丹參酮ⅡA對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

江蘇省大豐市人民醫(yī)院（224100）嚴(yán)如華

南京中醫(yī)藥大學(xué)（210029）范乃兵

腦卒中因其發(fā)病率、致殘率和致死率高而嚴(yán)重危害人類的健康，在臨床初次腦卒中病例中，大腦中動脈阻塞占了很大比例[1]。本實(shí)驗(yàn)采用缺血3h，再灌24h建立大腦中動脈阻斷再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion）模型，使其病理生理過程充分模擬臨床腦卒中病例，以此來觀察丹參酮ⅡA（tanshinone ⅡA,TSNⅡA）對腦缺血再灌注大鼠的保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物及試劑 丹參酮ⅡA，西安冠宇生物技術(shù)有限公司提供。尼莫地平注射液，德國拜耳公司產(chǎn)品，批號bxnl3p1。水合氯醛，AR，250g / 瓶，上海青析化工科技有限公司，批號：20050107。氯化三苯基四氮唑（TTC），中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司產(chǎn)品，批號：20040328。TT、PT、APTT試劑盒，德國美創(chuàng)公司生產(chǎn)，批號：354201。磷酸氫二鈉，AR，上海實(shí)意化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號：20031116。磷酸二氫鉀，AR， 南京化學(xué)試劑廠，批號：030908。檸檬酸三鈉，AR，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號：030413。5’-腺苷二磷酸二鈉鹽，上海伯奧生物科技有限公司（進(jìn)口分裝），批號：990527。磷酸緩沖液：精密稱取磷酸二氫鉀3.629g，置100ml雙蒸水中，不斷攪拌，待完全溶解后再加雙蒸水至400ml，配成1/15M的溶液；再精密稱取磷酸氫二鈉38.204g，置于200ml雙蒸水中，不斷攪拌，待完全溶解后再加入雙蒸水至1600ml，配成1/15M的溶液；二者按照體積2：8合并，備用。TTC染色液：精密稱取紅四氮唑1g，置于80ml磷酸緩沖液中，不斷攪拌，待完全溶解后再加磷酸緩沖液至100ml，配成1%的TTC磷酸緩沖液備用。應(yīng)注意TTC染色液現(xiàn)配現(xiàn)用，并注意避光。

1.2 儀器 KD-500Z柯尼卡數(shù)碼相機(jī)（500萬象素），普立華科技有限公司；BS110S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；DHG-9053A型電熱恒溫干燥箱，上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠；STEELIEX R80型錐板式黏度計，北京世帝科學(xué)儀器公司；STEELIEX血小板聚集凝血因子分析儀，北京世帝科學(xué)儀器公司；LDZ5-2離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；電熱恒溫水箱，北京東霞開科學(xué)儀器廠；GC-1200放射免疫計數(shù)器，科大創(chuàng)新股份公司中佳分公司。

1.3 尼龍栓子的制備 參照文獻(xiàn)方法，將一長50mm、直徑0.235mm的尼龍線的一端加熱熔成光滑的球形，并在距球端18mm處標(biāo)記，酒精擦拭后備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級SD大鼠，全雄性，體重250g～350g，由上海斯萊克動物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2003-0003；實(shí)驗(yàn)動物使用許可證：SYXK（蘇）2002-0053。

2 實(shí)驗(yàn)方法與觀察指標(biāo)

2.1 動物分組及給藥 大鼠隨機(jī)分為6組，即假手術(shù)組、模型對照組、尼莫平組（2mg/kg）和丹參酮ⅡA低劑量組（7.5mg/kg）、中劑量組（15mg/g）、高劑量組（30 mg/kg），灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7d，末次給藥后1h，按文獻(xiàn)[2]方法制備腦缺血再灌注模型，尼莫地平組于手術(shù)前尾靜脈注射，而假手術(shù)組和模型對照組給予等體積的生理鹽水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用頸內(nèi)動脈栓線法制作右側(cè)大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型。采用Longa的方法加以改進(jìn)，以10%水合氯醛麻醉（350mg/kg，ip），仰位固定于手術(shù)臺上，頸部正中切口，切開皮膚后，鈍性分離牽開頸部肌肉，分離出頸總動脈（CCA），繼續(xù)向下分離并結(jié)扎頸外動脈（ECA）及頸外動脈各分支（枕動脈、甲狀腺上動脈、舌動脈和面動脈），輕輕剝離迷走神經(jīng)，分離出頸內(nèi)動脈（ICA）和翼腭動脈，ECA近心端備線，用動脈夾夾閉ICA和CCA，在ECA距ICA2mm處剪一小口，將一尼龍栓子插入ECA 并進(jìn)入CCA，輕扎備線，防止出血，剪斷ECA，松開ICA的動脈夾，牽引ECA，使其和ICA約成一直線，輕輕回抽尼龍線，使其順入ICA，繼續(xù)向下推進(jìn)（注意避免尼龍線進(jìn)入翼腭動脈），直至有輕微阻力。此時可見ICA 伸展，尼龍線插入深度約為18mm，表明尼龍線已經(jīng)穿過大腦中動脈（MCA）起始段，到達(dá)大腦前動脈（ACA）近端，阻斷了MCA的所有血供來源，包括來自ICA 和ACA及大腦后動脈的血液供應(yīng)。松開CCA動脈夾，扎緊備線，外留1cm長線頭，縫合皮膚，回籠飼養(yǎng)。缺血3h后再灌注，再灌注時輕拉尼龍線，使尼龍線拔出顱外，血流再通，修剪尼龍線，縫合皮膚，回籠自然喂養(yǎng)。以上過程均在室溫恒定（24～25℃）情況下進(jìn)行，以利于評價腦缺血情況。

2.3 觀察指標(biāo)和檢測指標(biāo)

2.3.1神經(jīng)行為學(xué)評分 待造模大鼠清醒后，觀察大鼠的行為活動情況。在MCAO后3h及24h，參考Bederson[3]等的方法對術(shù)后動物的行為缺陷進(jìn)行分級評分，分級標(biāo)準(zhǔn)如下：

2.3.2 TTC染色測量腦梗塞面積 TTC染色測量腦梗塞面積[4]：MCAO后24小時，斷頭取腦，將腦置冰冷的生理鹽水中（2～3℃）10min，去除嗅球、小腦和低位腦干后，用生理鹽水沖洗大腦使表面不留血污，吸干周圍水分后，沿冠狀切四刀，切成五片。第一刀在腦前極與視交叉連線中間；第二刀在視交叉部位；第三刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間。然后迅速將腦片置5ml含有1%TTC的磷酸緩沖溶液中，避光溫孵30分鐘，其中每隔7～8分鐘翻動一次，經(jīng)染色后，正常腦組織呈玫瑰紅色，而梗塞組織呈白色，且界限分明。溫孵完畢后將腦片照相，剪下紅白顏色區(qū)稱重計算。然后根據(jù)重量求面積法，分別計算出5個腦片共10個平面的總面積和梗塞區(qū)域的面積，求出梗塞區(qū)面積占半球總面積的百分比，即梗塞率。

2.3.3 腦含水量和腦指數(shù)的測定 大腦中動脈阻斷24h后的大鼠，斷頭處死后，取出大腦，稱腦濕重后將腦組織置于115℃電熱干燥箱中烘至恒重，稱取干重，按下列公式計算腦含水量及腦指數(shù)：腦含水量（%）＝濕重－干重/濕重×100% ，腦指數(shù)＝濕重×100/體重

2.3.4 血小板聚集功能的測定[5]MCAO 24h的大鼠，頸總動脈插管放血，用3.8%的枸櫞酸鈉抗凝，以800r/min離心10min，取富血小板血漿（PRP），剩余部分以3000r/min離心10min，即為貧血小板血漿（PPP），每次取250μl PRP，加入誘導(dǎo)劑ADP溶液10μl（誘導(dǎo)劑終濃度：5.6μg/L），按比濁法在血小板聚集凝血因子分析儀上測定血小板聚集率。記錄最大聚集率并按下列公式計算抑制率聚集抑制率。聚集抑制率(%)= 模型組最大聚集率-給藥組最大聚集率/模型組最大聚集率×100%

大鼠行為缺陷評分標(biāo)準(zhǔn)

附表1 TSNⅡA對缺血再灌注大鼠行為學(xué)評分及腦梗塞率的影響（±SD ）

附表1 TSNⅡA對缺血再灌注大鼠行為學(xué)評分及腦梗塞率的影響（±SD ）

注：與模型對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑 量(mg / kg)動物數(shù)(n) 行為學(xué)評分 腦梗塞率(%)3h 24h假手術(shù)－10 0 0 0模型對照－10 2.90±0.61 2.80±0.58 20.15±7.18尼莫地平 2 10 1.89±0.72** 1.81±0.63** 11.43±6.53**TSNⅡA高 30 10 1.97±0.69** 1.92±0.48** 12.65±6.73**TSNⅡA中 15 10 2.31±0.51** 2.06±0.82** 13.42±7.35*TSNⅡA低 7.5 10 2.67±0.61 2.17±0.54* 17.38±6.45

附表2 TSNⅡA對缺血再灌注大鼠腦含水量和腦指數(shù)的影響（±sD）

附表2 TSNⅡA對缺血再灌注大鼠腦含水量和腦指數(shù)的影響（±sD）

注：與模型對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

腦指數(shù)(g / 100g)假手術(shù)－10 77.98±0.81** 0.445±0.029**模型對照－10 82.13±0.92 0.513±0.027尼莫地平 2 10 78.95±0.73** 0.469±0.017*TSNⅡA高 30 10 79.87±0.91** 0.482±0.017**TSNⅡA中 15 10 80.67±0.88* 0.475±0.041 TSNⅡA低 7.5 10 81.17±0.92 0.489±0.032組別 劑 量(mg / kg)動物數(shù)(n)腦含水量（%）

附表3 TSNⅡA對腦缺血再灌注大鼠血小板聚集率的影響（±sD）

附表3 TSNⅡA對腦缺血再灌注大鼠血小板聚集率的影響（±sD）

注：與模型對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑 量(mg / kg)例數(shù)(n) 血小板聚集率 抑制率(%)1min 5min max假手術(shù)－10 15.98±7.13 8.92±6.37** 26.31±13.16*模型對照－10 22.68±6.32 26.38±15.24 38.54±13.18尼莫地平 2 10 15.18±6.27* 10.17±7.54** 25.23±10.92* 37.14 TSNⅡA高 30 10 16.36±5.47* 14.09±10.87 25.78±9.43* 32.71 TSNⅡA中 15 10 17.43±7.13 12.02±10.23* 25.89±8.65* 32.42 TSNⅡA低 7.5 10 18.65±7.41 12.65±10.59* 26.61±13.56* 30.86

附表4 TSNⅡA對腦缺血再灌注大鼠血液流變性的影響

附表5 TSNⅡA對腦缺血再灌注大鼠血漿中血栓素前列環(huán)素內(nèi)皮素的影響（±sD）

附表5 TSNⅡA對腦缺血再灌注大鼠血漿中血栓素前列環(huán)素內(nèi)皮素的影響（±sD）

注：與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

內(nèi)皮素(ET)假手術(shù)－10 412.46±111.03** 650.49±136.17** 148.26±31.73模型對照－10 647.49±172.81 438.31±140.50 165.31±28.55尼莫地平 2 10 417.38±158.08** 585.55±152.43* 152.95±22.20 TSNⅡA高 30 10 433.54±144.71* 611.93±194.08* 144.74±26.50 TSNⅡA中 15 10 450.53±143.89* 579.87±217.21* 154.79±25.00 TSNⅡA低 7.5 10 513.00±121.93 526.09±165.11 157.62±21.68組別 劑 量(mg / kg)動物數(shù)(n)血栓素(TXB2)6-酮-前列腺素(6-K-PGF1a)

2.3.5 血液流變性的測定 MCAO24h后的大鼠，頸總動脈插管放血，用3.8%的枸櫞酸鈉抗凝，檢測其血液流變性。①全血黏度：采用R－80型錐板式黏度計測定。將3.8%的枸櫞酸鈉抗凝的全血血樣0.8ml均勻注入測試杯中，蓋好定心罩，預(yù)溫、測試、記錄數(shù)據(jù)。②血沉和紅細(xì)胞壓積：取3.8%的枸櫞酸鈉抗凝的全血血樣1ml加于壓積管中觀察血沉（1h），然后將壓積管于3000r/min離心30分鐘，測定紅細(xì)胞壓積。③血漿黏度：全血測試完畢后，剩余血樣3000r/min離心10min，進(jìn)行血漿黏度的測試。血漿黏度的測試步驟同全血，只是在菜單中用鼠標(biāo)選擇血漿粘度項(xiàng)即可，記錄數(shù)據(jù)。

2.3.6 血栓素（TXB2）、前列環(huán)素（6-K-PGF1a）、內(nèi)皮素（ET）含量測定 MCAO 24h的大鼠，頸總動脈插管放血，用消炎痛－EDTA.Na2和抑肽酶（25000u/ml）混合抗凝液（比例4：1）0.1ml按1：15抗凝，3000r/min離心10min，取出血漿放置于－20℃冰箱保存，備齊后送至醫(yī)院放射免疫中心分別測定血栓素（TXB2）、前列環(huán)素（6-K-PGF1a）、內(nèi)皮素（ET）的含量。

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)行為學(xué)評分 3h和24h時，除假手術(shù)組外，其余各組實(shí)驗(yàn)動物均出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng)功能障礙。3h時，丹參酮ⅡA 30mg/kg、15mg/kg組動物的行為學(xué)得分均低于模型組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，呈顯著性差異（P＜0.05）。24h后，丹參酮ⅡA各劑量組動物的行為學(xué)得分均呈下降趨勢，且顯著低于模型組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，呈顯著性差異（P＜0.05），見附表1，提示丹參酮ⅡA可以改善實(shí)驗(yàn)動物的行為學(xué)障礙。

3.2 對腦梗塞率的影響 假手術(shù)組動物大腦無梗塞，模型組大鼠大腦有明顯的梗塞（TTC染色的腦片上出現(xiàn)白斑），丹參酮ⅡA 30mg/kg、15mg/kg、7.5mg/kg組動物的大腦也有不同程度的梗塞，其腦梗塞率分別為12.65%、13.42%和17.38%，均低于模型組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，呈顯著性差異（P＜0.05)。見附表1。提示丹參酮可以明顯降低試驗(yàn)動物的腦梗塞程度。

3.3 對腦含水量的影響 模型組動物的腦含水量顯著高于假手術(shù)組，表明手術(shù)可以導(dǎo)致腦水腫。同時丹參酮ⅡA 30mg/kg、15mg/kg、7.5mg/kg組動物的腦含水量均低于模型組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，呈顯著性差異（P＜0.05 ，P＜0.01）。見附表2。提示丹參酮ⅡA可以降低腦缺血再灌注后的腦含水量和腦指數(shù)，減輕腦水腫。

3.4 對腦缺血再灌注大鼠血小板聚集率的影響 結(jié)果顯示：丹參酮ⅡA各組動物的血小板最大聚集率均明顯低于模型組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，呈顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果見附表3。提示丹參酮ⅡA能夠抑制腦缺血再灌注大鼠的血小板聚集。

3.5 對腦缺血再灌注大鼠血液流變性的影響 丹參酮ⅡA 30mg/kg、15mg/kg、7.5mg/kg組能有效的抑制切速200s-1、1s-1下的全血黏度、血漿黏度，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，呈顯著性差異（P＜0.05、P＜0.01），見附表4；說明丹參酮ⅡA能降低實(shí)驗(yàn)動物的全血和血漿黏度，可以改善實(shí)驗(yàn)動物的血液流變性。但對血沉和紅細(xì)胞壓積，各給藥組均影響不大，見附表4。

3.6 對腦缺血再灌注大鼠血漿中TXB2、6-K-PGF1a、ET的影響 結(jié)果表明,模型組大鼠TXB2含量明顯高于假手術(shù)組, 6-K-PGF1a含量明顯低于假手術(shù)組,與假手術(shù)組比較均有顯著性差異（P<0.01）；丹參酮ⅡA 30mg/kg、15mg/kg組的動物血漿中6-K-PGF1a含量明顯升高,與模型組比較差異顯著（P<0.05）, 而TXB2的含量明顯低于模型組，差異有顯著性；丹參酮ⅡA各給藥組對內(nèi)皮素（ET）的含量影響不大，與模型組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義。見附表5。

4 討論

建立一種接近臨床狀況且重復(fù)性好的動物模型對有效評價藥物對缺血性腦血管病的防治效果非常必要。減輕腦細(xì)胞損傷、縮小腦梗塞范圍、降低腦水腫程度和改善運(yùn)動功能障礙是治療腦梗塞的最終目的，亦可以作為評價藥效的直接指標(biāo)。筆者采用線栓法制備腦缺血再灌注模型，觀察丹參酮ⅡA對腦缺血再灌注大鼠是否具有保護(hù)作用。結(jié)果表明，丹參酮ⅡA可以顯著縮小腦缺血再灌注大鼠的腦梗塞面積，減輕腦水腫，對局灶性腦缺血再灌注大鼠具有明顯的保護(hù)作用。至于丹參酮ⅡA對局灶性腦缺血再灌注保護(hù)作用機(jī)理，還可通過其對粘附分子、白介素等炎癥介質(zhì)的影響及對神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡等方面作進(jìn)一步研究。

血液流變學(xué)改變是腦梗塞發(fā)生發(fā)展的重要因素，緩解和改善腦梗塞病人的血液流變學(xué)特性可減輕腦梗塞造成的機(jī)體損傷，還可預(yù)防腦梗塞的發(fā)生發(fā)展。丹參酮ⅡA可以顯著降低大鼠血液黏度，改善血液流變性，這些藥理作用對腦梗塞康復(fù)非常有用。至于丹參酮ⅡA是通過何種途徑改變血液流變性，還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，丹參酮ⅡA可明顯改善大腦中動脈閉塞所致局灶性腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)學(xué)癥狀，明顯縮小腦梗塞范圍，減輕腦水腫程度；該藥還可以改善試驗(yàn)動物的凝血功能、血液流變性，降低血小板聚集率。因此, 丹參酮ⅡA對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有良好的保護(hù)作用，其作用途徑和詳盡機(jī)制有待進(jìn)一步研究。