靈香草浸膏及其凈油的抗氧化活性研究

劉賢賢，張 業(yè)，覃 雯，鄒碧群，2，義祥輝，*

（1.桂林師范高等?？茖W(xué)?；瘜W(xué)與工程技術(shù)系，廣西桂林541001；2.廣西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西桂林541004）

靈香草浸膏及其凈油的抗氧化活性研究

劉賢賢1，張 業(yè)1，覃 雯1，鄒碧群1，2，義祥輝1，*

（1.桂林師范高等專科學(xué)?；瘜W(xué)與工程技術(shù)系，廣西桂林541001；2.廣西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西桂林541004）

以二苯代苦味酰自由基（DPPH·）法分別測試了靈香草浸膏及其凈油的清除自由基活性，然后利用熒光猝滅法分別研究了浸膏、凈油與Cu2+、Fe2+的螯合作用。結(jié)果表明，靈香草浸膏及其凈油均對自由基DPPH·有良好的清除作用，不同溶液的半清除濃度IC50為0.16～0.37mg·mL-1；浸膏、凈油對Cu2+、Fe2+表現(xiàn)出良好的螯合作用，凈油對Fe2+的螯合作用最強，螯合常數(shù)為3.74×102mL·mg-1，浸膏對Fe2+的螯合作用次之，螯合常數(shù)為1.56×102mL·mg-1，凈油對Cu2+的螯合作用最小，螯合常數(shù)為1.20×102mL·mg-1。研究說明靈香草浸膏、凈油具有開發(fā)成為新型功能性抗氧化劑的潛力。

靈香草，抗氧化，自由基清除活性，螯合作用

靈香草（Lysimachia foenum-graecum Hance）又名零陵香、薰香、排草等，為報春花科排草屬植物的全草，系廣西大瑤山珍貴的天然香料植物。靈香草提取物具有極其特殊的芳香氣息，且香氣持久、穩(wěn)定，屬名貴香料，被用于高檔煙的加香［1］。此外，醫(yī)藥上其可用于治療頭疼、感冒、驅(qū)蛔蟲，具有清熱、行氣、止痛、驅(qū)蟲等功效［2］。然而，盡管靈香草天然資源豐富，經(jīng)濟價值高，人們對其研究仍主要集中在靈香草化學(xué)成分的表征方面［3-4］，十八碳二烯酸、十七酸、葉綠醇等是其主要化學(xué)成分［3-4］，而抗氧化性能的研究則甚少涉及。為了考察靈香草開發(fā)成為抗氧化劑的潛力，本文對靈香草的提取物靈香草浸膏、凈油的抗氧化能力進(jìn)行測試，為功能型靈香草抗氧化劑產(chǎn)品的開發(fā)提供指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈香草浸膏 棕黑色油狀物；凈油 棕褐色油狀物，二者都易溶于水，均由廣西金秀香料香精有限公司提供，冷藏備用；其余試劑（除蒸餾水制備外）均為分析純。

TU-1901雙光束紫外可見分光度計，RF-5301熒光分光光度計，恒溫水浴鍋，冷凍設(shè)備。

表1 浸膏、凈油的紫外、熒光光譜參數(shù)

1.2 實驗方法

1.2.1 紫外、熒光吸收光譜測試 把靈香草浸膏、凈油分別配成1mg/mL的水溶液，掃描它們的紫外、熒光吸收光譜。

1.2.2 DPPH法測定抗氧化活性 對DPPH·的清除作用的測定參考文獻(xiàn)［5］。將待測靈香草浸膏、凈油提取液配制成系列溶液，分別移取各不同濃度的靈香草浸膏、凈油提取液的溶液0.1mL加入到3.9mL的DPPH·溶液中，混合均勻，30min后測其吸光度。靈香草浸膏、凈油的清除自由基能力采用半抑制濃度IC50值表示。測定待測靈香草浸膏、凈油提取液濃度與自由基清除率，并繪制自由基清除率對靈香草浸膏、凈油提取液濃度曲線，按式（1）計算IC50值。

A0與At分別代表自由基在波長為517nm時空白與樣品對其作用后的吸光度，然后作圖求出線性方程，再通過線性方程把它們對DPPH·自由基清除的半抑制濃度IC50計算出來。

1.2.3 螯合作用測定 分別將靈香草浸膏、凈油配成1mg·mL-1的水溶液。然后，把過渡金屬離子Cu2+、Fe2+分別配制成不同濃度的水溶液。分別移取各離子不同濃度的溶液0.1mL加入到3.9mL提取物水溶液中，混合均勻后在37℃反應(yīng)，30min后掃描熒光光譜，由熒光光譜的變化來探討靈香草浸膏、凈油與各金屬離子的螯合情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 靈香草浸膏及其凈油的紫外、熒光吸收光譜

由靈香草浸膏及其凈油的紫外吸收光譜（圖1A）可知，浸膏的最大吸收波長和最大吸收值分別為λmax=243nm，Amax=4.259；凈油的最大吸收波長和吸收值分別為λmax=235nm，Amax=4.136。浸膏、凈油的最大吸收峰的位置與酚類化合物的吸收基本一致，說明了浸膏、凈油含有大量的酚類化合物［4］。

圖1 靈香草浸膏、凈油水溶液的紫外（A）、熒光（B）吸收光譜

由靈香草浸膏、凈油的熒光吸收光譜（圖1B）可以看出，浸膏的熒光吸收強度較凈油的大；浸膏的激發(fā)波長λex=361nm，發(fā)射波長λem=454nm，凈油的λex=352nm，發(fā)射波長λem=440nm，見表1。

2.2 靈香草浸膏、凈油清除自由基的作用

隨著自由基生物學(xué)與自由基醫(yī)學(xué)的迅速發(fā)展，現(xiàn)已證明多種疾病的發(fā)生和發(fā)展與自由基對組織細(xì)胞的損傷關(guān)系密切［6］。自由基（free radical）通常指獨立存在的帶有未成對電子的原子或原子基團，分子或離子，如HO·、O-2·、ArO·等。在人體生命活動進(jìn)程中，自由基發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，人體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除是平衡的，一旦自由基產(chǎn)生過多或抗氧化體系出現(xiàn)故障，體內(nèi)自由基代謝就會出現(xiàn)失衡，可引起蛋白質(zhì)、核酸（DNA）變性，導(dǎo)致細(xì)胞和組織器官損傷，誘發(fā)各種疾病，加速機體衰老，抗氧化劑的加入則能防止或改善這些損害［7］。

二苯代苦味酰自由基（DPPH·）在有機醇溶劑中是一種很穩(wěn)定的自由基，其孤電子在517nm附近有強吸收，溶液呈深紫色［8］，當(dāng)自由基清除劑存在時，孤電子被配對，吸收消失或減弱，因此通過測定吸收減弱的程度，可評價該自由基清除劑的活性。由于DPPH·自由基對受試物活性成分靈敏度較高，而且操作簡單易行，這種方法得到了比較廣泛的應(yīng)用。IC50通常被用來評價化合物對自由基的清除能力的大小，即清除自由基一半濃度時所需自由基清除劑濃度，其是評估化合物抗氧化活性的參數(shù)之一。IC50值越低，說明自由基清除劑對自由基的清除能力越強，靈香草浸膏、凈油不同溶液的IC50分別為0.16、0.17、0.36、0.37mg·mL-1（表2），說明了浸膏、凈油對DPPH·有良好的清除作用，這對開發(fā)新型功能性靈香草自由基清除劑、抗氧化劑具有重要的指導(dǎo)意義。

表2 靈香草浸膏、凈油對自由基DPPH·的清除作用

2.3 靈香草浸膏及其凈油與金屬離子的螯合作用

Fenton反應(yīng)是評估螯合型抗氧化劑的活性與機理的重要方法［9-10］，具體做法是通過對抗氧化劑與Fe3+、Fe2+和Cu2+等金屬離子的螯合作用進(jìn)行表征。目前的表征手段主要有紫外光譜法、熒光光譜法、核磁共振等，由表征結(jié)果可以了解抗氧化劑與金屬離子的螯合情況。螯合常數(shù)可以反映該抗氧化劑的活性，其與抗氧化劑的活性呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。本文中，我們采用熒光光譜猝滅法研究提取物與金屬離子的螯合作用。

當(dāng)熒光體與猝滅體由于熱運動等發(fā)生碰撞時，可引起熒光體的熒光猝滅，設(shè)想為動態(tài)猝滅，則這種動態(tài)猝滅服從Stern-Volmer方程［11-13］。

其中：F0為猝滅體不存在時熒光體的熒光強度；F為加入猝滅體后的熒光強度；Kq為雙分子猝滅常數(shù)；［Q］為猝滅體濃度；τ0為猝滅體不存在時熒光體的熒光壽命；KD為Stern-Volmer常數(shù)。

當(dāng)熒光體與猝滅體之間形成不發(fā)熒光的復(fù)合物時，或者出現(xiàn)無輻射能量轉(zhuǎn)移時，根據(jù)化學(xué)平衡關(guān)系可得靜態(tài)猝滅服從的關(guān)系為：

Ks為熒光體與猝滅體之間的螯合常數(shù)。對于靜態(tài)猝滅通常采用 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)關(guān)系［11-13］，即由式（4）變形可得

其中：Kd為離解常數(shù)。

然后分別利用式（4）和式（6）作圖，判斷其線性從而確定螯合常數(shù)的計算方法。

靈香草浸膏及其凈油水溶液與不同濃度Fe2+和Cu2+離子螯合結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 Cu2+（A）和Fe2+（B）分別對浸膏的熒光猝滅圖

圖3 Cu2+（A）和Fe2+（B）分別對凈油的熒光猝滅圖

由圖2和圖3可見，隨著Cu2+和Fe2+濃度的增加，浸膏、凈油的的熒光發(fā)射峰發(fā)生了猝滅現(xiàn)象。參考文獻(xiàn)［11-13］并結(jié)合公式（2）、式（4）作圖并代入數(shù)據(jù)，可計算浸膏、凈油分別與Cu2+和Fe2+的螯合常數(shù)（表3）。

表3 靈香草浸膏及其凈油與Fe2+、Cu2+的螯合常數(shù)

由表3可見，靈香草浸膏及其凈油對 Cu2+和Fe2+具有良好的螯合作用。其中，凈油與Fe2+的螯合作用最強，螯合常數(shù)為3.74×102mL·mg-1；浸膏對Fe2+的螯合作用次之，螯合常數(shù)為1.56×102mL·mg-1；靈香草凈油與 Cu2+的螯合作用最小，螯合常數(shù)為1.20×102mL·mg-1。由此推測，靈香草浸膏、凈油是良好的螯合型抗氧化劑，其可防止Cu2+和Fe2+參與人體內(nèi)的Fenton反應(yīng)［14］，間接阻礙或降低了羥自由基和氧自由基的產(chǎn)生［15］：

總之，以上研究充分說明了靈香草浸膏及其凈油具有良好的清除自由基的能力，具備開發(fā)為能夠通過螯合過渡金屬陽離子來阻止人體Fenton反應(yīng)發(fā)生的抗氧化劑的潛力。

3 結(jié)論

對靈香草浸膏及其凈油清除自由基DPPH·的性能進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，靈香草浸膏的DMF、水溶液清除自由基DPPH·的IC50分別為0.16、0.17mg·mL-1，靈香草凈油的DMF、水溶液清除自由基DPPH·的IC50分別為0.36、0.37mg·mL-1，說明其浸膏、凈油均具有良好的清除自由基活性，其中浸膏的清除活性比凈油大；對靈香草浸膏及其凈油與Cu2+和Fe2+的螯合作用研究表明，凈油對Fe2+的螯合作用最強，螯合常數(shù)為3.74×102mL·mg-1，浸膏對Fe2+的螯合作用次之，螯合常數(shù)為1.56×102mL·mg-1，凈油對Cu2+的螯合作用最小，螯合常數(shù)為1.20×102mL·mg-1。由上可見，靈香草浸膏、凈油不僅具有良好的清除自由基活性，還具有與過渡金屬陽離子螯合的性能，故靈香草浸膏、凈油具有開發(fā)為新型功能性自由基清除劑、螯合性抗氧化劑的潛力。

［1］朱凱，王慶六，馬吉玲.靈香草浸膏系列產(chǎn)品的研究［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，1995，15（2）：67-71.

［2］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.下冊.上海：上海人民出版社，1977：2470-2472.

［3］莫彬彬，余德順，李典鵬，等.廣西靈香草提取物的化學(xué)成分研究及香氣評價［J］.香料香精化妝品，2003（1）：5-7.

［4］Shen Y H，Weng Z Y，Zhao Q S，et al.Five new triterpene glycosides from Lysimachia foenum-graecum and evaluation of their effect on the arachidonic acid metabolizing enzyme［J］. Planta Med，2005，71（8）：770-775.

［5］Pan Y M，Zhu J C，Wang H S，et al.Antioxidant activity of ethanolic extract of Cortex fraxini and use in peanut oil［J］.Food Chemistry，2007，103：913-918.

［6］AMES BN.Micronutrients prevent cancer and delay aging［J］.Toxicology Letters，1998，102（3）：5-18.

［7］趙保路.氧自由基和天然抗氧化劑［M］.北京：科學(xué)出版社，1999：53-382.

［8］Cotelle N，Bemier JL，Catteau J P，et a1.Antioxidant properties of hydroxy-flavones［J］.Free Radic Biol Med，1996，20（1）：35-43.

［9］Brown J E，Khodr H，Hider RC，et al.Structural dependence of flavonoid interactions with Cu2+ions：implications for their antioxidant properties［J］.Biochem J，1998，330：1173-1178.

［10］Van Acker SA，Van den Berg DJ，Tromp MN，et al. Structural aspects of antioxidant activity of flavonoids［J］.Free Radic Biol Med，1996，20：331-342.

［11］陳曉波，李崧.銅、鈉和鉬離子與牛血清白蛋白作用的熒光光譜研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2006，26（2）：309-312.

［12］宋崢，梁宏.熒光猝滅法研究Cu（Ⅱ）和Zn（Ⅱ）離子與牛血清蛋白結(jié)合競爭［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2003，23（5）：892-894.

［13］Leopoldini M，Russo N，Chiodo S，et al.2006.Iron chelation by the powerful antioxidant flavonoid quercetin［J］.J Agric Food Chem，54：6343-6351.

［14］陳瑗，周玫.自由基醫(yī)學(xué)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，1991：5-7.

［15］Neyens E，Baeyens J.A review of classic Fenton’s peroxidation as an advanced oxidation technique［J］.Hazard Mater，2003，98：33-50，611-617.

Study on the antioxidation of the concrete and essential oil of Lysimachia foenum-graecum Hance

LIU Xian-xian1，ZHANG Ye1，QIN Wen1，ZOU Bi-qun1，2，YI Xiang-hui1，*
（1.Department of Chemistry and Engineering Technology，Guilin Normal College，Guilin 541001，China；2.School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi Normal University，Guilin 541004，China）

The free radical scavenging activities and the binding properties of the concrete and essential oil of Lysimachia foenum-graecum Hance were measured with 2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazy（lDPPH·）method and fluorescence-quenching spectroscopy，respectively.The results showed that both of the concrete and essential oil displayed good free radical activities against DPPH·with lC500.16～0.37mg·mL-1.And the copper and ferrous ion led to obvious statistic quenching of the concrete and essential oil fluorescence.The essential oil exhibited the best binding property with ferrous ion，and the concrete presented good binding property with ferrous ion，while the essential oil displayed the least binding property with copper ion.Their dissociation constants were 3.74×102，1.56×102and 1.20×102mL·mg-1，respectively.lt was suggested that the concrete and essential oil of Lysimachia foenum-graecum Hance should be developed as an efficient new antioxidant.

Lysimachia foenum-graecum Hance；antioxidant；free radical scavenging activity；binding property

TS210.1

A

1002-0306（2010）12-0137-04

2009-12-14 *通訊聯(lián)系人

劉賢賢（1962-），女，教授，主要從事有機合成、天然產(chǎn)物化學(xué)與應(yīng)用、杯芳烴的合成及應(yīng)用的研究等領(lǐng)域的研究。

廣西區(qū)教育廳科研項目（200807MS076、200807MS075、200507067、No.200911MS281、200911MS282）；來賓市科技項目。