高效毛細(xì)管電泳同時(shí)分離多種酚類物質(zhì)

周勝男檀華蓉李 慧陸 寧

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院1,合肥 230036)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心2,合肥 230036)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院3,合肥 230036)

高效毛細(xì)管電泳同時(shí)分離多種酚類物質(zhì)

周勝男1檀華蓉2李 慧3陸 寧1

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院1,合肥 230036)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心2,合肥 230036)

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院3,合肥 230036)

建立了高效毛細(xì)管電泳同時(shí)分離測(cè)定蘆丁、槲皮素、綠原酸、咖啡酸、沒食子酸和原兒茶酸 6種酚類物質(zhì)的分析方法?？疾炝司彌_液種類、離子濃度和 pH、分離電壓、運(yùn)行溫度等電泳參數(shù),確立了最佳的電泳條件:緩沖液為 20 mmol/L磷酸二氫鈉 -20 mmol/L硼砂,pH7.5,分離電壓為 20 kV,運(yùn)行溫度為 30℃,紫外檢測(cè)波長(zhǎng) 214 nm。結(jié)果表明,6種物質(zhì)在 12 min內(nèi)得到完全分離,且各組分質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系,R2為 0.998 7～0.987 4。方法精密度試驗(yàn)中,遷移時(shí)間的 RSD為 0.280%～0.425%,峰面積的 RDS為 5.228%～8.506%,回收率為 85.11%～101.98%。該法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,具有較高的靈敏度。

高效毛細(xì)管電泳 同時(shí)分離 酚酸類

酚類化合物屬于植物次生代謝產(chǎn)物,是多羥基酚類化合物的總稱。它存在于包括馬鈴薯等許多植物組織中[1]。按結(jié)構(gòu)可分為酚酸類、類黃酮類及 1,2-二苯乙烯和木酚素類[2]。多酚類物質(zhì)參與植物生長(zhǎng)繁殖過程,協(xié)助植物防御病原、天敵等侵害。在防病保健方面,多酚化合物尤其是以綠原酸為主的酚酸類物質(zhì)具有利膽保肝、抗病毒、抑制突變、抗腫瘤、抗氧化、抗動(dòng)脈硬化、防治冠心病與中風(fēng)等心腦血管疾病以及抗菌等多種生理功能[3]。隨著天然產(chǎn)物開發(fā)的逐漸興起,植物多酚以其在植物界分布的廣泛性、生理功能的多樣性以及來源豐富性等特點(diǎn),逐漸成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn),被形象地稱為“一座有待開發(fā)的金礦”[4]。

目前,在酚類物質(zhì)的分離測(cè)定方面,國內(nèi)外主要是經(jīng)薄層分離后用紫外進(jìn)行檢測(cè)的方法[5-7]。此方法涂層工序繁瑣,分離效果欠佳,且不利于大量樣品的檢測(cè)和自動(dòng)化連續(xù)檢測(cè)。隨著科技的進(jìn)步,也逐步采用高效液相色譜[8-9],GC-MS等方法,雖然自動(dòng)化程度高,但儀器昂貴,測(cè)試成本高,分析時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。毛細(xì)管電泳是上世紀(jì) 80年代發(fā)展起來的分離分析技術(shù)[10-11],是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型色譜分離技術(shù)。該方法具有分離效率高,分離速度快,分析化合物種類廣泛,重現(xiàn)性好、樣品和試劑用量少等優(yōu)點(diǎn)[12],是一種高效的分離分析技術(shù),相對(duì)成本較低,且是一種綠色環(huán)保的檢測(cè)方法,在分析領(lǐng)域引起極大關(guān)注,發(fā)展迅猛。國內(nèi)外運(yùn)用毛細(xì)管電泳對(duì)蘆丁,槲皮素,綠原酸等的分析較多[13-14],但對(duì)黃酮和多種酚、酸類的同時(shí)分離未見報(bào)道。本研究采用毛細(xì)管膠束電泳方法同時(shí)對(duì)蘆丁、槲皮素、綠原酸、咖啡酸、沒食子酸和原兒茶酸 6種酚類物質(zhì)進(jìn)行分離,主要研究緩沖液種類、離子濃度和 pH、分離電壓、運(yùn)行溫度等電泳參數(shù)對(duì)分離效果的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器

P/ACET MMDQ毛細(xì)管電泳儀 (配有二極管陣列PDA檢測(cè)器和色譜工作站):美國 Beckman公司;75 μm×65 cm未涂層熔融石英毛細(xì)管:河北永年與銳伴色譜器件有限公司;KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器:上海昆山市超聲儀器有限公司;0.45μm微孔濾膜:上海半島實(shí)業(yè)有限公司凈化器材廠。

1.2 藥品與試劑

蘆丁、槲皮素、綠原酸、原兒茶酸、沒食子酸、咖啡酸:中國藥品生物制品檢定所;四硼酸鈉 (硼砂)、磷酸二氫鈉、甲醇等分析純?cè)噭?/p>

1.3 溶液的配制

1.3.1 緩沖液的配制

準(zhǔn)確稱取硼砂0.762 7 g,超純水定容至100 mL,制成 20 mmol/mL硼砂緩沖液;準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鈉0.312 0 g,超純水定容至 100 mL,制成 20 mmol/mL磷酸二氫鈉緩沖液;取兩種溶液混合,搖勻,pH計(jì)測(cè)定 pH值,分別制備 pH 7.0、7.5、8.0、8.5的緩沖溶液,用直徑 0.45μm濾膜過濾后,備 1用。

1.3.2 標(biāo)樣的制備

準(zhǔn)確配制各標(biāo)準(zhǔn)溶液:綠原酸0.5 mg/mL,咖啡酸1.25 mg/mL,蘆丁、槲皮素、沒食子酸和原兒茶酸各1.0 mg/mL。取上述質(zhì)量濃度的綠原酸 0.7 mL,咖啡酸0.28 mL,蘆丁、槲皮素、沒食子酸和原兒茶酸各0.35 mL,混合配置成混合液 (各標(biāo)品質(zhì)量濃度為 147 μg/mL)。再將混合液用 80%甲醇倍倍稀釋(依次吸取前一混合液 100μL,加入100μL 80%甲醇),得到6個(gè)質(zhì)量濃度梯度 (73.5、36.75、18.375、9.187 5、4.593、2.297μg/mL)的混合液,存放于冰箱中備用。

1.3.3 樣液的制備

市售馬鈴薯洗凈晾干,切塊于 55℃熱風(fēng)干燥至干,粉碎過 60目篩,取適量馬鈴薯干粉加入 70%乙醇水溶劑,料液比為 1︰ 12,超聲提取 3次,每次 40 min。合并提取液濃縮,用直徑 0.45μm濾膜過濾,冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 電泳條件

毛細(xì)管柱在每次使用前依次用 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液、超純水和電泳緩沖液各沖洗 10 min,兩次進(jìn)樣間用 0.1 mol/L NaOH、超純水和緩沖液分別沖洗毛細(xì)管 3、3、4 min,以保證其重現(xiàn)性。緩沖體系為20 mmol/L磷酸氫二鈉 -硼砂緩沖液,pH 7.5, 3447.5 Pa,壓力進(jìn)樣 5 s,在電壓 20 kV、柱溫 30℃下分離,于 214 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

如圖 1所示,經(jīng)紫外檢測(cè)器在 190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描,綠原酸和咖啡酸的特征吸收峰為 300～360 nm,蘆丁、槲皮素、沒食子酸和原兒茶酸的特征吸收峰為 200～220 nm,6種物質(zhì)在 214 nm處都有較強(qiáng)吸收,所以選定 214 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 混合標(biāo)樣的紫外特征吸收峰圖

2.2 緩沖體系的選擇

由于毛細(xì)管電泳的驅(qū)動(dòng)力實(shí)際上是管內(nèi)的電滲流[15],即毛細(xì)管中的溶劑因軸向直流電場(chǎng)作用而發(fā)生的定向流動(dòng)。電滲流過大將引起樣品區(qū)帶變寬,降低分離效果。緩沖溶液的種類、濃度及體系 pH值對(duì)電滲流有直接影響,在同一緩沖體系中,電滲流將隨濃度的增加而降低。

2.2.1 電泳緩沖液種類的選擇

緩沖溶液背景電解質(zhì)的選擇對(duì)毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離效果有十分明顯的影響。如圖 2所示,本試驗(yàn)在同一離子濃度 (20 mmol/L)和 pH(8.0)等條件下考察了 4種不同的緩沖體系:硼砂 -磷酸二氫鈉、硼砂 -硼酸、磷酸氫二鈉 -磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 -硼酸緩沖體系。

圖2 不同緩沖液類型的毛細(xì)管電泳圖譜

研究結(jié)果表明,硼砂 -磷酸二氫鈉緩沖液分離效果較好,峰形較佳;硼砂 -硼酸緩沖液體系前 3峰分離效果較好,但后 3峰峰形較差且峰拖尾明顯;磷酸氫二鈉 -磷酸二氫鈉緩沖體系分離效果較差,峰拖尾較嚴(yán)重;磷酸氫二鈉 -硼酸緩沖體系完全無法分離各組分。綜合考慮遷移時(shí)間與分離度的影響,硼砂 -磷酸二氫鈉緩沖液有較好的分離趨勢(shì)。因此,選擇硼砂 -磷酸二氫鈉作為試驗(yàn)的運(yùn)行緩沖液。

2.2.2 電泳緩沖液離子濃度的選擇

如圖 3所示,試驗(yàn)過程中選擇了 20、30、40 mmol/L三個(gè)離子濃度的硼砂 -磷酸二氫鈉緩沖體系。試驗(yàn)結(jié)果表明,緩沖液離子濃度對(duì)峰形和遷移時(shí)間有一定的影響,隨著離子濃度的增大,各組分的遷移時(shí)間延長(zhǎng),色譜峰變寬。當(dāng)離子濃度為 20 mmol/L時(shí),最后一個(gè)組分原兒茶酸的出峰時(shí)間 11. 988 min;而當(dāng)離子濃度增大為 40 mmol/L時(shí),最后一個(gè)組分原兒茶酸的出峰時(shí)間為 13.989 min。這可能由于緩沖液離子濃度增大導(dǎo)致溶液黏度增大,同時(shí)也引起毛細(xì)管內(nèi)壁與溶液間的雙電層厚度減小,使電滲流減小,從而使各組分的遷移時(shí)間延長(zhǎng)。綜合考慮遷移時(shí)間和峰形等因素,選擇 20 mmol/L作為分離的最佳離子濃度。

圖3 緩沖液離子濃度對(duì)遷移時(shí)間的影響

2.2.3 電泳緩沖液 pH的選擇

用毛細(xì)管電泳方法對(duì)物質(zhì)的分離是因組分的離子淌度[16](所謂離子淌度,即指溶質(zhì)離子在單位時(shí)間間隔內(nèi)和單位電場(chǎng)下移動(dòng)的距離)不同所致,離子的淌度與其有效電荷成正比,而離子的有效電荷易受操作緩沖溶液 pH值的影響。因而,緩沖溶液 pH值的調(diào)節(jié)與控制是優(yōu)化分離的重要因素。

如圖 4所示,在 20 mmol/L硼砂 -20 mmol/L Na2HPO4緩沖液條件下,分別調(diào)至 pH7.0、7.5、8.0、8.5。研究結(jié)果表明,隨 pH的升高,毛細(xì)管內(nèi)層表面的負(fù)電荷減少,電滲流減小,遷移時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)。當(dāng)pH 7.0時(shí),后 3峰分離度較低,分離效果不好;當(dāng) pH 8.0時(shí),槲皮素和綠原酸的分離效果較差;而當(dāng) pH 8.5時(shí),雖然分離度較好,但遷移時(shí)間較長(zhǎng)。綜合考慮遷移時(shí)間和各組分的分離度,選定 pH值為 7.5時(shí)分離效果較好。

圖4 緩沖液pH對(duì)各組分分離度的影響

2.3 正交試驗(yàn)

為了進(jìn)一步優(yōu)化最佳分離分析條件,在前面試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),將緩沖體系的 pH、電泳的電壓和溫度作為3個(gè)因素,每個(gè)因素選取3個(gè)數(shù)量位級(jí)(水平),即三因素三水平試驗(yàn)確定緩沖體系(如表1所示)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

由于毛細(xì)管電泳具有能在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到最佳分離效果的優(yōu)點(diǎn),根據(jù)正交設(shè)計(jì)表L9(34)的各因素水平配置的方案(見表 2),本試驗(yàn)分析了各組試驗(yàn)條件下,完成分離的遷移時(shí)間及兩個(gè)色譜峰之間的最低分離度。

表 2 正交試驗(yàn)表(L934)

高效毛細(xì)管電泳測(cè)定多種物質(zhì)的關(guān)鍵性分離指標(biāo)是分離度 R。通常情況下,認(rèn)為 R>1.5即完全分離。若所有分離度 R均大于 1.5,則遷移時(shí)間越短越好。標(biāo)準(zhǔn)混合液的毛細(xì)管電泳圖如圖 5所示,由分析結(jié)果可知,只有第 4組和第 5組試驗(yàn)的分離度 R> 1.5,但第 4組的遷移時(shí)間較長(zhǎng)。綜合考慮分離度、遷移時(shí)間的因素,選擇第 5組即 pH 7.5,電壓 20 kV,運(yùn)行溫度 30℃作為最佳電泳分離條件。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)混合液的毛細(xì)管電泳圖

2.4 研究方法的評(píng)估

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍確定

如表 3所示,在選定的條件下,以質(zhì)量濃度由小到大的次序分別進(jìn)樣 2.297、4.594、9.187 5、18.375、36.75、73.5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液,按上述電泳條件進(jìn)行分析,得到待測(cè)離子的峰面積,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)做回歸分析,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。分析結(jié)果表明,6組分線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)為 0.998 7～0.987 4。

表 3 線性范圍和回歸方程

2.4.2 方法精密度研究

分析方法的重復(fù)性是評(píng)價(jià)其保持不受參數(shù)微小偏差影響的能力,可作為正常使用的一個(gè)可靠性指標(biāo)。如表 4所示,在上述優(yōu)化條件下 (即:緩沖液為20 mmol/L磷酸二氫鈉 -20 mmol/L硼砂,pH 7.5,分離電壓為 20 kV,運(yùn)行溫度為 30℃,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm),取 36.75μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣 6次,考察各組分的遷移時(shí)間和校正峰面積的重復(fù)性。峰面積和遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別小于8.506%和 0.425%。

表 4 分析組分遷移時(shí)間和峰面積的精密度(n=6)

2.4.3 方法回收率研究

準(zhǔn)確度驗(yàn)證采用添加回收率法進(jìn)行試驗(yàn)。取100μL已知濃度的樣品三份,分別于其中加入 73.5、36.75、18.375μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液各 100μL,測(cè)定樣品。加標(biāo)樣品的含量減去未加標(biāo)樣品的含量即為實(shí)測(cè)添加量。實(shí)測(cè)添加量與標(biāo)準(zhǔn)添加量之比為回收率。通過試驗(yàn),測(cè)得蘆丁、槲皮素、綠原酸、咖啡酸、沒食子酸和原兒茶酸 6種酚類的回收率分別為97.73%、90.57%、93.60%、85.11%、100.17%、101.98%,RDS分別為 0.24%、0.11%、0.40%、0.19%、0.17%、0.16%,結(jié)果令人滿意。

2.5 樣品的測(cè)定

在最佳分離條件下,分離檢測(cè)樣品,計(jì)算酚酸類物質(zhì)的含量(見圖 6)。從圖 6中可以很明顯的看出,馬鈴薯酚類物質(zhì)主要為綠原酸和咖啡酸兩種。

馬鈴薯中酚類物質(zhì)含量如表 5所示,其中綠原酸含量為 330.18μg/g,咖啡酸含量為 89.33μg/g,馬鈴薯中酚類物質(zhì)總含量為 419.51μg/g。

圖6 樣品液的毛細(xì)管電泳圖

表5 酚類物質(zhì)含量

3 結(jié)論

3.1 通過對(duì)電泳緩沖液類型、離子濃度和 pH值、分離電壓、分離溫度等電泳條件進(jìn)行比較研究,確立了同時(shí)分離測(cè)定蘆丁、槲皮素、綠原酸、咖啡酸、沒食子酸和原兒茶酸 6種酚類物質(zhì)的高效毛細(xì)管電泳方法,6種物質(zhì)可在 12 min內(nèi)得到完全分離。

3.2 研究并確立了最佳的電泳條件:緩沖液采用20 mmol/L磷酸二氫鈉 -20 mmol/L硼砂,pH 7.5,分離電壓 20 kV,運(yùn)行溫度 30℃,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。

3.3 本方法工作曲線線性關(guān)系良好、結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度高,樣品用量少,分析時(shí)間短,與其他分析方法相比較,高效毛細(xì)管電泳法操作更簡(jiǎn)便、快速,可在 12 min內(nèi)同時(shí)分離 6種物質(zhì),大大減少了分析成本,為同時(shí)分離檢定多種酚類物質(zhì)提供了一個(gè)良好的方法。

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Simultaneous Separation of Polyphenols by High Perfor mance Capillary Electrophoresis

Zhou Shengnan1Tan Huarong2Li Hui3Lu Ning1
(College of Tea and Food Seience and Techaology,AnhuiAgriculturalUniversity1,Hefei 230036)
(Biotechnology Center,AnhuiAgriculturalUniversity2,Hefei 230036)
(College ofAnimal Science,AnhuiAgriculturalUniversity3,Hefei 230036)

A high perfor mance capillary electrophoresismethod has been developed for the simultaneous sepa2 ration and deter mination of six phenolics of rutin、quercetin、chlorogenic acid、caffeic acid、gallic acid and protocate2 chuic acid.The effects of several factors such as the pH and concentration of running buffer,the separation voltage and the runnion tamperation on HPCE were investigated.Under optimum condition,the running buffer consisted of 20 mmol/LNaH2PO4-20 mmol/L sodium borate,pH 7.5,separation voltageat 20 kV,running temperation at 30℃, the UV detection wavelength was 214 nm.The results showed that the six analytes can be well separated within 12. 0 min,each one had a good linear relationship(R2=0.998 7～0.987 4).The RSD ofmigration time was 0.280%～0.425%and of the peak area was 5.228%～8.506%.The average recovery percentage was 85.11%～101.98%. The method is rapid,simple and accurate.

high herfor mance capillary electrophoresis,simultaneous separation,phenolic acids

O657.8;TS215 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1003-0174(2010)06-0114-06

2009-07-28

周勝男,女,1985年出生,碩士,農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏

陸寧,女,1964年出生,教授,碩士生導(dǎo)師,食品及農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工