桂皮黃酮的提取工藝及抗氧化性研究

馬世宏

（南京野生植物綜合利用研究院，江蘇南京210042）

桂皮黃酮的提取工藝及抗氧化性研究

馬世宏

（南京野生植物綜合利用研究院，江蘇南京210042）

主要研究桂皮黃酮的提取工藝及其抗氧化活性。在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行正交實驗，結(jié)果表明：乙醇浸提法提取桂皮總黃酮的最佳工藝條件為25倍60%乙醇，溫度60℃條件下提取1.5h，按照此條件提取桂皮黃酮，得率達79.82mg/g。DPPH自由基清除實驗表明，桂皮黃酮具有一定的抗氧化性，且隨著濃度升高抗氧化性增強，當濃度大于0.4mg/mL時，DPPH自由基清除率超過90%，但IC50結(jié)果顯示，桂皮黃酮抗氧化性不及VC和BHT。

桂皮，總黃酮，提取工藝，DPPH，抗氧化性

桂皮又稱肉桂，為樟科植物天竺桂、陰香、細葉香桂、肉桂或川桂等樹皮的通稱，為常用中藥，又為食品香料或烹飪調(diào)料，中餐里用其給燉肉調(diào)味，是五香粉的成分之一。香辛料是天然植物抗氧化劑的重要來源，香辛料的抗氧化成分種類繁多，前期的研究主要傾向于揮發(fā)性成分［1］，谷利偉［2］綜述了幾個辛香料抗氧化代表，其呈抗氧化作用的主要是揮發(fā)性成分，有迷迭香、牛芷、百里香等。近年來研究表明，辛香料的乙醇提取物也呈現(xiàn)出明顯的抗氧化作用［3-6］。關(guān)于桂皮的抗氧化性偶有報道，主要是研究其油脂抗氧化作用［7］，至于其抗氧化主要成分及對DPPH自由基的清除活性沒有報道。本研究主要以市售桂皮為材料，研究其黃酮的提取工藝及對DPPH自由基清除活性，為桂皮的深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

桂皮 市售；蘆丁 購于中國生物檢驗所；二苯代苦味酰基自由基（2，2-Diphenyl-1-picryl hydrazyl DPPH，95%） 英國Alfa公司；VC、二叔丁基對甲酚（BHT） 上海國藥（集團）化學(xué)試劑有限公司；其它試劑 均為分析純；實驗提取及分析用水 超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 取干燥桂皮切片，粉碎至40目左右，備用。

1.2.2 蘆丁標準溶液的制備 準確稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的蘆丁標準品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100mL，配成150μg/mL的蘆丁標準溶液。

1.2.3 標準曲線的繪制［8］準確吸取蘆丁標準溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL，相當于蘆丁0、75、150、300、450、600μg移入10mL刻度比色管中，加入30%乙醇液至5mL，各加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，振搖后放置5min，加入10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻后放置6min，加1.0mol/L氫氧化鈉溶液2mL，用30%乙醇定容至刻度，以零管為空白，搖勻后在最大吸收波長處測定吸光度，繪制蘆丁含量（μg）與吸光度的標準曲線。

1.2.4 樣品測定 根據(jù)樣品中總黃酮含量高低，取適宜體積待測液，按標準曲線制備操作步驟于最大吸收波長處進行吸光度的測定。

1.2.5 結(jié)果計算 根據(jù)標準工作曲線，求出相當于試樣吸光度的蘆丁含量，按下式求出總黃酮含量：

式中：X-樣品總黃酮含量（g/100g）；m1-依據(jù)標準曲線計算出被測液中黃酮含量（μg）；m-試樣的質(zhì)量；V1-待測液分取的體積；V2-待測液的總體積。

1.2.6 浸提法提取桂皮總黃酮的工藝優(yōu)化

1.2.6.1 單因素實驗 影響桂皮黃酮提取的影響因素有很多，本文選擇4個影響黃酮提取的主要因素，分別為：乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度。以其中一個為變量，固定其他因素，考察不同因素對桂皮黃酮得率的影響。

1.2.6.2 正交實驗設(shè)計 在1.2.6.1單因素實驗的基礎(chǔ)上，以提取溫度、料液比、乙醇濃度、提取時間四個因素三個水平進行正交實驗，以優(yōu)化該桂皮總黃酮的最佳提取條件。

1.2.7 桂皮中總黃酮含量測定 將總黃酮提取液抽濾去渣，測量提取液體積（V），取樣0.1mL，在510nm處測定吸光度，并從校正曲線上讀取相應(yīng)的濃度C（mg/mL），根據(jù)濃度計算桂皮總黃酮得率。黃酮得率計算公式如下：

黃酮得率（mg/g）=提取液中黃酮總量（mg）/桂皮原料量（g）

1.2.8 DPPH自由基清除活性［9］取1mL不同濃度的樣品提取液及5×10-4mol/L DPPH溶液2mL，用70%乙醇補齊至6mL，室溫下靜置20min后，在波長517nm下測定吸光度變化，計算樣品的DPPH自由基清除率。相應(yīng)濃度的VC和BHT作為陽性對照。按照下式計算清除率：

式中：A0-未加樣的DPPH的吸光度；A-樣品與DPPH反應(yīng)后的吸光度；B-空白樣品的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

蘆丁在濃度為0.0075～0.060mg/mL范圍內(nèi)呈直線關(guān)系，以最小二乘法計算，其回歸方程為：y= 0.0104x+0.0067，相關(guān)系數(shù)R=0.9997。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 桂皮總黃酮提取單因素實驗

2.2.1 提取溫度對桂皮總黃酮得率的影響 取桂皮粉2.0g，固定料液比1∶20，70%乙醇濃度，不同溫度提取1h，結(jié)果見圖2。

圖2 提取溫度對桂皮總黃酮得率的影響

桂皮黃酮的提取屬于固液萃取，即利用物料中的黃酮能溶解在提取溶劑中，黃酮從固相轉(zhuǎn)移到液相中的傳質(zhì)過程，借助分子擴散和對流擴散完成的。升高提取溫度，會加快分子擴散速度，從而影響提取過程。而且隨著提取溫度的提高，溶劑對黃酮的溶解能力增大，從而改變了桂皮的溶解平衡，提高了提取率。溫度超過70℃時，隨著溫度的提高，黃酮得率增加不明顯。

2.2.2 料液比對桂皮總黃酮得率的影響 桂皮粉2.0g，70%乙醇作為提取劑，按照不同料液比，在70℃條件下提取1h，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對桂皮總黃酮提取的影響

桂皮總黃酮的提取屬于固液提取，濃度差是該過程的推動力。溶劑用量越大，桂皮黃酮在物料和溶劑之間的濃度差愈大，對提高傳質(zhì)速率和降低殘渣中的黃酮含量愈有利，但溶劑用量過大，造成溶劑回收困難。本實驗將選擇料液比1∶15、1∶20、1∶25三個水平做正交實驗。

2.2.3 提取時間對桂皮總黃酮得率的影響 桂皮粉2.0g，固定料液比1∶20，70%乙醇作為提取劑，在70℃下提取0.5，1.0，1.5，2，2.5，3.0h，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時間對桂皮總黃酮得率的影響

圖4顯示，提取時間在1.0～3.0h內(nèi)，桂皮黃酮的得率先增加后減少，在1.5h達到最高。隨著時間延長，得率反而下降。說明桂皮黃酮提取時間在1.5h左右。

2.2.4 乙醇濃度對桂皮總黃酮得率的影響 取桂皮粉2.0g，固定料液比1∶20，70℃下用不同濃度的乙醇提取1h，結(jié)果如圖5所示。

圖5 乙醇濃度對桂皮總黃酮得率的影響

從圖5可以看出，隨乙醇濃度的增加，總黃酮得率增加。當乙醇濃度增加到70%時，得率達到最高，再繼續(xù)增加乙醇濃度，黃酮得率減少。

2.3 桂皮總黃酮提取正交實驗

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，確定以乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比為四因素，每個因素設(shè)三個水平進行L9（34）正交實驗設(shè)計，以測定桂皮中的總黃酮含量。結(jié)果見表1。

表1 L9（34）正交實驗方案及結(jié)果

比較表1的三個因素的極差R，B的極差最大，其次是D，再次為A，而C的極差最小。極差越大，說明該因素的水平變動時，測得桂皮黃酮得率變動越大，即該因素對實驗結(jié)果的影響越大。即料液比為最重要的因素，其次是乙醇濃度，再次為提取溫度，而提取時間影響不大。這四個因素對得率的影響次序為B＞D＞A＞C，從而確定最優(yōu)工藝參數(shù)為A2B3C2D2。即桂皮黃酮的最佳提取工藝為 25倍60%乙醇，溫度60℃條件下提取1.5h。按照此條件做驗證實驗，桂皮黃酮得率為79.82mg/g，高于正交實驗中任意一組實驗。

2.4 DPPH自由基清除能力

按以上提取工藝條件提取桂皮黃酮，濃縮干燥后，配制成不同的濃度，按1.2.8的實驗方法研究抗氧性，桂皮黃酮和VC以及BHT的DPPH自由基清除效果見圖6。

圖6顯示，桂皮黃酮、抗壞血酸和BHT對DPPH自由基都具有一定的清除效果，且隨著濃度升高而逐漸增加。對于DPPH自由基，在各試樣濃度小于0.2mg/mL時，清除率由大到小的順序分別為抗壞血酸、BHT和桂皮黃酮，當桂皮黃酮濃度大于0.4mg/mL時，清除率可以達到90%以上。

按照清除曲線進行擬合，計算桂皮黃酮、VC和BHT清除DPPH自由基的IC50（清除率達到50%時的樣品濃度）：

擬合曲線分別為：桂皮樣品：y=1485x2-594.5x +90.3（x值范圍0.2～0.4mg/g），R2=1，IC50（樣品）= 0.314mg/g；VC：y=1603.7x-1.04（x值范圍0～0.04mg/g），R2=0.9988，IC50（VC）=0.032；BHT：y=189x+21.94（x值范圍0.08～0.2mg/g），R2=0.9988，IC50（BHT）= 0.148。說明桂皮黃酮具有一定的抗氧化性，但不及VC和BHT。

圖6 桂皮黃酮自由基清除效果

3 結(jié)論

3.1 桂皮黃酮測定采用鋁鹽顯色法，黃酮測定標準曲線為：y=0.0104x+0.0067，相關(guān)系數(shù)R=0.9997。

3.2 通過正交實驗對桂皮黃酮提取工藝進行優(yōu)化，結(jié)果表明，提取溫度（A）、料液比（B）、提取時間（C）、乙醇濃度（D）這四個因素對得率的影響次序為B＞D＞A＞C，桂皮黃酮的最佳提取工藝為：25倍60%乙醇，溫度60℃條件下提取1.5h。按照此條件做驗證實驗，桂皮黃酮得率為79.82mg/g，高于正交實驗中任意一組實驗。

3.3 DPPH自由基清除實驗表明：桂皮黃酮具有一定的抗氧化性，且隨著濃度升高抗氧化性增強，當濃度大于0.4mg/mL時，DPPH自由基清除率超過90%，但IC50結(jié)果顯示，桂皮黃酮抗氧化性不及VC和BHT。

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Study on extraction technology and antioxidant property of total flavonoids from cassia

MA Shi-hong
（Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plant，Nanjing 210042，China）

The objective of this study was to optimize extraction technology of total flavonoids from cassia with ethanol extraction method.Based on single-factor test，the orthogonal test was carried out.The results showed that the optimal extraction conditions of total flavonoids were ethanol concentration 60%，extraction temperature 60℃，the ratio of solid to liquid 1∶25，and extraction time 1.5h.Under these conditions，the extraction yield of total flavonoids form cassia was 79.82mg/g.DPPH radical scavenging experiment showed that cassia flavonoids possessed certain antioxidant property.Antioxidant property enhanced with flavonoids concentration increased. DPPH radical scavenging rate was more than 90%when flavonoids concentration was up to 0.4mg/mL.The lC50result showed that the antioxidant property of the cassia flavonoids was lower than VCand BHT.

cassia；total flavonoids；extraction technology；DPPH；antioxidant property

TS201.1

A

1002-0306（2010）12-0224-04

2010-06-08

馬世宏（1965-），男，副研究員，博士，主要從事天然香料及化妝品研究。

國家“十一五”科技支撐計劃重點課題（2006BAD06B02）。