新加良附方對移植性人胃癌細胞Bax/Bcl-2表達影響

田劭丹 董 青 侯 麗 陳信義

依據(jù)胃癌臨床表現(xiàn)可將其歸屬于中醫(yī)“反胃”、“噎嗝”、“痞滿”、“胃脘痛”等病證范疇。通過臨床觀察，我們認為，胃癌發(fā)病的關(guān)鍵是“脾陽不振，內(nèi)外寒邪交織”導(dǎo)致“寒凝血瘀、集結(jié)胃府、阻滯氣機”的復(fù)雜病機變化過程[1]。在疾病進展或相關(guān)治療中可出現(xiàn)多態(tài)性復(fù)雜證候群。依據(jù)“治病求本”中醫(yī)理論，我們在臨床中根據(jù)溫中散寒、活血化瘀、理氣止痛的治則，采用由《良方集腋》中的良附丸加味而成的新加良附方治療胃癌，取得了較好的效果。新加良附方由高良姜、香附、穿山龍組成。已有體外實驗證實新加良附方對人胃癌細胞BGC-823等具有明顯抑制作用[2]，為進一步探討其抗腫瘤機制，我們采用免疫組織化學(xué)法從分子水平觀測新加良附方誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡的影響因素。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞系

BALB/C-nu裸鼠50只，6～8周齡，SPF級，雌雄各半，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所腫瘤醫(yī)院動物室繁育并提供，動物生產(chǎn)合格證號：京動許字（1999）第015號，動物合格證號：SCXK京2004-0006，在動物實驗中心屏蔽系統(tǒng)輔以潔凈層流柜環(huán)境中飼養(yǎng)。人胃癌（BGC-823）細胞系，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所檢測中心常規(guī)保存并提供。

1.2 藥物

新加良附方浸膏由西安新華藥物研究所與北京博諾瑞特科技發(fā)展有限公司制備并提供，干燥保存，使用時以雙蒸水稀釋至實驗所需濃度。注射用5-氟尿嘧啶（5-FU）由上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號為：061210。

1.3 儀器及試劑

超凈工作臺系蘇州宏瑞凈化科技有限公司生產(chǎn)(型號SCW-CJ)；實驗用離心機系江蘇恒瑞制藥機械有限公司生產(chǎn)(型號LS150)；倒置顯微鏡系日本NIKON株式會社生產(chǎn)(型號TS100)；Forma恒溫培養(yǎng)箱為美國Forma公司產(chǎn)品（型號3111）；奧林巴斯顯微鏡DP71。Bax、Bcl-2等抗體及DAB顯色增強劑均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 細胞復(fù)蘇

液氮罐中取出含有BGC-823細胞的凍存管，放入37℃水浴內(nèi)，使其溶化，吸取細胞懸液，加入離心管并滴加培養(yǎng)液至10mL，離心1000r/min，5min，去上清液，加入PBS液后細胞計數(shù)，調(diào)整細胞懸液濃度至1×107個細胞/mL，每只裸鼠以0.2mL接種于右腋下，待腫瘤長至體積約為1000mm3時移植。

1.4.2 造模及分組

選擇生長良好、瘤塊無破潰的荷瘤裸鼠，脫頸處死，無菌條件下剝離瘤塊，用生理鹽水洗去血漬，剪開瘤塊，清除中心壞死組織，充分勻漿制備瘤細胞懸液，加生理鹽水稀釋細胞數(shù)至1×107個細胞/mL。取0.2mL/只，接種于裸鼠右腋窩皮下，接種在30min內(nèi)完成。待腫瘤體積在100～300mm3（50只裸鼠造模全部成功）時，根據(jù)性別分層，按腫瘤體積大小隨機分為模型對照組、5-FU組及新加良附方高、中、低劑量組，每組10只。

1.4.3 給藥劑量及方法

給藥劑量均采用人與動物劑量換算法確定。①模型對照組，以生理鹽水每天0.2mL/10g灌胃；②5-FU組，按17mg/(d?kg)體質(zhì)量腹腔注射，每周2次。③新加良附方中劑量組，以每天5g/(d?kg)灌胃，相當(dāng)于成人劑量的15倍，成人劑量為0.35g/(d?kg)，以此為基礎(chǔ)，高劑量組乘以2[10g/(d?kg)]，低劑量組除以2[2.5g/(d?kg)]。分組當(dāng)天開始給藥，連用15d。停藥2d后處死裸鼠，取瘤塊，石蠟包埋。

1.4.4 免疫組織化學(xué)標(biāo)本制備

在新加良附方體內(nèi)抑瘤實驗中，隨機選擇5組中每組6只荷瘤小鼠的腫瘤組織。取各實驗組的腫瘤組織標(biāo)本（約1cm×1cm×2cm大小），用10%中性緩沖福爾馬林液在室溫或 4℃條件下固定，在60℃以下環(huán)境內(nèi)經(jīng)脫水、透明、浸蠟及包埋制成蠟塊。

1.4.5 Bax/Bcl-2蛋白檢測

組織切片常規(guī)脫蠟、水化后，按相關(guān)試劑盒說明檢測Bax/Bcl-2蛋白表達。結(jié)果判斷：Bax、Bcl-2蛋白陽性反應(yīng)為黃色到棕褐色，定位于胞質(zhì)亦可見于胞膜和核膜。各組每個指標(biāo)選取腫瘤組織6個組織切片，每片選2個視野，用美國IMAGE-PRO5.0圖像分析系統(tǒng)作圖像分析，測定光密度（IOD）值。

1.4.6 計算與統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.2 Bax/Bcl-2檢測結(jié)果

實驗各組Bax/Bcl-2檢測結(jié)果見表1與圖（×400）1～圖10。

表1 實驗各組Bax/Bcl-2檢測IOD值比較（±s）

表1 實驗各組Bax/Bcl-2檢測IOD值比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，** P＜0.01；與5-Fu組比較，△P＜0.01

組別 Bax Bcl-2模型對照組 44671.73+10447.96△ 61239.70+18318.94△5-FU組 57136.51+7760.15* 39423.79+20522.71**新加良附高劑量組 59413.69+15065.66** 43752.65+8655.47*新加良附中劑量組 52106.80+15117.84 41357.76+16910.16*新加良附低劑量組 51814.14+12905.17 49659.75+13720.94△

從表1可以看出，Bax表達在用藥各組均有所升高，而Bcl-2表達均有所降低。與胃癌模型組相比，西藥5-FU對照組、新加良附高劑量組Bax蛋白表達升高明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；西藥5-FU對照組、新加良附高、中劑量組Bcl-2蛋白表達下降明顯，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

Bcl-2及Bax基因是Bcl-2基因家族中研究最深入最廣泛的基因。Bcl-2即B細胞淋巴瘤/白血病基因2（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2），是1984年Tsujimoto等從人類B細胞濾泡性淋巴瘤相關(guān)的t（14；18）染色體易位的斷裂點克隆到的[3]。當(dāng)染色體發(fā)生易位時，Bcl-2基因從染色體18q21易位到染色體14q32，與編碼免疫球蛋白重鏈的基因JH片段形成Bcl-2/JH融合基因，引起B(yǎng)cl-2基因表達失調(diào)。Bcl-2蛋白是一種跨膜蛋白，是調(diào)節(jié)凋亡過程的重要基因，它本身無促進增殖作用，也無促進細胞惡性轉(zhuǎn)化作用，但它可以在無生長因子或神經(jīng)營養(yǎng)因子存在的條件下通過抑制凋亡延長細胞存活時間，增加細胞染色體畸變和病毒感染機會，導(dǎo)致細胞惡變和促進腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[4]。分布于線粒體外膜上的Bcl-2蛋白，具有穩(wěn)定線粒體膜的功能。在細胞發(fā)生凋亡時，線粒體發(fā)生一系列與細胞凋亡密切相關(guān)的變化。其中以線粒體膜通透性的轉(zhuǎn)變（permeability transition，PT）尤為重要。Bcl-2蛋白通過作用于線粒體引起線粒體膜通透性的改變，誘發(fā)細胞凋亡。PT孔是橫跨在線粒體內(nèi)外膜之間的高電導(dǎo)性非選擇性通道。PT孔和線粒體外膜上的Bcl-2之間存在緊密的功能和形態(tài)學(xué)的聯(lián)系，研究發(fā)現(xiàn)具有抗凋亡和促凋亡兩種作用的Bcl-2家族蛋白可能參與PT孔的組成，而線粒體PT孔的開放是引起細胞凋亡的直接原因。另外，Bcl-2蛋白可以阻斷Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，使依賴Ca2+的核酸內(nèi)切酶活性降低，從而阻斷細胞凋亡。Bax（Bcl-2 accociated X protein）為Bcl-2基因家族中的細胞凋亡促進基因。實驗中Bax的過表達可拮抗Bcl-2的保護效應(yīng)而使細胞趨于凋亡。Bax與Bcl-2可形成異源二聚體或自身形成同二聚體。而Bax/Bcl-2異源二聚體形成的調(diào)節(jié)是細胞凋亡調(diào)控中一個非常重要的環(huán)節(jié)。目前認為Bcl-2家族凋亡誘導(dǎo)基因Bax等和凋亡抑制基因Bcl-2等的相對表達水平?jīng)Q定了細胞對凋亡信號的反應(yīng)性。當(dāng)Bcl-2超表達時，它與Bax形成異二聚體，凋亡被抑制。當(dāng)Bax在細胞內(nèi)超表達時，細胞對死亡信號的反應(yīng)性增強，細胞發(fā)生凋亡。因此，Bcl-2與Bax比例決定細胞凋亡程度[5]。盡管Bcl-2家族蛋白調(diào)控細胞凋亡的確切機制還不是很清楚，但是Bcl-2蛋白均能抑制FAS介導(dǎo)的細胞凋亡，它是通過抑制caspases的活化，在其上游發(fā)揮抑制凋亡的作用；它還能阻止細胞色素C從線粒體釋放，而細胞色素C是誘導(dǎo)caspases活化的重要成分。許多研究表明Bcl-2在caspases成為具有催化活性的形式時或在此之前就發(fā)揮了抗凋亡作用。所以，最近的研究把它們作為抗癌治療的潛在靶點。

圖1 模型對照組Bcl-2表達

圖2 5-FU組Bcl-2表達

圖3 良附高劑量組Bcl-2表達

圖4 良附中劑量組Bcl-2表達

圖6 模型對照組Bax表達

圖7 5-FU組Bax表達

圖8 良附高劑量組Bax表達

圖9 良附中劑量組Bax表達

圖10 良附低劑量組Bax表達

本實驗采用胃癌裸鼠移植瘤模型，用免疫組織化學(xué)法檢測Bcl-2、Bax等對細胞凋亡起重要調(diào)節(jié)作用的基因，考察新加良附方誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡作用機理。實驗表明，新加良附方能通過上調(diào)腫瘤組織Bax蛋白表達，下調(diào)Bcl-2蛋白表達，從而誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生凋亡。這一重要研究結(jié)論預(yù)示新加良附方在腫瘤治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。我們還將從不同層次探索新加良附方抗胃癌作用靶點，揭示新加良附方抗胃癌機制，為推廣應(yīng)用及新藥研發(fā)提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

[1]劉雪強,陳信義.淺談惡性腫瘤因于寒論及其臨床運用[J].中醫(yī)雜志,2004,45(12):849-949.

[2]莊嚴(yán),董青,陳信義,等.新加良附藥物血清體外抑制腫瘤細胞活性研究[J].北京中醫(yī),2007,26(5):308-310.

[3]Baliga BC,Kumar S. Role of Bcl-2 family of proteins in malignancy[J].Hematol Oncol,2002,20(2):63-74.

[4]Xu J,Xu Z,Jiang Y.Cryptorchidism induces mouse testiculargem cell apoptosis and changes in Bcl-2 and Bax protein espression[J].J Environ Pathol Toxicol Oncol,2000,19 (1/2):25-33.

[5]Korsmeyr SJ. Bcl-2 gene family and the regulation of programmed cell death[J]. Cancer Res,1999,59(7 Supp):1693s-1700s.