寧等省份都有野生分布［1-2］，蛹蟲(chóng)草中含有核苷類(lèi)、多糖類(lèi)等多種有效成分［3-5］，具有補(bǔ)虛損、益精氣、保肺、益腎、滋補(bǔ)強(qiáng)壯等功效［6-9］，其藥用價(jià)值可與人參和鹿茸相媲美。近年來(lái)人們對(duì)蛹蟲(chóng)草的生物學(xué)特性、藥理作用等方面進(jìn)行研究，取得了一些成果［10-12］。本課題組發(fā)現(xiàn)蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵物中含有較強(qiáng)的纖溶活性物質(zhì)，具有開(kāi)發(fā)成溶栓藥物的潛力。血栓性疾病是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病之一，其致殘率和死亡率較高［13］。目前國(guó)內(nèi)外已正式批準(zhǔn)臨床使用的溶栓藥物有鏈激酶（SK）、尿激酶（UK）、組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）等，這些藥物療效肯定，但還存在許多缺陷，且價(jià)格昂貴，因此，研制新型溶栓藥物的需求迫切。微生物種類(lèi)繁多，生長(zhǎng)迅速，是獲得溶栓劑的重要來(lái)源。日本學(xué)者在納豆中發(fā)現(xiàn)了納豆激酶（NK）［14-15］，激發(fā)了人們從微生物中尋找新型溶栓劑的熱情，幾種微生物來(lái)源的纖溶酶陸續(xù)在中國(guó)豆豉［16-17］，韓國(guó)大豆醬［18］，韓國(guó)咸魚(yú)［19］，亞洲傳統(tǒng)食品蝦醬［20］，印尼豆豉［21］等發(fā)酵食品中被發(fā)現(xiàn)。本課題組在蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵物中純化得到了兩種新的纖溶酶（專(zhuān)利“一種真菌纖溶酶及其培制方法（200810137564.4）”和“一種蛹蟲(chóng)草纖溶酶及其培制方法（200910073373.0）”），并發(fā)現(xiàn)它們的性能良好（另文發(fā)表）。目前關(guān)于大型真菌深層培養(yǎng)生產(chǎn)酶類(lèi)的研究大多局限于搖瓶條件，生產(chǎn)規(guī)模小，難以滿(mǎn)足需求，而利用發(fā)酵罐深層培養(yǎng)大型真菌生產(chǎn)酶類(lèi)產(chǎn)物未見(jiàn)報(bào)道。本文對(duì)蛹蟲(chóng)草深層培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，并在10L發(fā)酵罐中進(jìn)行比擬放大，為蛹蟲(chóng)草纖溶酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蛹蟲(chóng)草（Cordyceps militaris） 由齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院提供；改良PDA斜面/平板培養(yǎng)基 葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，瓊脂2.5%，20%土豆汁，pH自然；發(fā)酵培養(yǎng)基 蔗糖2%，豆餅5%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 深層培養(yǎng)方法 初始培養(yǎng)條件為蔗糖2%、豆餅5%，250mL三角瓶裝液量為50mL，接種量為直徑1cm菌片1片，23℃、180r/min培養(yǎng)。優(yōu)化培養(yǎng)條件的過(guò)程以初始條件作對(duì)照，每一實(shí)驗(yàn)條件做三個(gè)平行。

1.2.2 蛹蟲(chóng)草纖溶酶活力的測(cè)定 發(fā)酵液在10000r/min、4℃離心10min，取上清液10μL點(diǎn)于血纖維蛋白平板上，37℃保溫6h，測(cè)定溶圈直徑，計(jì)算面積，纖溶酶活力與溶圈面積呈正相關(guān)，由于不同批次市售尿激酶標(biāo)定活力單位存在差異，致使標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不統(tǒng)一，因此本實(shí)驗(yàn)暫采用10μL發(fā)酵液在血纖維蛋白平板上的溶圈面積表示溶栓酶活力。

1.2.3 血纖維蛋白平板制備（配制10個(gè)平板） 參照Astrup［22］方法，有所改動(dòng)，取0.25g瓊脂糖加入50mL生理鹽水中，加熱溶解后置45℃水浴中保溫30min后加入500U/mL的凝血酶500μL，混勻。取2支80mg/支血纖維蛋白原溶于50mL巴比妥鈉緩沖液（pH7.8）中，置45℃水浴中保溫5min。分別取5mL凝血酶溶液與5mL血纖維蛋白原溶液混合均勻后，快速倒入φ9cm平皿中，水平放置30min后置冰箱中備用。

1.2.4 菌絲生物量的測(cè)定 發(fā)酵液在10000r/min、4℃離心10min，沉淀物上層為菌絲體，下層為豆餅渣，將菌絲體與豆餅渣分離后用蒸餾水洗滌3次，60℃烘干至恒質(zhì)量，測(cè)菌絲體生物量。

1.2.5 KLa的測(cè)定 搖瓶條件下及10L發(fā)酵罐中的KLa測(cè)定采用亞硫酸鈉氧化法［23］。

2 結(jié)果與討論

2.1 初始培養(yǎng)條件的確定

酶的生物合成受基因和培養(yǎng)環(huán)境的雙重控制，纖溶酶作為一種誘導(dǎo)酶，底物選擇尤為重要。微生物培養(yǎng)過(guò)程中，碳源可構(gòu)成菌體及目標(biāo)產(chǎn)物的碳骨架、并可為其代謝提供能源；氮元素是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等的重要組成部分。本課題組在前期的實(shí)驗(yàn)中對(duì)5種碳源（蔗糖、葡萄糖、淀粉、麥芽糖、土豆汁）和5種氮源（大豆粉、豆餅粉、豆粕粉、豆?jié){、玉米蛋白粉）進(jìn)行了篩選，并對(duì)碳氮源的適合比例進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)考察。結(jié)果表明，以蔗糖2%，豆餅5%為培養(yǎng)基時(shí)，纖溶酶產(chǎn)量最高。

本實(shí)驗(yàn)考察了培養(yǎng)溫度（18，21，23，25，27℃）對(duì)纖溶酶產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，溫度在21～25℃范圍內(nèi)，菌體產(chǎn)酶活力變化不大，23℃時(shí)酶活略高，當(dāng)溫度低于21℃或高于27℃時(shí)，產(chǎn)酶明顯受到抑制，因此在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，只要控溫在21～25℃即可。

搖瓶培養(yǎng)過(guò)程中，在搖床轉(zhuǎn)速一定的情況下，不同的裝液量會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生較大的影響。本實(shí)驗(yàn)考察了裝液量（250mL三角瓶中裝液量為30、40、50、60、70mL）對(duì)纖溶酶產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明，在裝液量30～50mL的范圍內(nèi)，纖溶酶產(chǎn)量變化不大，裝液量超過(guò)50mL，纖溶酶產(chǎn)量則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，相同的空間裝液量大，可獲得更多的目標(biāo)產(chǎn)物，故本實(shí)驗(yàn)選取250mL三角瓶裝液量為50mL。

2.2 培養(yǎng)時(shí)間的確定

特定培養(yǎng)條件下的微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)對(duì)指導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義，可根據(jù)需要在不同時(shí)期進(jìn)行收獲。工業(yè)生產(chǎn)中一般要獲得目標(biāo)產(chǎn)物最大產(chǎn)量，還要節(jié)省生產(chǎn)成本，因此，確定最適培養(yǎng)時(shí)間意義重大。按初始培養(yǎng)條件深層培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草8d，每隔24h取樣，測(cè)定發(fā)酵液中的纖溶酶產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)纖溶酶產(chǎn)量的影響

結(jié)果表明，發(fā)酵至第3d后開(kāi)始產(chǎn)酶，到第5d時(shí)，酶活趨于穩(wěn)定，之后隨時(shí)間延長(zhǎng)，酶活沒(méi)有明顯增加。雖然第6d酶活略高于第5d，但考慮到實(shí)際生產(chǎn)效率問(wèn)題，將最適培養(yǎng)時(shí)間定為5d。

2.3 培養(yǎng)基初始pH的確定

pH對(duì)微生物的生命活動(dòng)有很大影響，其影響微生物原生質(zhì)膜所帶電荷以及某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解和電離程度，從而影響微生物對(duì)養(yǎng)分的吸收以及代謝產(chǎn)物的生成。分別用0.2mol/L及2mol/L鹽酸和氫氧化鈉逐個(gè)調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為3～10，以pH自然（6.0）做對(duì)照，培養(yǎng)條件同上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵液初始pH在5～8范圍內(nèi)，菌體產(chǎn)酶活力變化不大。低于5或高于8時(shí)，酶活明顯受到抑制，因發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為6.0左右，所以無(wú)需調(diào)整。王永敏［24］等在研究pH對(duì)蛹蟲(chóng)草菌絲體與胞外多糖得率的影響中也發(fā)現(xiàn)初始pH在6.5～8范圍內(nèi)，目標(biāo)產(chǎn)物的得率無(wú)顯著差異。微生物的代謝活動(dòng)還會(huì)改變所處環(huán)境的pH，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蛹蟲(chóng)草菌有調(diào)節(jié)環(huán)境pH能力，無(wú)論初始pH如何，培養(yǎng)環(huán)境pH都有向中性變化的趨勢(shì)，說(shuō)明蛹蟲(chóng)草菌發(fā)酵過(guò)程中可能既能發(fā)酵糖產(chǎn)生酸性物質(zhì)，也有蛋白脫羧產(chǎn)氨作用。在環(huán)境pH為堿性時(shí)，可能發(fā)酵糖產(chǎn)酸作用占主導(dǎo)；在環(huán)境pH為酸性時(shí)，可能蛋白脫羧產(chǎn)氨作用占主導(dǎo)。

圖2 培養(yǎng)基初始pH對(duì)纖溶酶產(chǎn)量及發(fā)酵終點(diǎn)pH的影響

2.4 接種量的確定

采用較大的接種量可縮短菌體生長(zhǎng)達(dá)到高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的合成提前，但如接種量過(guò)大，可能使菌體生長(zhǎng)過(guò)快，培養(yǎng)液黏度增加，溶氧不足，影響產(chǎn)物的合成；此外，接菌量過(guò)大也會(huì)導(dǎo)致前培養(yǎng)成本增加。而接菌量過(guò)低，菌體生長(zhǎng)緩慢，會(huì)嚴(yán)重影響生產(chǎn)效率，因此，適宜接菌量的確定至關(guān)重要。在基本發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別接入直徑為1cm的菌苔圓片1～5片，培養(yǎng)條件同上。結(jié)果如圖3所示。

圖3 接種量對(duì)纖溶酶產(chǎn)量的影響

結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)接菌量對(duì)菌體產(chǎn)酶影響不大，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，將接菌量定為直徑1cm菌片一片。

2.5 液體菌種接種量和菌齡的確定

工業(yè)生產(chǎn)中多將斜面保藏的菌種接入液體培養(yǎng)基中，制成二級(jí)液體種子，再利用二級(jí)種子作為深層培養(yǎng)的接種物，該法可有效地提高接種量，同時(shí)縮短菌種從固體到液體培養(yǎng)的適應(yīng)時(shí)間，縮短菌體生長(zhǎng)停滯期，從而縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率?；诖耍诨景l(fā)酵培養(yǎng)基中，分別接入深層培養(yǎng)3d的二級(jí)蛹蟲(chóng)草菌種0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%（V/V），培養(yǎng)條件同上。結(jié)果如圖4所示。

結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)考察范圍內(nèi)液體菌種的接種量對(duì)纖溶酶產(chǎn)量影響較小，各水平獲得的纖溶酶產(chǎn)量相當(dāng)。其原因可能為蛹蟲(chóng)草深層培養(yǎng)的周期較長(zhǎng)，初期因接菌量的不同而導(dǎo)致纖溶酶產(chǎn)量的差異隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而變得不明顯。較小的接菌量節(jié)約了前培養(yǎng)成本，即0.5%（V/V）較適合作為液體菌種接菌量。文庭池［25］在蛹蟲(chóng)草高產(chǎn)蟲(chóng)草菌素的深層培養(yǎng)工藝研究中發(fā)現(xiàn)接種量對(duì)蛹蟲(chóng)草的生物量和蟲(chóng)草素的產(chǎn)量只有很小的影響，此結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果相同。

圖4 液體接菌量對(duì)纖溶酶產(chǎn)量的影響

真菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)有別于細(xì)菌典型生長(zhǎng)曲線(xiàn)，可分為生長(zhǎng)停滯期、迅速生長(zhǎng)期、衰退期三個(gè)階段。在生長(zhǎng)停滯期，菌體調(diào)整酶系以適應(yīng)新的培養(yǎng)環(huán)境；迅速生長(zhǎng)期中碳、氮等元素被迅速利用，呼吸強(qiáng)度達(dá)到頂峰，一些代謝產(chǎn)物積累；衰退期中有些真菌菌絲體自溶，有毒代謝產(chǎn)物積累。確定合適生長(zhǎng)時(shí)期的液體菌種對(duì)酶生產(chǎn)意義重大。在基本發(fā)酵培養(yǎng)基中接入培養(yǎng)1～8d的液體種子（接菌量為0.5%），培養(yǎng)條件同上，結(jié)果如圖5所示。

圖5 菌種的菌齡對(duì)纖溶酶產(chǎn)量的影響

結(jié)果表明，液體菌種菌齡為3～5d時(shí)，蛹蟲(chóng)草深層培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶的量差別不大。菌齡在小于3d時(shí)，纖溶酶的產(chǎn)量是逐漸增加的；菌齡大于5d以后，纖溶酶的產(chǎn)量逐漸減少了。原因可能是3～5d的液體菌種正處于迅速生長(zhǎng)期，菌體代謝旺盛，生長(zhǎng)快速，較適合作為蛹蟲(chóng)草深層培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶的液體菌種。

2.6 10L發(fā)酵罐中試實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過(guò)優(yōu)化，蛹蟲(chóng)草在搖瓶培養(yǎng)條件下可獲得較高的纖溶酶產(chǎn)量，但搖瓶條件生產(chǎn)纖溶酶，由于其生產(chǎn)規(guī)模較小而難以滿(mǎn)足需求，因此必須將搖瓶中優(yōu)化好的深層培養(yǎng)條件在大型的設(shè)備中予以重現(xiàn)，以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。氧是好氧發(fā)酵的限制性基質(zhì)，所以氧的提供往往就成為好氧微生物代謝產(chǎn)物形成的重要影響因素。早在20世紀(jì)50年代，就有學(xué)者提出以KLa為原則進(jìn)行發(fā)酵工藝放大，并在實(shí)踐中取得了較好的結(jié)果［26］。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)KLa相同的原則進(jìn)行比擬放大，10L發(fā)酵罐在攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量分別在50r/min，700L/h；100r/min，600L/h；150r/min，500L/h下的KLa與搖瓶條件下的KLa較為接近。根據(jù)初步確定的攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量進(jìn)行實(shí)罐發(fā)酵，10L的發(fā)酵罐中裝液量為7L，其他條件同搖瓶培養(yǎng)條件，每隔12h取樣，測(cè)定纖溶酶活力，并以搖瓶的實(shí)驗(yàn)結(jié)果做對(duì)照，結(jié)果如圖6所示。

結(jié)果表明，在10L發(fā)酵罐中，攪拌轉(zhuǎn)速100r/min，通風(fēng)量600L/h的深層培養(yǎng)條件下，蛹蟲(chóng)草纖溶酶的產(chǎn)量明顯高于搖瓶條件下纖溶酶產(chǎn)量，發(fā)酵時(shí)間為108h時(shí)纖溶酶活力達(dá)到最高，在血纖維平板上的溶圈面積可達(dá)214.28mm2（相當(dāng)于尿激酶286.21U/mL），比搖瓶條件下纖溶酶溶圈面積154.74mm2（相當(dāng)于尿激酶89.26U/mL）大38.48%；在攪拌轉(zhuǎn)速50r/min，通風(fēng)量700L/h的深層培養(yǎng)條件下，蛹蟲(chóng)草纖溶酶的產(chǎn)量與搖瓶條件下纖溶酶產(chǎn)量較為接近，但未超過(guò)搖瓶條件下的纖溶酶產(chǎn)量；攪拌轉(zhuǎn)速150r/min，通風(fēng)量500L/h的深層培養(yǎng)條件下，蛹蟲(chóng)草纖溶酶的產(chǎn)量明顯低于搖瓶條件下纖溶酶產(chǎn)量。因此，在考察范圍內(nèi)，攪拌轉(zhuǎn)速100r/min，通風(fēng)量600L/h的深層培養(yǎng)條件較適合作為10L發(fā)酵罐深層培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草生產(chǎn)纖溶酶的培養(yǎng)操作條件。

表1 纖溶酶產(chǎn)量最大時(shí)纖溶酶對(duì)菌絲體的得率

圖6 10L發(fā)酵罐中不同培養(yǎng)條件對(duì)纖溶酶產(chǎn)量的影響

藥用真菌深層培養(yǎng)產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物含量相對(duì)較低，在工業(yè)化生產(chǎn)中，如果僅以一種產(chǎn)物為目的，將耗費(fèi)大量成本，因此應(yīng)開(kāi)展多產(chǎn)物聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵研究。蛹蟲(chóng)草作為高級(jí)的滋補(bǔ)品，其菌絲體具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在深層培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草生產(chǎn)纖溶酶的過(guò)程中，蛹蟲(chóng)草的菌絲體作為副產(chǎn)物可被收集加工成為保健品和滋補(bǔ)品，從而實(shí)現(xiàn)纖溶酶和蛹蟲(chóng)草菌絲體的聯(lián)產(chǎn)，提高經(jīng)濟(jì)效益，減少資源的浪費(fèi)。在10L發(fā)酵罐實(shí)罐發(fā)酵的過(guò)程中，同時(shí)監(jiān)測(cè)菌絲生物量，在保證纖溶酶產(chǎn)量的前提下，盡可能地收集蛹蟲(chóng)草菌絲，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

圖7 10L發(fā)酵罐中不同培養(yǎng)條件對(duì)蛹蟲(chóng)草菌絲生物量的影響

結(jié)果表明，在考察范圍內(nèi)，菌絲體隨攪拌轉(zhuǎn)速的增加呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，其可能的原因是隨攪拌轉(zhuǎn)速的增加，培養(yǎng)基的混合更加均勻，從而提高了蛹蟲(chóng)草對(duì)底物的的利用率，其中在攪拌轉(zhuǎn)速150r/min，通風(fēng)量500L/h的深層培養(yǎng)條件下，蛹蟲(chóng)草菌絲生物量在120h時(shí)可達(dá) 34.48g/L，比搖瓶條件下的最大值28.81g/L提高了19.68%。本課題組李春麗［27］等在蛹蟲(chóng)草深層培養(yǎng)產(chǎn)菌絲體及胞外多糖的研究過(guò)程中，實(shí)現(xiàn)了蛹蟲(chóng)草菌絲體和胞外多糖的聯(lián)產(chǎn)，并利用10L發(fā)酵罐進(jìn)行比擬放大，使菌絲體和胞外多糖的產(chǎn)量也較搖瓶條件下均有較大提高。

10L發(fā)酵罐中不同深層培養(yǎng)條件下，纖溶酶產(chǎn)量最大時(shí)，纖溶酶對(duì)菌絲體的得率如表1所示。

表1的結(jié)果表明，在10L發(fā)酵罐中，攪拌轉(zhuǎn)速100r/min，通風(fēng)量600L/h的培養(yǎng)條件下，纖溶酶的得率相對(duì)最高，較搖瓶條件下提高了5.5倍。

3 結(jié)論

本論文以蛹蟲(chóng)草為菌種，對(duì)其深層培養(yǎng)產(chǎn)生纖溶酶的部分工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，并利用優(yōu)化的工藝條件在10L發(fā)酵罐中進(jìn)行了中試實(shí)驗(yàn)，取得主要結(jié)論如下：蛹蟲(chóng)草深層培養(yǎng)產(chǎn)纖溶酶的最適培養(yǎng)條件為蔗糖2%、豆餅5%，250mL三角瓶裝液量為50mL，23℃培養(yǎng)5d，發(fā)酵液初始pH為自然（6.0左右），接菌量為直徑1cm菌片一片（每50mL）或深層培養(yǎng)3～5d的液體菌種0.5%（V/V）；10L發(fā)酵罐在攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量為100r/min，600L/h的條件下，纖溶酶的溶圈面積可達(dá) 214.28mm2，相當(dāng)于尿激酶286.21U/mL，較搖瓶條件下的酶活力提高了3.2倍，纖溶酶對(duì)菌絲生物量的得率較搖瓶條件下提高了5.5倍。

［1］邵力平.真菌分類(lèi)學(xué)［M］.北京：中國(guó)林業(yè)出版社，1984：109.

［2］Alexopoulos C J，Blackwell M，Mims C W.菌物學(xué)概論［M］.第四版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002.

［3］廖春麗，方改霞，王蓮哲，等.蛹蟲(chóng)草主要有效成分分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（12）：5050-5052.

［4］Bok J W，Lermer L，Chilton J.Antitumor sterols from the mycelial of Cordyceps sinensis［J］.Phytochemistry，1999，51：891-898.

［5］Cunningham KG，Manson W ，Spring FS，et al.Cordycepin，a Metalmlic Product Isolated from Cultures of Cordyceps Militaris（Lim·）Link［J］.Nature，1950，2166（4231）：949.

［6］連云嵐，楊中林.北蟲(chóng)草化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］.山西醫(yī)藥雜志，2006，35（1）：44-46.

［7］葉博.北蟲(chóng)草藥理作用研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)通報(bào)，2009，15（9）：52-54.

［8］張安寧，袁書(shū)林.不同劑量蛹蟲(chóng)草菌絲體對(duì)大鼠免疫功能的影響［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2009，30（3）：30-34.

［9］賓文，宋麗艷，于榮敏，等.人工培養(yǎng)蛹蟲(chóng)草多糖的抗炎及免疫作用研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2003，14（1）：1-2.

［10］劉靜明，鐘裕容，楊智.蛹蟲(chóng)草化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)中藥雜志，1989，14（10）：608-609.

［11］林樹(shù)錢(qián)，余美蘭.人工蟲(chóng)草的研究和開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀［J］.中國(guó)食用菌，1997，16（1）：5-7.

［12］劉春泉.北冬蟲(chóng)夏草多糖組分的分離純化及結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2007，28（1）：370-373.

［13］魯艷莉，寧喜斌.血栓形成機(jī)理及溶血栓藥物的研究進(jìn)展［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27（1）：169-172.

［14］Datar RV，Cartwright T，Rosen CG.Process economic of animal cell and bacterial fermentations：A case study analysis of tissue plasminogen activateor［J］.Bio/Technol，1993，11：349-352.

［15］Sumi H，Hamada H，Tsushima H，et al.A novel fibrinolytic enzyme（nattokinase）in the vegetable cheese Natto；a typical and popular soybean food in the Japanese diet［J］.Birkhauser Verlag，1987，43：1110-1111.

［16］Fujita M，Nornura K，Hong K，et al.Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme（Nattokinase）in the vegetable cheese natto，a popular soybean fermented food in Japan［J］.Biochem Biophy Res Commun，1993，197（3）：1340 -1346.

［17］Cheng T W，Bao P J，Bo L，et al.Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme of Bacillus subtilis DC33，isolated from Chinese traditional Douchi［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2006，33：750-758.

［18］Kim W，Choi K，Kim Y.Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme produced from Bacillus sp.Strain CK11-4 screened from Chungkook-Jang［J］.Applied and Environmental Microbiology，1996，62：2482-2488.

［19］Nack-Shick Choi，Jae Jun Song，Dong-Min Chung，et al. Purification and characterization of a novel thermoacid-stable fibrinolytic enzyme from Staphylococcus sp.strain AJ isolated from Korean salt-fermented Anchovy-joet［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2009，36：417-426.

［20］Wong A H K，Mine Y.A novel fibrinolytic enzyme in fermented shrimp paste.A traditional Asian fermented seasoning［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52：980-986.

［21］Seong-Bo Kim，Dong-Woo Lee，Chan-Ick Cheigh，et al. Purification and characterization of a fibrinolytic subtilisin-like protease of Bacillus subtilis TP-6 from an Indonesian fermented soybean，Tempeh［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2006，33：436-444.

［22］Astrup T，Müllertz S，et al.The Fibrin Plate Method for Estimating Fibrinolytic Activity［J］.Arch Biochem Biophys，1952，40：346-351.

［23］華南工學(xué)院，等.發(fā)酵工程與設(shè)備［M］.輕工出版社，1990：202-204.

［24］王永敏，祝文興，安立國(guó)，等.優(yōu)化條件對(duì)蛹蟲(chóng)草菌絲體與胞外多糖得率研究［J］.濟(jì)南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，24（2）：148-151.

［25］文庭池.蛹蟲(chóng)草高產(chǎn)蟲(chóng)草菌素的深層培養(yǎng)工藝研究［D］.貴陽(yáng)：貴州大學(xué)，2006.

［26］邱樹(shù)毅.生物T藝學(xué)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2009：115-119.

［27］李春麗，劉曉蘭，陳慧鑫，等.蛹蟲(chóng)草深層培養(yǎng)產(chǎn)菌絲體及胞外多糖的初步研究［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工：創(chuàng)新版，2010（2）：22-26.

Optimization of submerged culture conditions for the production of fibrinolytic enzyme with Cordyceps militaris

CHEN Hui-xin，LIU Xiao-lan*，LI Wei-wei，SHI Xi，ZHENG Xi-qun
（College of Food and Biology Engineering，Qiqihar University，Heilongjiang Key Lab of Agricuhural Product Processing，Qiqihar 161006，China）

Cordyceps militaris is one of the medicinal mushrooms.A kind of enzyme with stronger fibrinolytic activity was found in the fermentation culture fluids of Cordyceps militaris，which had potential for treating thrombus.The fermentation conditions for the fibrinolytic enzyme production with Cordyceps militaris，which based on optimized condition in our laboratory，were further investigated.And the process of the fibrinolytic enzyme production was scaled-up from 250mL flask to 10L fermentor.The results showed that the best conditions for the fibrinolytic enzyme production were 250mL flask containing 50mL medium，which was composed of sucrose2%and bean cake 5%. The fermentation time was 5d under the temperature of 23℃.Keeping the initial pH of culture medium natural condition（about 6.0）was better for the fibrinolytic enzyme production.The better inoculums size was punching out 1cm mycelia cultures into 50mL liquid fluids of 250mL flask.0.5%（v/v）liquid spawn of 3～5d was also better.The fermentation of 10L fermentor under the conditions of agitation rate 100r/min and aeration rate 600L/h got a better result for the fibrinolytic enzyme production.The area of the fibrinolytic enzyme active reached 286.21U/mL（urokinase），which was 3.2 times more than the results of flask.The yield was 5.5 times more than the results of flask.

Cordyceps militaris；submerged culture；fibrinolytic enzyme；fermentor

TS201.2+5

A

1002-0306（2010）11-0216-05

2010-08-23 *通訊聯(lián)系人

陳慧鑫（1984-），男，在讀碩士，研究方向：微生物遺傳。

黑龍江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（GB08B401-04）。