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    肺癌組織中miR-125b-1基因的突變及其臨床意義

    2010-10-29 06:22:00霍學(xué)云鄭永明
    實用醫(yī)藥雜志 2010年1期
    關(guān)鍵詞:單鏈基因突變產(chǎn)物

    霍學(xué)云,蘇 琳,鄭永明

    肺癌是常見的惡性腫瘤之一,如今由肺癌及其轉(zhuǎn)移瘤所致的病死率已占癌癥病死率之首。盡早發(fā)現(xiàn)、診斷及治療是降低肺癌病死率的有效途徑,而要做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療就必須明確其發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制。肺癌的形成是一個多階段、多步驟的復(fù)雜過程。微小 RNA(microRNAs,miRNA)與腫瘤的發(fā)生明顯相關(guān)[1],在人類腫瘤中miRNA的表達(dá)水平異?;虬l(fā)生突變[2]。miR-125b-1定位于11q23-24雜合型缺失(LOH)的微小區(qū)域,這一區(qū)域在肺部腫瘤、乳腺癌和卵巢癌中存在突變或缺失[3],提示其可能與肺癌的發(fā)生相關(guān)。目前對miRNA與腫瘤關(guān)系的研究中,通常只是鑒定miRNA的表達(dá)豐度,其核苷酸序列是否突變尚無報道。為了從DNA水平研究miR-125b-1基因異常與肺癌發(fā)生的關(guān)系,筆者應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (PCRSSCP)分析方法檢測人肺癌組織miR-125b-1基因的突變情況,并分析了其與肺癌患者臨床病理生理特征和預(yù)后的關(guān)系。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 119例肺癌組織標(biāo)本取自筆者所在醫(yī)院病理科存檔的2004-06~2006-10的組織蠟塊。其中男92例,女27例;年齡30~76歲,平均(56±12)歲。每例均有詳細(xì)的臨床資料和手術(shù)記錄,所有患者術(shù)前均未進(jìn)行任何抗腫瘤治療。按照WHO標(biāo)準(zhǔn)(1999年第3版)進(jìn)行組織學(xué)分類,鱗癌50例,腺癌51例,大細(xì)胞癌9例,小細(xì)胞癌9例;按國際抗癌聯(lián)盟 (UICC,1997年第5版)TNM分期,T1期 34例,T2期 61例,T3期 22例,T4期 2例;N0期54例,N1期30例,N2期 31例,N3期 4例。另取同期手術(shù)的肺良性病變肺組織42例作對照,其中男28例,女 14 例;年齡 10~60 歲,平均(39±10)歲;支氣管擴(kuò)張14例,肺結(jié)核瘤13例,炎性假瘤11例,肺膿腫4例。

    1.2 患者隨訪資料 以門診、電話、隨訪信形式對119例試驗組患者進(jìn)行隨訪,隨訪時間至2007-05,有隨訪結(jié)果的有94例,失訪25例。94例中,死亡人數(shù)(直接死于肺癌的患者)為63例,截尾人數(shù)(失訪、死于其它原因或持續(xù)生存至本文總結(jié)時)為31例,中位生存期是41個月。

    1.3 模板DNA的提取 石蠟包埋組織模板DNA的提取參考文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。1%瓊脂糖電泳鑒定,紫外分光光度儀測定OD值計算出DNA含量。取200ng作為PCR模板。

    1.4 引物設(shè)計 根據(jù)ensembl數(shù)據(jù)庫中的miR-125b-1基因序列,應(yīng)用在線引物設(shè)計程序primer3(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)設(shè)計引物,并在 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/網(wǎng)站上比對,選擇產(chǎn)物唯一性、大小228bp的引物。引物序列:上游5'-CGAACAGAAATTGCC TGTCA-3',下游 5'-CAATCACCTCAGACAAACTTT CTT-3',由上海生工生物技術(shù)公司合成。

    1.5 PCR擴(kuò)增 20 μl反應(yīng)體系,含10×擴(kuò)增緩沖液2.0 μl,4 種 dNTP 混合物 0.4 μl,引物混合物 2.0 μl,Taq DNA 聚 合 酶 0.1 μl,Mg2+1.2 μl,ddH2O12.3 μl,模板DNA2.0μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性10min;94℃變性 30 s,56℃復(fù)性 30 s,72℃延伸 30 s,共 35個循環(huán)后,最后72℃延伸7min。反應(yīng)完成后,取5μl反應(yīng)液用1%瓊脂糖凝膠電泳,觀察PCR產(chǎn)物擴(kuò)增情況,在預(yù)期位置有清晰擴(kuò)增帶之后進(jìn)行SSCP。

    1.6 SSCP分析 取10 μl PCR產(chǎn)物, 加入 10 μl變性劑 (95%甲酰胺,10mmol/LEDTA,0.02%溴酚藍(lán)),95℃變性5 min,立即于冰浴中驟冷,再于10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(120V,4℃電泳18~20 h)。電泳結(jié)束后將其浸在含0.5 μg/ml溴化乙錠的1×TBE緩沖液中染色30~45 min,在紫外燈下觀察變性后的二條單鏈電泳遷移率,并比較肺癌患者和正常對照者的結(jié)果。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 本組所得數(shù)據(jù)采用χ2檢驗、非參數(shù)統(tǒng)計中Spearman等級相關(guān)、Kaplan-Meier生存曲線分析和對數(shù)秩和檢驗進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)統(tǒng)計在SPSS13.0軟件上進(jìn)行。

    2 結(jié) 果

    2.1 DNA抽提結(jié)果 所抽提DNA樣本濃度及純度,均可用于后續(xù)實驗研究(PCR反應(yīng))。

    2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 設(shè)計的miR-125b-1PCR產(chǎn)物長度228bp,其中包括含有成熟的miR-125b-1發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體序列及其兩側(cè)序列。在119例肺癌組織和42例肺良性病變組織中全部擴(kuò)增成功,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均呈228bp大小的清晰目的片段條帶,由含EB的1%瓊脂糖電泳驗證,見圖1所示。

    圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖M為對照物(100~500bp);1~3為肺癌組織;N為癌旁正常肺組織

    2.3 PCR-SSCP分析 119例肺癌組織和42例肺良性病變組織的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行SSCP后,在同一膠片中進(jìn)行比較,單鏈帶出現(xiàn)異常區(qū)帶者,視為有突變。結(jié)果顯示119例肺癌組織中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有40例(34%)出現(xiàn)異常泳動區(qū)帶,說明在擴(kuò)增的靶片段中檢測到堿基突變。見圖2。

    圖2 PCR-SSCP電泳分析圖ssDNA為單鏈DNA,dsDNA為殘存雙鏈DNA,→為異常泳動區(qū)帶

    2.4 基因突變與肺癌患者臨床病理和生理特征之間的關(guān)系 肺癌組織中miR-125b-1基因突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著性相關(guān),N分期越高者,發(fā)生基因突變概率越高,進(jìn)一步行Spearman相關(guān)分析顯示兩者呈顯著性正相關(guān)(r=0.285,P<0.01);與臨床分期呈顯著性相關(guān),Spearman相關(guān)分析顯示兩者呈顯著性正相關(guān)(r=0.241,P<0.01)。而 miR-125b-1 基因的缺失與肺癌患者細(xì)胞分化程度、病理類型、原發(fā)腫瘤分期等均無明顯關(guān)系(P>0.05)。見表1。

    2.5 肺癌組織中miR-125b-1基因突變與肺癌患者術(shù)后生存率的關(guān)系 將miR-125b-1基因突變組和未突變組進(jìn)行Kaplan-Meier生存曲線分析和對數(shù)秩和檢驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-125b-1基因突變組術(shù)后生存時間顯著低于非突變組(P<0.05),見圖3。

    3 討 論

    微小 RNA(microRNAs,miRNA)是一類近年來新發(fā)現(xiàn)的長約22個核苷酸 (nt)的非編碼的單鏈RNA分子,在生物中廣泛存在,在進(jìn)化中高度保守,在生長、發(fā)育、分化、增殖、凋亡等生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。miRNA最新有關(guān)研究表明:miRNA與腫瘤緊密關(guān)聯(lián),已經(jīng)證實miR-32、miR-125b-1、let-7與肺癌的發(fā)生相關(guān):其中miR-32位于9q31.2,這一區(qū)域在許多腫瘤中是缺失高頻區(qū),包括肺鱗癌[5]、膀胱癌[6]、頭頸部腫瘤[7]等,其表達(dá)在肺癌中降低。在本文119例肺癌組織中有40例發(fā)生突變,突變率34%;而在42例肺良性病變組織中未有突變。本文結(jié)果從分子水平說明miR-125b-1基因突變與肺癌的發(fā)生、發(fā)展可能有密切關(guān)系。

    表1 miR-125b-1基因缺失與肺癌患者臨床和病理生理特征的關(guān)系

    圖3 基因突變組和基因未突變組的Kaplan-Meier生存曲線

    現(xiàn)有的研究表明:miR-125b-1是長約22個核苷酸(22nt)的非編碼 RNA,它是由長 88nt、帶有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pre-miRNA剪切而成,pre-miRNA的序列和結(jié)構(gòu)的變化對于接下來形成成熟的miRNA的剪切反應(yīng)影響很大[8],因此在miRNA加工途徑中任何突變,都可能擾亂基因的正常調(diào)控而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。總之miR-125b-1基因突變有可能是miR-125b-1表達(dá)豐度的下降的原因之一,或與其表達(dá)豐度的下降呈現(xiàn)協(xié)同作用,使成熟miR-125b-1在肺癌中的功能發(fā)生相應(yīng)改變。

    此外,本文比較了肺癌組織中miR-125b-1基因突變與肺癌患者的臨床病理生理特征之間關(guān)系,發(fā)現(xiàn)基因突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系 (P<0.05),且基因突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間存在正相關(guān)關(guān)系,提示可能在肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中起重要作用,增加患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險性。應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線分析,發(fā)現(xiàn)基因突變是肺癌患者預(yù)后不良的危險因素,可能與肺癌進(jìn)展的某些調(diào)控機(jī)制有關(guān)。

    綜上所述,本文結(jié)果提示miRNA基因可能參與了肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程。堿基突變很可能改變miRNA的功能,從而誘發(fā)腫瘤,檢測腫瘤組織特定miRNA序列是否突變,有利于了解腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)理。

    [1]Croce CM,Calin GA.miRNAs,cancer,and stem cell division[J].Cell,2005,122(1):6-7.

    [2]Hammond SM.MicroRNAs as oncogenes.Curr Opin Genet Dev,2006,16(1):4-9.

    [3]Iorio MV,F(xiàn)erracin M,Liu CG,et al.MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer.Cancer Res,2005,65(16):7065-7070.

    [4]張維銘.現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗手冊.北京:科學(xué)出版社,2001.80-85.

    [5]Kanazawa H,Ebina M,Ino-oka N,et al.Transition from squamous cell carcinoma to adenocarcinoma in adenosquamous carcinoma of the lung[J].Am J Path,2000,156:1289-1298.

    [6]Sinoneau M,Aboulkassim T,LaRue H,et al.Four tumor suppressor loci on chromosome 9q in bladder cancer:evidence for two novel candidate regions at 9q22.3 and 9q31[J].Oncogene,1999,18:157-163.

    [7]Beder LB,Gunduz M,Ouchida M,et al.Genome-wide analyses on loss of heterozygosity in head and neck squamous cell carcinomas[J].Lab Invest,2003,83:99-105.

    [8]Bracht J,Hunter S,Eachus R,et al.Trans-splicing and polyadenylation of let-7 microRNA primary transcripts.RNA,2004,10(10):1586-94.

    [2009-09-26收稿,2009-10-28修回]

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