鮟鱇魚(yú)硫酸軟骨素的提取及性質(zhì)研究

張小軍，張 虹

（1.浙江工商大學(xué)，浙江杭州310035；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山316100）

鮟鱇魚(yú)硫酸軟骨素的提取及性質(zhì)研究

張小軍1，2，張 虹1，*

（1.浙江工商大學(xué)，浙江杭州310035；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山316100）

建立了從鮟鱇魚(yú)骨中提取硫酸軟骨素的方法，并對(duì)提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。樣品用20%氯化鈉堿溶液浸提，pH7.8條件除去中性蛋白，pH2.5除去酸性蛋白，然后用70%（v/v）乙醇沉淀獲得鮟鱇魚(yú)硫酸軟骨素。本方法硫酸軟骨素的得率為3.47%，所得鮟鱇魚(yú)硫酸軟骨素產(chǎn)品為白色粉末，純度為90.94%。對(duì)鮟鱇魚(yú)硫酸軟骨素的理化性質(zhì)研究表明，其水分含量為8.88%，氮含量為2.86%，氨基己糖含量為30.12%，葡萄糖醛酸含量為31.40%。從鮟鱇魚(yú)骨中提取出的硫酸軟骨素產(chǎn)品電泳實(shí)驗(yàn)顯示為單點(diǎn)，表明其為單一糖胺聚糖，紅外光譜吸收特征顯示其為硫酸軟骨素C。

鮟鱇魚(yú)，硫酸軟骨素，提取，分析

硫酸軟骨素（Chondroitin sulfate，CS）是一類糖胺聚糖（GAGs），它是由D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖以1，3糖苷鍵結(jié)合的雙糖為基本單位聚合而成的大分子多糖，根據(jù)硫酸基團(tuán)在N-乙酰-D-氨基半乳糖上的位置不同可分為硫酸軟骨素A（CS-A）、硫酸軟骨素C（CS-C）等。CS資源豐富，廣泛存在于人和動(dòng)物的骨骼、軟骨、肌腱、韌帶等組織中。CS作為一種藥物，主要用來(lái)治療關(guān)節(jié)炎和冠心?。?-2］，對(duì)神經(jīng)痛、偏頭痛、動(dòng)脈粥樣硬化等［3］也有一定療效。硫酸軟骨素傳統(tǒng)上主要從豬、牛、羊等畜類軟骨組織中提取獲得，來(lái)源和工藝［4］較為單一。近年來(lái)，海洋生物作為新的藥用資源日漸受到重視，有研究從孔鰩［5］、魷魚(yú)［6］中提取硫酸軟骨素，但對(duì)于其他海洋魚(yú)類硫酸軟骨素的研究鮮有報(bào)道。鮟鱇魚(yú)（Lophius litulon）在我國(guó)資源主要分布在黃海、渤海及東海北部，由于日本、美國(guó)等國(guó)家居民喜食鮟鱇魚(yú)，近年來(lái)出口需求旺盛，產(chǎn)量和價(jià)格均有大幅增加。鮟鱇魚(yú)經(jīng)產(chǎn)業(yè)化加工后魚(yú)肉、魚(yú)肝等用于出口，同時(shí)產(chǎn)生大量的下腳料-魚(yú)骨，有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。實(shí)際生產(chǎn)中魚(yú)骨如不加處理，會(huì)造成環(huán)境污染，同時(shí)也是對(duì)寶貴資源的浪費(fèi)。針對(duì)這一問(wèn)題，本文以簡(jiǎn)便、成本低廉的方法從鮟鱇魚(yú)骨中提取硫酸軟骨素，并研究了鮟鱇魚(yú)硫酸軟骨素的理化性質(zhì)，以提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為有效利用鮟鱇魚(yú)加工下腳料資源提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮟鱇魚(yú)骨 舟山水產(chǎn)公司提供；硫酸軟骨素A美國(guó)Sigma公司；鹽酸氨基葡萄糖、D-葡萄糖醛酸國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；對(duì)二甲氨基苯甲醛、巴比妥 上海化學(xué)試劑廠；乙酰丙酮、硫酸 優(yōu)級(jí)純；咔唑、甲苯胺藍(lán)、冰乙酸、鹽酸、十六烷基三甲基溴化銨、甲酚紅、瓊脂糖、氫氧化鈉、氯化鈉、無(wú)水乙醇均為分析純，購(gòu)自華東醫(yī)藥公司。

723分光光度計(jì) 上海第三分析儀器廠；pH計(jì)杭州華光無(wú)線電廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州科工貿(mào)有限公司；恒溫水浴箱 上海醫(yī)療器械五廠；水平電泳槽 北京市六一儀器廠；AVATAR-360型紅外光譜儀 美國(guó)尼高力公司；攪拌機(jī) 杭州儀表電機(jī)廠；離心沉淀機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠；冷凍干燥儀 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

表2 不同pH條件下鹽解除蛋白方法的比較（n=6）

1.2.1 原料處理 新鮮鮟鱇魚(yú)骨將余肉剔凈，濕骨60℃烘干后粉碎成粉末，4℃干燥保存。

1.2.2 提取工藝 浸提：取100g干骨粉加20%的NaCl溶液500mL，攪拌使其溶解，然后用10%的NaOH溶液調(diào)pH至12.5，40℃恒溫?cái)嚢杼崛?0h，提取過(guò)程中隨時(shí)校正pH至12.5。提取液過(guò)濾，濾渣在相同條件下重復(fù)提取一次，合并兩次濾液。

鹽解除蛋白：濾液用10%的HCl溶液調(diào)pH至7.8，90℃恒溫鹽解20min，迅速降溫至室溫，靜置2h，得鹽解液。鹽解液3000r/min離心10min，過(guò)濾除去中性蛋白沉淀。濾液繼續(xù)調(diào)鹽解液pH至2.5，攪拌10min，3000r/min離心10min，過(guò)濾除去酸性蛋白沉淀，然后濾液調(diào)pH至6.5，得清亮的鹽解液。

乙醇沉淀：在所得鹽解液中不斷攪拌加乙醇至溶液體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，靜置12h以上，收集沉淀用無(wú)水乙醇洗滌兩次，真空冷凍干燥得鮟鱇魚(yú)硫酸軟骨素產(chǎn)品。

1.3 分析方法

1.3.1 氨基己糖含量測(cè)定 采用衛(wèi)生部頒布藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法［7］，并根據(jù)謝繼青等人［8］對(duì)關(guān)鍵的兩步：乙酰化和顯色操作分別進(jìn)行了改進(jìn)，做到冰浴乙酰化同時(shí)計(jì)時(shí)，顯色隨加隨計(jì)時(shí)。氨基己糖含量× 2.82即為CS的含量。

1.3.2 葡萄糖醛酸含量測(cè)定 按照文獻(xiàn)方法［9］進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 氮含量測(cè)定 按照微量凱氏定氮法［10］進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 水分含量測(cè)定 按照常壓干燥法［11］進(jìn)行測(cè)定。

1.3.5 瓊脂糖電泳法分析 按照文獻(xiàn)方法［12］進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 紅外光譜分析 在400～4000cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描，KBr壓片測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝

2.1.1 不同鹽離子強(qiáng)度對(duì)CS提取率的影響 取四份100g干頭骨粉分別以15%、20%、25%的NaCl溶液對(duì)其進(jìn)行浸提，其它提取步驟均按基本提取工藝，結(jié)果如表1所示。溶液中鹽濃度對(duì)提取有很大的影響，鹽濃度較低時(shí)，離子強(qiáng)度低，造成提取不完全，同時(shí)得到的產(chǎn)品含有較多蛋白質(zhì)，造成溶解性偏低；當(dāng)鹽濃度過(guò)高時(shí)，高濃度鹽在后續(xù)工藝中造成產(chǎn)品變色，同時(shí)提取率會(huì)降低。實(shí)驗(yàn)表明，20%NaCl對(duì)CS的提取效果最好。

表1 不同濃度NaCl對(duì)CS得率和顏色的影響（n=6）

2.1.2 不同pH對(duì)除蛋白的影響 取四份經(jīng)基本工藝步驟2.1.1提取得到的浸提液，進(jìn)行如下鹽解除蛋白操作：第一份在pH7.8條件下升溫鹽解，然后離心除蛋白；第二份在pH2.5條件下升溫鹽解，然后離心除蛋白；第三份先在pH2.5條件下升溫鹽解，然后離心除蛋白，接著再調(diào)pH至7.8，再離心除蛋白；第四份先在pH7.8條件下升溫鹽解，然后離心除蛋白，接著再調(diào)pH至2.5，再離心除蛋白。Bradford染料結(jié)合法［9］測(cè)定以上除蛋白后各鹽解溶液的吸光值。

對(duì)不同pH條件處理鹽解液除蛋白的結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，采用先在pH7.8條件下升溫鹽解，然后離心除去中性蛋白，接著再調(diào)pH至2.5，再離心除去酸性蛋白的方法除蛋白效果最好。此時(shí)溶液呈澄清透明，蛋白質(zhì)含量最低，證明使用該方法可獲得較好的除蛋白效果。

2.1.3 醇沉條件的選擇 取四份100g干骨粉按基本提取工藝提取CS，在乙醇沉淀時(shí)，分別加乙醇至體系中乙醇含量分別為60%、65%、70%、75%，其結(jié)果如表3所示。由表3可知，60%乙醇沉淀CS含量最高，但得率較低，并未將硫酸軟骨素完全沉淀；75%的乙醇使溶液總體積過(guò)大，不利于收集，造成了沉淀收集時(shí)的損失從而使得率偏低；70%乙醇得到的得率最高，在該濃度條件下溶液中糖胺聚糖的沉淀效果最好。因此選擇70%乙醇沉淀糖胺聚糖，此時(shí)得率為3.52%，氨基己糖含量為26.42%。

表3 不同乙醇濃度（v/v）對(duì)提取效果的影響（n=6）

2.2 理化性質(zhì)分析

取100g鮟鱇魚(yú)骨粉按照優(yōu)化的工藝提取CS，然后測(cè)定所得CS的各項(xiàng)指標(biāo)，其結(jié)果如表4所示。結(jié)果表明，鮟鱇魚(yú)硫酸軟骨素各項(xiàng)指標(biāo)均符合衛(wèi)生部頒布藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的硫酸軟骨素指標(biāo)［7］。

表4 鮟鱇魚(yú)硫酸軟骨素的理化性質(zhì)（n=6）

2.3 瓊脂糖凝膠電泳

分別對(duì)椎骨提取所得CS和頭骨提取所得CS進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖1所示。電泳結(jié)果顯示，椎骨和頭骨所得提取物均與CS標(biāo)準(zhǔn)品一致，且均為單一的藍(lán)紫色電泳點(diǎn)，證明所得產(chǎn)品純度較高，不含其他糖胺聚糖。

圖1 鮟鱇魚(yú)硫酸軟骨素的瓊脂糖電泳圖

2.4 紅外吸收光譜

鮟鱇魚(yú)硫酸軟骨素的紅外光譜圖如圖2所示，紅外光譜在3440cm-1附近有強(qiáng)吸收，說(shuō)明有多糖羥基（-OH）；在1569、1635cm-1附近有強(qiáng)吸收，說(shuō)明有乙酰氨基（-NHCOCH3-）存在；1423cm-1附近有吸收，說(shuō)明有羧基（-COO-）存在。在1249cm-1附近有弱吸收，說(shuō)明有硫酸基（-O-SO3-）存在。以上這些紅外光譜特征與CS-C的國(guó)外報(bào)道［13］一致，表明鮟鱇魚(yú)硫酸軟骨素為硫酸軟骨素C。

圖2 鮟鱇魚(yú)硫酸軟骨素紅外光譜圖

3 結(jié)論

通過(guò)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)建立了鮟鱇魚(yú)骨中提取硫酸軟骨素的方法，為有效利用鮟鱇魚(yú)加工下腳料資源提供了新途徑。樣品用20%氯化鈉堿溶液浸提，接著在pH7.8條件除去中性蛋白，再pH2.5除去酸性蛋白，然后用70%乙醇沉淀獲得鮟鱇魚(yú)硫酸軟骨素。本方法硫酸軟骨素得率為3.47%，所得鮟鱇魚(yú)硫酸軟骨素產(chǎn)品為白色粉末，水分含量為8.88%，氨基己糖含量為30.12%，葡萄糖醛酸含量為31.40%。從鮟鱇魚(yú)骨中提取出的硫酸軟骨素產(chǎn)品電泳實(shí)驗(yàn)顯示為單點(diǎn)，表明其為單一糖胺聚糖。紅外光譜吸收特征顯示其為硫酸軟骨素C。

［1］Takanishi GC，Borst CA.Glucosamine and chondroitin in the treat—ment of osteoarthritis［J］.Women S Health Primary Care，2001，4（1）：61.

［2］Morrison LM，Enrick NL.Coronary heart disease：Reduction of death rate by chondroitin sulfate A［J］.Angiology，1973，24：269.

［3］Maksimenko A V，Golubykh V L，Tischenko EG.Catalase and chondroitin sulfate derivatives against thrombotic effect induced by reactive oxygen species in a rat artery［J］.Metabolic Engineering，2003，5：177-182.

［4］馬淑濤，張?zhí)烀?硫酸軟骨素生產(chǎn)工藝探討［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，1993，18∶348.

［5］劉坤，劉颯.孔鰩硫酸軟骨素的制備［J］.中國(guó)海洋藥物雜志，2004，99（3）：19-22.

［6］陳小娥，方旭波，余輝，等.魷魚(yú)軟骨中硫酸軟骨素的提取工藝研究魷魚(yú)軟骨中硫酸軟骨素的提取工藝研究［J］.食品科技，2008，33（12）：214-217.

［7］中國(guó)藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)二部第六冊(cè)（生化藥品第一分冊(cè)）［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1998：138-139.

［8］齊敬總，閏曉玲，王鳳山.硫酸軟骨素含量測(cè)定方法介紹［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2002，23（3）：162.

［9］凌沛學(xué).透明質(zhì)酸［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2000：41.

［10］張意靜.食品分析技術(shù)［M］.中國(guó)輕工業(yè)出版社，2001：162-163.

［11］寧正祥.食品成分分析手冊(cè)［M］.中國(guó)輕工業(yè)出版社，1998：518.

［12］張惟杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)［M］.浙江大學(xué)出版社，1994：554-556.

［13］MathewsMB，WisnerLA，IwayamaY，etal.Isomeric chondroitin sulfate［J］.Nature，1958，181：421.

Preparation and properties of chondroitin sulfate from Lophius litulon bones

ZHANG Xiao-jun1，2，ZHANG Hong1，*
（1.Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，China；2.Zhejiang Marine Fisheries Research Institute，Zhoushan 316100，China）

A method of preparation of chondroitin sulfate from Lophius litulon bones was studied.Briefly，sample were extracted with 20%NaCl，and the solution was removed neutral protein at 90℃，pH7.8，then centrifuging to remove the acidic protein again at pH2.5，finally using 70%（v/v）enthanol to deposit the CS.The yield of this method was 3.47%，and the chondroitin sulfate product was white power，the purity was 90.94%.The CS physicochemical analysis showed that the contents of moisture，nitrogen，hexosamine and uronic acid were 8.88%，2.86%，30.12%，31.40%，respectively.The results of agarose gel electrophoresis reflected that the chondroitin sulfate from Lophius litulon was purified.The lR spectrum showed that chondroitin sulfate from Lophius litulon was CS-C.

Lophius litulon；chondroitin sulfate；extraction；analysis

TS254.1

B

1002-0306（2010）12-0258-03

2009-11-11 *通訊聯(lián)系人

張小軍（1982-），男，工程師，在讀博士，研究方向：水產(chǎn)品加工及水產(chǎn)品質(zhì)量安全。