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    新加良附方對(duì)移植性人胃癌細(xì)胞Bax/Bcl-2表達(dá)影響

    2010-11-07 08:29:08田劭丹陳信義
    中國(guó)醫(yī)藥指南 2010年9期
    關(guān)鍵詞:胃癌劑量實(shí)驗(yàn)

    田劭丹 董 青 侯 麗 陳信義

    依據(jù)胃癌臨床表現(xiàn)可將其歸屬于中醫(yī)“反胃”、“噎嗝”、“痞滿”、“胃脘痛”等病證范疇。通過臨床觀察,我們認(rèn)為,胃癌發(fā)病的關(guān)鍵是“脾陽(yáng)不振,內(nèi)外寒邪交織”導(dǎo)致“寒凝血瘀、集結(jié)胃府、阻滯氣機(jī)”的復(fù)雜病機(jī)變化過程[1]。在疾病進(jìn)展或相關(guān)治療中可出現(xiàn)多態(tài)性復(fù)雜證候群。依據(jù)“治病求本”中醫(yī)理論,我們?cè)谂R床中根據(jù)溫中散寒、活血化瘀、理氣止痛的治則,采用由《良方集腋》中的良附丸加味而成的新加良附方治療胃癌,取得了較好的效果。新加良附方由高良姜、香附、穿山龍組成。已有體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)新加良附方對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823等具有明顯抑制作用[2],為進(jìn)一步探討其抗腫瘤機(jī)制,我們采用免疫組織化學(xué)法從分子水平觀測(cè)新加良附方誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的影響因素。

    1 材料與方法

    1.1 動(dòng)物與細(xì)胞系

    BALB/C-nu裸鼠50只,6~8周齡,SPF級(jí),雌雄各半,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所腫瘤醫(yī)院動(dòng)物室繁育并提供,動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào):京動(dòng)許字(1999)第015號(hào),動(dòng)物合格證號(hào):SCXK京2004-0006,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏蔽系統(tǒng)輔以潔凈層流柜環(huán)境中飼養(yǎng)。人胃癌(BGC-823)細(xì)胞系,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所檢測(cè)中心常規(guī)保存并提供。

    1.2 藥物

    新加良附方浸膏由西安新華藥物研究所與北京博諾瑞特科技發(fā)展有限公司制備并提供,干燥保存,使用時(shí)以雙蒸水稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度。注射用5-氟尿嘧啶(5-FU)由上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號(hào)為:061210。

    1.3 儀器及試劑

    超凈工作臺(tái)系蘇州宏瑞凈化科技有限公司生產(chǎn)(型號(hào)SCW-CJ);實(shí)驗(yàn)用離心機(jī)系江蘇恒瑞制藥機(jī)械有限公司生產(chǎn)(型號(hào)LS150);倒置顯微鏡系日本NIKON株式會(huì)社生產(chǎn)(型號(hào)TS100);Forma恒溫培養(yǎng)箱為美國(guó)Forma公司產(chǎn)品(型號(hào)3111);奧林巴斯顯微鏡DP71。Bax、Bcl-2等抗體及DAB顯色增強(qiáng)劑均為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品,購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

    1.4 方法

    1.4.1 細(xì)胞復(fù)蘇

    液氮罐中取出含有BGC-823細(xì)胞的凍存管,放入37℃水浴內(nèi),使其溶化,吸取細(xì)胞懸液,加入離心管并滴加培養(yǎng)液至10mL,離心1000r/min,5min,去上清液,加入PBS液后細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×107個(gè)細(xì)胞/mL,每只裸鼠以0.2mL接種于右腋下,待腫瘤長(zhǎng)至體積約為1000mm3時(shí)移植。

    1.4.2 造模及分組

    選擇生長(zhǎng)良好、瘤塊無(wú)破潰的荷瘤裸鼠,脫頸處死,無(wú)菌條件下剝離瘤塊,用生理鹽水洗去血漬,剪開瘤塊,清除中心壞死組織,充分勻漿制備瘤細(xì)胞懸液,加生理鹽水稀釋細(xì)胞數(shù)至1×107個(gè)細(xì)胞/mL。取0.2mL/只,接種于裸鼠右腋窩皮下,接種在30min內(nèi)完成。待腫瘤體積在100~300mm3(50只裸鼠造模全部成功)時(shí),根據(jù)性別分層,按腫瘤體積大小隨機(jī)分為模型對(duì)照組、5-FU組及新加良附方高、中、低劑量組,每組10只。

    1.4.3 給藥劑量及方法

    給藥劑量均采用人與動(dòng)物劑量換算法確定。①模型對(duì)照組,以生理鹽水每天0.2mL/10g灌胃;②5-FU組,按17mg/(d?kg)體質(zhì)量腹腔注射,每周2次。③新加良附方中劑量組,以每天5g/(d?kg)灌胃,相當(dāng)于成人劑量的15倍,成人劑量為0.35g/(d?kg),以此為基礎(chǔ),高劑量組乘以2[10g/(d?kg)],低劑量組除以2[2.5g/(d?kg)]。分組當(dāng)天開始給藥,連用15d。停藥2d后處死裸鼠,取瘤塊,石蠟包埋。

    1.4.4 免疫組織化學(xué)標(biāo)本制備

    在新加良附方體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)中,隨機(jī)選擇5組中每組6只荷瘤小鼠的腫瘤組織。取各實(shí)驗(yàn)組的腫瘤組織標(biāo)本(約1cm×1cm×2cm大?。?,用10%中性緩沖福爾馬林液在室溫或 4℃條件下固定,在60℃以下環(huán)境內(nèi)經(jīng)脫水、透明、浸蠟及包埋制成蠟塊。

    1.4.5 Bax/Bcl-2蛋白檢測(cè)

    組織切片常規(guī)脫蠟、水化后,按相關(guān)試劑盒說明檢測(cè)Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)。結(jié)果判斷:Bax、Bcl-2蛋白陽(yáng)性反應(yīng)為黃色到棕褐色,定位于胞質(zhì)亦可見于胞膜和核膜。各組每個(gè)指標(biāo)選取腫瘤組織6個(gè)組織切片,每片選2個(gè)視野,用美國(guó)IMAGE-PRO5.0圖像分析系統(tǒng)作圖像分析,測(cè)定光密度(IOD)值。

    1.4.6 計(jì)算與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié) 果

    2.2 Bax/Bcl-2檢測(cè)結(jié)果

    實(shí)驗(yàn)各組Bax/Bcl-2檢測(cè)結(jié)果見表1與圖(×400)1~圖10。

    表1 實(shí)驗(yàn)各組Bax/Bcl-2檢測(cè)IOD值比較(±s)

    表1 實(shí)驗(yàn)各組Bax/Bcl-2檢測(cè)IOD值比較(±s)

    與模型組比較,*P<0.05,** P<0.01;與5-Fu組比較,△P<0.01

    組別 Bax Bcl-2模型對(duì)照組 44671.73+10447.96△ 61239.70+18318.94△5-FU組 57136.51+7760.15* 39423.79+20522.71**新加良附高劑量組 59413.69+15065.66** 43752.65+8655.47*新加良附中劑量組 52106.80+15117.84 41357.76+16910.16*新加良附低劑量組 51814.14+12905.17 49659.75+13720.94△

    從表1可以看出,Bax表達(dá)在用藥各組均有所升高,而Bcl-2表達(dá)均有所降低。與胃癌模型組相比,西藥5-FU對(duì)照組、新加良附高劑量組Bax蛋白表達(dá)升高明顯,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);西藥5-FU對(duì)照組、新加良附高、中劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)下降明顯,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    3 討 論

    Bcl-2及Bax基因是Bcl-2基因家族中研究最深入最廣泛的基因。Bcl-2即B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2),是1984年Tsujimoto等從人類B細(xì)胞濾泡性淋巴瘤相關(guān)的t(14;18)染色體易位的斷裂點(diǎn)克隆到的[3]。當(dāng)染色體發(fā)生易位時(shí),Bcl-2基因從染色體18q21易位到染色體14q32,與編碼免疫球蛋白重鏈的基因JH片段形成Bcl-2/JH融合基因,引起B(yǎng)cl-2基因表達(dá)失調(diào)。Bcl-2蛋白是一種跨膜蛋白,是調(diào)節(jié)凋亡過程的重要基因,它本身無(wú)促進(jìn)增殖作用,也無(wú)促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化作用,但它可以在無(wú)生長(zhǎng)因子或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子存在的條件下通過抑制凋亡延長(zhǎng)細(xì)胞存活時(shí)間,增加細(xì)胞染色體畸變和病毒感染機(jī)會(huì),導(dǎo)致細(xì)胞惡變和促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[4]。分布于線粒體外膜上的Bcl-2蛋白,具有穩(wěn)定線粒體膜的功能。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),線粒體發(fā)生一系列與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的變化。其中以線粒體膜通透性的轉(zhuǎn)變(permeability transition,PT)尤為重要。Bcl-2蛋白通過作用于線粒體引起線粒體膜通透性的改變,誘發(fā)細(xì)胞凋亡。PT孔是橫跨在線粒體內(nèi)外膜之間的高電導(dǎo)性非選擇性通道。PT孔和線粒體外膜上的Bcl-2之間存在緊密的功能和形態(tài)學(xué)的聯(lián)系,研究發(fā)現(xiàn)具有抗凋亡和促凋亡兩種作用的Bcl-2家族蛋白可能參與PT孔的組成,而線粒體PT孔的開放是引起細(xì)胞凋亡的直接原因。另外,Bcl-2蛋白可以阻斷Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放,使依賴Ca2+的核酸內(nèi)切酶活性降低,從而阻斷細(xì)胞凋亡。Bax(Bcl-2 accociated X protein)為Bcl-2基因家族中的細(xì)胞凋亡促進(jìn)基因。實(shí)驗(yàn)中Bax的過表達(dá)可拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于凋亡。Bax與Bcl-2可形成異源二聚體或自身形成同二聚體。而Bax/Bcl-2異源二聚體形成的調(diào)節(jié)是細(xì)胞凋亡調(diào)控中一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)。目前認(rèn)為Bcl-2家族凋亡誘導(dǎo)基因Bax等和凋亡抑制基因Bcl-2等的相對(duì)表達(dá)水平?jīng)Q定了細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的反應(yīng)性。當(dāng)Bcl-2超表達(dá)時(shí),它與Bax形成異二聚體,凋亡被抑制。當(dāng)Bax在細(xì)胞內(nèi)超表達(dá)時(shí),細(xì)胞對(duì)死亡信號(hào)的反應(yīng)性增強(qiáng),細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此,Bcl-2與Bax比例決定細(xì)胞凋亡程度[5]。盡管Bcl-2家族蛋白調(diào)控細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制還不是很清楚,但是Bcl-2蛋白均能抑制FAS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,它是通過抑制caspases的活化,在其上游發(fā)揮抑制凋亡的作用;它還能阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放,而細(xì)胞色素C是誘導(dǎo)caspases活化的重要成分。許多研究表明Bcl-2在caspases成為具有催化活性的形式時(shí)或在此之前就發(fā)揮了抗凋亡作用。所以,最近的研究把它們作為抗癌治療的潛在靶點(diǎn)。

    圖1 模型對(duì)照組Bcl-2表達(dá)

    圖2 5-FU組Bcl-2表達(dá)

    圖3 良附高劑量組Bcl-2表達(dá)

    圖4 良附中劑量組Bcl-2表達(dá)

    圖6 模型對(duì)照組Bax表達(dá)

    圖7 5-FU組Bax表達(dá)

    圖8 良附高劑量組Bax表達(dá)

    圖9 良附中劑量組Bax表達(dá)

    圖10 良附低劑量組Bax表達(dá)

    本實(shí)驗(yàn)采用胃癌裸鼠移植瘤模型,用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bcl-2、Bax等對(duì)細(xì)胞凋亡起重要調(diào)節(jié)作用的基因,考察新加良附方誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡作用機(jī)理。實(shí)驗(yàn)表明,新加良附方能通過上調(diào)腫瘤組織Bax蛋白表達(dá),下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。這一重要研究結(jié)論預(yù)示新加良附方在腫瘤治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。我們還將從不同層次探索新加良附方抗胃癌作用靶點(diǎn),揭示新加良附方抗胃癌機(jī)制,為推廣應(yīng)用及新藥研發(fā)提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

    [1]劉雪強(qiáng),陳信義.淺談惡性腫瘤因于寒論及其臨床運(yùn)用[J].中醫(yī)雜志,2004,45(12):849-949.

    [2]莊嚴(yán),董青,陳信義,等.新加良附藥物血清體外抑制腫瘤細(xì)胞活性研究[J].北京中醫(yī),2007,26(5):308-310.

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