棉籽蛋白發(fā)酵制備ACE抑制肽條件的優(yōu)化

常通，曹郁生，李海星，陳燕

(南昌大學中德聯(lián)合研究院，食品科學教育部重點實驗室，江西南昌，330047)

棉籽蛋白發(fā)酵制備ACE抑制肽條件的優(yōu)化

常通，曹郁生，李海星，陳燕

(南昌大學中德聯(lián)合研究院，食品科學教育部重點實驗室，江西南昌，330047)

以棉籽蛋白為原料，采用枯草芽孢桿菌NCT314發(fā)酵制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制肽。首先從溫度、時間、pH和接種量4個方面研究了制備棉籽蛋白ACE抑制肽的單因素條件;然后在單因素試驗的基礎(chǔ)上，運用Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，采用響應面分析，對發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化后的發(fā)酵條件為溫度32.08℃、時間22.6 h、pH為7.2，在該條件下，發(fā)酵液的ACE抑制率最高可達78.06%，IC50值達6.67mg/mL

棉籽蛋白，發(fā)酵，ACE抑制肽，響應面分析

近年來，高血壓已成為一種發(fā)病率高、危害性大的常見病，嚴重危害人類的健康。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)可以將血漿內(nèi)皮細胞表面無活性的血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素Ⅱ，可使血管緊縮并刺激醛固酮分泌，另一方面，ACE也能使具有降血壓作用的物質(zhì)——緩激肽失活，以上兩個方面的都會導致血壓升高［1］。因而抑制ACE的活性成為控制高血壓的一個可靠的方法。能抑制ACE活性的物質(zhì)稱為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)。人工合成的ACE抑制劑有卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)，培哚普利(perindopril)等，雖然這些藥物降壓效果非常顯著，但是服用后往往會出現(xiàn)副作用及皮疹，蛋白尿等不良反應［2］。研究發(fā)現(xiàn)，許多天然蛋白水解肽也具有ACE抑制活性，稱為ACE抑制肽(ACE inhibitory peptides)。由于ACE抑制肽具食用安全性高，無毒副作用，對正常血壓沒有過度降壓的危險等特殊優(yōu)點［3］，越來越受到人們的關(guān)注。研究者已從不同的蛋白，如乳蛋白、魚肉蛋白、大豆蛋白、小麥蛋白、玉米蛋白等獲得了多種ACE抑制肽［4－8］。

我國是產(chǎn)棉大國，棉籽產(chǎn)量居世界第一。棉籽中含蛋白質(zhì)30%以上，營養(yǎng)價值接近豆類蛋白。其氨基酸組成除了蛋氨酸稍低外，其余必需氨基酸均達到聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)的推薦標準［9］。目前國內(nèi)大部分棉籽蛋白都用做肥料和動物飼料，在食用和保健食品方便應用甚少，造成了蛋白質(zhì)資源的極大浪費［10］。如使用低成本的棉籽蛋白生產(chǎn)具有高價值的活性肽，如ACE抑制肽和其他肽類產(chǎn)品，提高棉籽蛋白的附加值，可為棉籽蛋白的深加工和綜合利用提供可行的途徑。

本文選取脫酚棉籽蛋白為原料，采用發(fā)酵法制備ACE抑制肽，通過單因素試驗和響應面法對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以獲得最佳的發(fā)酵條件，提高ACE抑制肽的產(chǎn)量和抑制效果，為進一步的研究工作提供基礎(chǔ)。

1 試驗部分

1.1 試驗材料與儀器設(shè)備

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌 NCT314(Bacillussubtilis NCT314)，由本實驗室分離保存。

1.1.2 棉籽蛋白

脫酚棉籽蛋白，購于北京中棉紫光生物科技有限公司。

1.1.3 試劑

ACE(Sigma公司)，馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu)(Sigma公司)，水合茚三酮(上海生物工程有限公司)，三氯乙酸，鹽酸，乙酸酐，二甲氨基苯甲醛等皆為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.4 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，H2O 100mL，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基:棉籽蛋白5%，H2O 100mL。

1.1.5 儀器設(shè)備

3K18型Sigma高速冷凍離心機(德國，Sigma公司)，PB－10型精密 pH計(Sartorius公司)，MOV202F型烘箱(三洋電機中國有限公司)，TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2 試驗部分

1.2.1 種子液細菌生長曲線測定

斜面保藏菌種接于種子培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。每隔4 h取樣4mL，用無菌蒸餾水稀釋，取適當稀釋濃度樣品測定OD600，用未接種的種子培養(yǎng)液作空白，繪制種子液細菌生長曲線。

1.2.2 發(fā)酵條件單因素試驗設(shè)計

以發(fā)酵液的水解度和ACE抑制率為評價指標，研究不同發(fā)酵時間、溫度、pH和接種量對ACE抑制肽的影響。

1.2.3 發(fā)酵條件響應面法優(yōu)化設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，運用Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，進行三因素三水平響應面分析，對發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

1.2.4 發(fā)酵液水解度的測定

發(fā)酵液水解度的測定按照余勃等人［11］的方法進行。

甘氨酸標準曲線的繪制如圖1所示。由圖可知，回歸方程為y=0.019 2x－0.002 5，回歸系數(shù) R2=0.999 2，說明該標準曲線在0～100μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

圖1 甘氨酸標準曲線

1.2.5 ACE抑制率的測定

本文根據(jù)Cushman等人的測定原理［12］，結(jié)合吳孟平［13］的方法進行。該方法原理為樣品中的馬尿酸(HA)在乙酸酐中能與對二甲氨基苯甲醛(DAB)的吡啶溶液發(fā)生顯色反應，生成桔黃色的氮雜內(nèi)酯和2-苯基-4-(對二氨基)苯-5-噁唑酮。其顏色深淺與HA含量成正比。

將ACE底物Hip-His-Leu溶解于0.1mol/L的含0.2mol/L NaCl的硼酸鹽緩沖溶液(pH=8.3)，配制成5.0 mmol/L的濃度。取0.1mL的Hip-His-Leu與0.1mL發(fā)酵液混合，再加入0.15mL 0.1 U/mL的ACE溶液(溶于0.1mol/L的含0.2mol/L NaCl的硼酸鹽緩沖液中，pH=8.3)，于37℃水浴中反應60 min。加入0.25mL 1.0mol/L的HCl終止反應，靜置5 min，然后加入乙酸乙酯1.5mL進行萃取，強烈振蕩1 min，在3 000 r/min下離心5 min。取酯層0.5mL，加入1mL乙酸酐和2mL 0.5%的DAB顯色劑，40℃顯色30 min，后在459 nm處測定吸光值。根據(jù)以下公式計算ACE抑制率:

ACE抑制率/%=［(A－S)/(A－C)］×100

其中，A為用水代替發(fā)酵肽液所測得的吸光值;S為添加發(fā)酵肽液所測得的吸光值;C為加乙酸乙酯、乙酸酐和DAB顯色劑的參比吸光值。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用Design Expert 6.0.5軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌生長曲線的繪制

由圖2可知，0～4 h內(nèi)發(fā)酵菌處于休眠期，細菌數(shù)量增長緩慢;4～24 h發(fā)酵菌進入對數(shù)期，細菌數(shù)量迅速增加;隨著培養(yǎng)時間繼續(xù)延長，發(fā)酵菌進入穩(wěn)定期(24～44 h)，細菌數(shù)量增長趨于穩(wěn)定。處于對數(shù)期的細菌活力好，產(chǎn)蛋白酶能力較強，代謝旺盛。因此選取培養(yǎng)22 h左右的菌體作為試驗的種子液。

圖2 發(fā)酵菌生長曲線的繪制

2.2 發(fā)酵條件單因素試驗

2.2.1 發(fā)酵時間的影響

在發(fā)酵溫度為37℃，pH值為7.0，接種量5%的條件下，分別發(fā)酵 6、12、24、36、48、60 h，研究不同發(fā)酵時間對水解度和發(fā)酵肽ACE抑制率的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，在未發(fā)酵階段(0 h)，水解度和ACE抑制率趨近于0，說明原料棉籽蛋白在發(fā)酵前基本沒有ACE抑制性。隨著時間的延長，水解度不斷增加。在6～36 h內(nèi)，棉籽蛋白的水解度增長較快，但從48～60 h趨于平緩;而ACE抑制率在6～12 h內(nèi)迅速升高，12～24 h內(nèi)上升幅度變緩，24 h時達到最高值，隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)延長(36～60 h)，ACE抑制率不斷下降?？梢姡煌l(fā)酵時間下ACE抑制的大小與水解度的大小并不完全一致。Mullally在對乳清蛋白酶解物ACE抑制率的研究中也發(fā)現(xiàn)這個規(guī)律［14］:在反應剛開始，ACE抑制率是隨著反應時間和水解度的增加而增加的，但反應到達一定程度的時候，ACE抑制率反而會隨時間和水解度的增加而減低。這可能由于隨著發(fā)酵時間的增長，ACE抑制肽被進一步降解，造成ACE抑制率下降。所以最適的發(fā)酵時間應為24 h左右。

圖3 不同發(fā)酵時間對水解度和ACE抑制率的影響

2.2.2 發(fā)酵溫度的影響

在pH值為7.0，接種量為5%的條件下，分別在27、32、37、42、47℃下發(fā)酵 24 h，以水解度和 ACE 抑制率為評價指標，研究不同發(fā)酵溫度的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同發(fā)酵溫度對水解度和ACE抑制率的影響

由圖4可知，當溫度從27℃上升至32℃，水解度和ACE抑制率不斷提高;32℃時，水解度和ACE抑制率達到最高。當溫度繼續(xù)升高時，二者則呈下降趨勢。這表明一定范圍內(nèi)溫度上升有利于菌體蛋白酶的分泌和酶活性的發(fā)揮，造成水解度和ACE抑制率同時升高，但較高的溫度一方面會影響發(fā)酵菌的正常代謝，致使其產(chǎn)蛋白酶能力受到抑制;另一方面，由于酶分子吸收了過多的能量，造成維持酶分子結(jié)構(gòu)的次級鍵解體，酶蛋白變性，最終導致蛋白酶活性減弱甚至失活，水解度和ACE抑制率不斷降低。因此，最適發(fā)酵溫度應在32℃左右。

2.2.3 pH值的影響

在溫度為32℃，接種量為5%的條件下，分別將發(fā)酵培養(yǎng)基 pH 值調(diào)至 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，發(fā)酵24 h，以水解度和ACE抑制率為評價指標，研究不同發(fā)酵pH值的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同pH值對水解度和ACE抑制率的影響

在pH值從6.0～7.0增加時，發(fā)酵物的水解度和ACE抑制率逐漸增加。當pH值為7.0時，水解度和ACE抑制率均達到最大。pH值增加時，水解度和ACE抑制率卻下降。pH值的影響是多方面的，過酸和過堿的環(huán)境都會引起微生物細胞膜電荷的變化，從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，引起微生物代謝和產(chǎn)酶能力下降;高pH值或低pH值能夠改變酶蛋白空間構(gòu)象，使酶失活，同時pH值還可以改變發(fā)酵物的解離狀態(tài)，影響它與酶的結(jié)合。從實驗結(jié)果可見最適發(fā)酵pH值應為7.0左右。

2.2.4 接種量的影響

在溫度為32℃，pH值為7.0的條件下，接種量分別選取1%、3%、5%、7%、9%，發(fā)酵24 h，以水解度和ACE抑制率為評價指標，研究不同接種量的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 不同接種量對水解度和ACE抑制率的影響

由圖6可知，ACE抑制率與水解度呈相同的趨勢，當接種量為1%和9%時，ACE抑制率與水解度較低;接種量為3%和5%時，ACE抑制率與水解度變化不大。當接種量為5%時，二者均達到最大值。當接利量過低時，細菌不能迅速達到一定數(shù)量，從而影響了酶的產(chǎn)量，而接種量過大會造成細菌生長過快，營養(yǎng)成分消耗，一些初級代謝產(chǎn)物或次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生對酶合成有抑制作用。因此最佳接種量選擇5%。

2.3 棉籽蛋白發(fā)酵條件的響應面試驗分析

2.3.1 響應面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用響應面設(shè)計試驗，運用Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理［15］，選取對ACE抑制率影響顯著的3個因素:溫度(X1)、時間(X2)、pH(X3)，進行3因素3水平的響應面試驗設(shè)計，見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計各變量水平

2.3.2 多元二次模擬方程的建立及檢驗

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計進行了17組試驗，其中5組中心點重復試驗，結(jié)果見表2。利用Design Expert 6.0.5軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到回歸方程如下:

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計試驗結(jié)果

從該模型的方差分析表(表3)可見，本實驗所選用的二次項多項模型具有高度的顯著性(P＜0.000 1)。失擬項在a=0.05水平上不顯著(P=0.234 8＞0.05)，其決定系數(shù)為0.990 5，校正決定系數(shù)為0.978 2，說明該模型能解釋97.82%響應面的變化，僅有總變異的2.18%不能用此模型來解釋，說明該模型擬合程度良好，用該模型進行優(yōu)化是合適的。

表3 二次多項模擬方差分析表

對上述方程的回歸系數(shù)顯著性檢驗表明(見表4)，試驗中 X1、X3、X12、X22、X23和X1X3這幾個因素對ACE抑制率的影響顯著，表明在發(fā)酵的過程中，溫度、pH對ACE抑制肽的生產(chǎn)有顯著影響，同時，溫度和pH之間的交互作用影響顯著。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗

2.3.3 響應面分析與優(yōu)化

通過上述二次多項回歸方程所做的響應面圖及其等高線圖(圖7、圖8和圖9)即可對任何兩因素交互影響發(fā)酵肽的ACE抑制率進行分析與評價，并從中確定最佳因素水平范圍。

圖7顯示了溫度與時間對發(fā)酵肽ACE抑制率的交互影響。由其等高線圖可知溫度與時間的交互作用不顯著。在本次試驗水平的范圍內(nèi)，當溫度在28～37℃，時間在12～36 h變化時，響應值A(chǔ)CE抑制率最高可達72.86%。

圖8顯示了溫度與pH值對發(fā)酵肽ACE抑制率的交互影響。由其等高線圖可知溫度與pH值的交互作用顯著。當溫度在28～37℃，pH值在6.5～7.5變化時，響應值A(chǔ)CE抑制率最高可達77.94%。

圖7 溫度與時間交互影響ACE抑制率的曲面圖及等高線圖

圖9顯示了時間與pH值對發(fā)酵肽ACE抑制率的交互影響。由其等高線圖可知時間與pH的交互作用不顯著。當時間為12～36 h，pH值在6.5～7.5變化時，響應值A(chǔ)CE抑制率最高可達76.44%。

圖8 溫度和pH值交互影響ACE抑制率的曲面圖及等高線圖

圖9 時間和pH值交互影響ACE抑制率的曲面圖及等高線圖

2.4 模擬驗證試驗

根據(jù)2.3結(jié)果和二次多項回歸方程，利用Design Expert軟件獲得了ACE抑制率最高時的各個因素的理論最佳值為:溫度32.08℃、時間22.6 h、pH值為7.2，在此發(fā)酵條件下，預測發(fā)酵肽的ACE抑制率最高可達78.13%。

為了檢驗模型預測的準確性，在最佳條件下對棉籽蛋白進行發(fā)酵，多肽濃度達8.37mg/mL，發(fā)酵液的ACE抑制率，3組平行試驗結(jié)果分別為77.83%、78.06%、77.96%，證明該模型預測結(jié)果與實驗結(jié)果相符。IC50值達到6.67mg/mL。

3 結(jié)論

本研究首先以水解度和發(fā)酵肽ACE抑制率為評價指標，通過單因素試驗，研究了水解度和發(fā)酵肽ACE抑制效果二者之間的趨勢。在單因素試驗分析的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵肽ACE抑制率為響應值，通過響應面設(shè)計對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵條件為:溫度32.08℃、時間22.6 h、pH值為7.2，在此發(fā)酵條件下發(fā)酵棉籽蛋白，ACE抑制率明顯提高，這為下一步ACE抑制肽的分離純化和氨基酸序列鑒定工作提供了基礎(chǔ)。

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Optimization of Fermentation Conditions in Production of ACE Inhibitory Peptides From Cotton Seed Protein

Chang Tong，Cao Yu-sheng，Li Hai-xing，Chen Yan
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Sino-German Joint Research Institute，Nanchanguniversity，Nanchang 330047，China)

Angiotensin－I－converting enzyme(ACE)inhibitory peptide was derived from cotton seed protein fermented with Bacillus subtilis NCT314.The fermentation conditions including temperature，time，pH and inoculum size were investigated.Based on the single factor experiments，the fermentation condition was optimized by response surface methodology.The result showed the optimum fermentation condition was temperature 32.08℃，time 22.6 h and pH 7.2.Under this condition，the ACE inhibitory ratio of fermented liquid reached to 78.06%，and IC50 value was 6.67 mg/ml.

cotton seed protein，fermentation，ACE inhibitory peptides，response surface methodology

碩士研究生(曹郁生教授為通訊作者)。

2010－08－03，改回日期:2010－09－28