棉苗立枯病拮抗菌的篩選及鑒定

羅燕娜,杜娟,李俊華,徐齊君,趙思峰

(石河子大學(xué)綠洲農(nóng)作物病害防控重點實驗室,石河子832003)

棉苗立枯病拮抗菌的篩選及鑒定

羅燕娜,杜娟,李俊華,徐齊君,趙思峰

(石河子大學(xué)綠洲農(nóng)作物病害防控重點實驗室,石河子832003)

為明確7株拮抗細(xì)菌對棉苗立枯絲核菌在生物防治中的應(yīng)用潛力,通過拮抗菌拌種催芽、溫室盆栽測試、小區(qū)拌種測定及大田拌種測定其防治棉苗爛根病的防治效果。結(jié)果表明,拮抗菌S37和S44具有較好的促生和防病效果。在小區(qū)試驗中,S37和S44對棉苗立枯病的防治效果分別為47.8%和57%,與化學(xué)種衣劑福多甲的效果相當(dāng)。在新疆兵團(tuán)143團(tuán)和148團(tuán)的大田試驗中,S37對棉苗立枯病的防治效果均為37.5%,也與福多甲的防治效果相當(dāng)。通過菌落形態(tài)特征觀察和16S rDNA分析,對防病和促生效果最好的2株拮抗菌S37和S44進(jìn)行了鑒定,結(jié)果表明,這2株拮抗菌均為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

棉花;立枯絲核菌;拮抗菌;篩選;枯草芽孢桿菌

Abstract:CottonRhizoctonia solani-induced damping-off disease is the most important plant disease in Xinjiang cotton region.In order to appraise the applied potentiality of 7 bacteria strains with the antagonistic Rhizoctonia solaniactivity controlRhizoctonia solani-induced damping-off disease.Promoting growth and control effect were screened basing expedite budding,pot trail,plot and field experiment.The result show that S37 and S44 can promote cotton growth and better control cottonRhizoctonia solani-induced dampingoff disease.S37 and S44 had a better control efficacies and were 47.8%and 57%in plot tests respectively,equal the dress seeds with Fuduojia.S37 had a better control efficacy and was 37.5%and 37.5%in field tests in Regiment 143 and Regiment 148 of Shihezi area respectively,equal the dress seeds with FUDUOJ IA.S37 and S44 were identified as Bacillus subtillus basing morphological,physiological characteristic and based on 16S rDNA senquence phylogenetic analysis.

Key words:cotton;Rhizoctomia solani;biocontrol bacteria;screening;B acillus subtillus

立枯病又稱爛根、黑根病,是棉花苗期的主要病害,南、北方棉區(qū)均有發(fā)生[1]。新疆是我國最重要的植棉區(qū),由于地理位置特殊,在棉花播種到成苗期間經(jīng)常遭遇倒春寒,這非常利于由立枯絲核菌(Rhizoctonia solaniKuhn)引起的立枯病的發(fā)生,其不僅造成爛種、爛芽和棉苗死亡,嚴(yán)重時導(dǎo)致大面積棉田缺苗斷壟,甚至毀種重播,造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[2-4]。

立枯絲核菌以菌絲體或菌核在土壤中或病殘體上越冬,在土壤中形成的菌核可存活數(shù)月至幾年,該菌可抵抗高溫、冷凍、干旱等不良環(huán)境條件,適應(yīng)性很強(qiáng),一般能存活數(shù)年,且耐酸堿[1]。因缺乏對該病的抗病品種,對該病的防治目前主要以化學(xué)殺菌劑拌種或種衣劑包衣為主,但使用化學(xué)農(nóng)藥不能從根本上防治棉花立枯病,又帶來環(huán)境污染[5-6]。采用生物防治的方法來防治棉苗爛根病是一種行之有效的技術(shù),此方法既可限制有害微生物生長,又增加了根際有益微生物的數(shù)量,同時可以減少化學(xué)農(nóng)藥帶來的環(huán)境污染,因此,篩選出能夠有效防治該病的生防微生物并制成生物種衣劑以替代化學(xué)農(nóng)藥拌種或化學(xué)種衣劑就十分必要[6]。

本研究對前期篩選獲得的7株拮抗菌作了進(jìn)一步篩選和比較,對2株具有良好防病和促生效果的菌株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定,以明確這2個菌株具體種類和對棉苗爛根病的應(yīng)用潛力,從而為棉花生物種衣劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

棉花品種為新陸早13號,購買于石河子市種子市場。

供試拮抗菌 S23、S37、S44、S48、S71、S158 和S228分離自新疆加工番茄和棉田土壤中,前期研究證明對立枯絲核菌有較好抑制效果。

供試病原菌立枯絲核菌(Rhizoctonia solani Kuhn)為本實驗室分離保存。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)[7]:去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 18 g、蒸餾水 1000 mL,p H 6.8。

營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基(NA)[7]:牛肉膏3 g、蛋白胨 5 g、NaCl 5 g、葡萄糖 10 g、蒸餾水 1000 mL,p H 7.0～7.2。

對照藥劑為福多甲,由新疆康正農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司生產(chǎn),為新疆使用面積較大的棉花專用種衣劑。

土壤為棉田土壤,過篩,在烘箱中160℃滅菌2 h備用。

1.2 方法1.2.1菌體培養(yǎng)

立枯絲核菌培養(yǎng):將斜面保存的菌株接入PDA平板上置于培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)72 h,長滿全皿后備用。

拮抗菌培養(yǎng):將不同拮抗菌分別接入裝有NA培養(yǎng)基的三角瓶中,28℃200 r/min搖床培養(yǎng)48 h,將其稀釋到1×108cfu/mL備用。

1.2.2 拮抗菌室內(nèi)催芽促生效果測定

挑選飽滿、無破損和發(fā)芽率高的棉種浸入配制好的拮抗菌菌懸液3 h,取出、晾干。以福多甲拌種和清水拌種為對照。

用直徑40 cm的托盤,底面均勻水平,在托盤底部墊上滅菌的厚度一致的紗布,將托盤分為5個區(qū),每個區(qū)分別均勻擺放處理好的棉種20粒,將無菌水注入到每個區(qū)域的紗布上,使紗布剛好吸滿,在托盤上覆蓋1層保鮮膜,放入人工氣候箱中25℃培養(yǎng),觀察發(fā)芽時間,3 d后調(diào)查發(fā)芽率,7 d后分別測量各處理的芽長、根長和鮮重。

1.2.3 拮抗菌對棉苗立枯病防病效果測定

盆栽防病效果測定:選用裝土量0.5 kg的培養(yǎng)缽,將培養(yǎng)好的絲核菌接入滅菌土壤中,接菌量為1/4皿每缽,種子處理方法同上。用培養(yǎng)缽裝菌土0.4 kg,每缽播種20粒種子,然后再覆蓋1層滅菌土,每處理設(shè)3個重復(fù),以福多甲和清水處理種子為對照。出苗后,在1片真葉期調(diào)查記錄各處理立枯病的發(fā)病率和病情指數(shù),計算各拮抗菌對棉花立枯病的防治效果[2]。

小區(qū)防病效果測定:小區(qū)試驗在2008年進(jìn)行,2008年4月持續(xù)低溫陰雨天氣,非常有利于棉苗爛根病發(fā)生,發(fā)病十分嚴(yán)重,很多地塊發(fā)病率達(dá)到100%。小區(qū)地點設(shè)在石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院實驗站中,小區(qū)面積共計132 m2,已連續(xù)3年種植棉花,種子處理同上。每個處理3次重復(fù),隨機(jī)排列,人工種植,膜下滴灌,正常管理澆水。出苗10 d后調(diào)查棉苗立枯病的發(fā)病率和病情指數(shù),計算拮抗菌的防治效果。

大田防病效果測定:大田試驗也在2008年進(jìn)行,分設(shè)于2塊地,一塊地設(shè)在143團(tuán)10連,地塊均一,于4月18日播種,播種量為60 kg/hm2播種方式為10 cm+66 cm機(jī)采棉配置,膜寬2.05 m,灌溉方式為膜下滴灌,正常管理。出苗后,于5月13日進(jìn)行調(diào)查,每個處理隨機(jī)抽取3個點,每點抽取50株,記錄發(fā)病率和病情指數(shù),計算防治效果。另一塊地設(shè)在148團(tuán)4連,土質(zhì)均一,于4月10日播種,播種量為67.5 kg/hm2,播種方式為10 cm+66 cm機(jī)采棉配置,膜寬2.05 m,灌溉方式為膜下滴灌。出苗后從5月3日起,每隔5 d調(diào)查1次,記錄發(fā)病率和病情指數(shù),計算拮抗菌的防治效果。

棉苗爛根病分級標(biāo)準(zhǔn):0級,健苗;1級,莖基、根部局部有病斑;2級,1/3～1/2的莖基、根部出現(xiàn)病斑;3級,1/2～2/3的莖基、根部出現(xiàn)病斑;4級,枯死[3]。

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%;

病情指數(shù)=[Σ(各發(fā)病級株數(shù)×代表數(shù)值)/(調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最重級的代表數(shù)值)]×100;

防治效果=[(對照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù))/對照組病情指數(shù)]×100%。

1.2.4 拮抗菌S37和S44的初步鑒定

培養(yǎng)性狀及菌落形態(tài)特征觀察:經(jīng)篩選S37和S44具有較好的防病和促生效果,對其進(jìn)行常規(guī)的革蘭氏染色、菌體形態(tài)和和菌落形狀觀察以及芽孢染色,參照文獻(xiàn)[7]中的方法進(jìn)行。對照菌株革蘭氏陰性菌為大腸桿菌,革蘭氏陽性菌為枯草芽孢桿菌。

生防菌株S37和S44的16S rDNA片段擴(kuò)增和序列分析:菌株基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)[8]的方法。

采用細(xì)菌16S rDNA基因的通用引物16F27(正向引物 :5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和 16R1522(反向引物 :5′-AAG GA G GTG ATC CAG CCG CA-3′)擴(kuò)增參試的細(xì)菌菌株16 S rDNA序列[9-10]。

PCR反應(yīng)體系:基因組DNA 2μL、10×PCR buffer 5μL、10 mmol/L dN TP 4μL、25 mmol/L MgCl23μL、2μmol/L 16F27 5μL、2μmol/L 16R1522 5μL、5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.5μL,加入ddH2O至終體積為50μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸 2 min,35個循環(huán);最后72℃延伸 10 min。反應(yīng)完成后,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步純化后委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。用DNAMAN軟件將測序結(jié)果與其他12個芽孢桿菌菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對,并構(gòu)建系統(tǒng)樹,應(yīng)用自展法(bootstrap)檢驗系統(tǒng)樹,自展數(shù)據(jù)集為1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌對棉種發(fā)芽的影響

由表1可知:除S48外,各拮抗菌處理棉種后都能提高棉種的發(fā)芽率。S37、S44、S71、S158和S228均可促進(jìn)棉花種子提前出芽,同時這幾株拮抗菌還可以明顯增加棉花的芽長、根長和鮮重,其中S71和S228的促生效果最好,鮮重與對照相比分別增加了13.25%和 11.66%,其次為 S158、S44 和 S37,鮮重與對照相比分別增加了7.69%、7.69%和5.88%。S23、S48和福多甲對照處理則促生效果不明顯。

表1 拮抗菌對棉種出芽影響Tab.1 The effect of antagonistic bacteria to cotton seeds germinating

2.2 拮抗菌對棉苗立枯病的防病效果

2.2.1 拮抗菌防治棉苗立枯病盆栽試驗效果

選擇促生效果較好的拮抗菌 S37、S44、S71和S228進(jìn)行盆栽試驗,結(jié)果見表達(dá)式。由表2可知:在土壤中存在立枯絲核菌的情況下,各拮抗菌都可促進(jìn)棉花提前出苗,同時對棉苗立枯病均有一定防治效果。供試菌株中S228防治棉苗爛根病的防效達(dá)到58.9%,但出苗率僅為29.4%,低于對照的出苗率。S37、S44和S71的拮抗菌既可提高棉種的出苗率,同時對棉苗爛根病的防治效果分別達(dá)到21.8%、53.4%和8.2%。在同樣條件下,化學(xué)種衣劑福多甲的防病效果為32.9%。

表2 拮抗菌對棉花立枯病盆栽防病效果Tab.2 Effect of antagonistic bacteria to control cotton damping-off disease in pot trail

2.2.2 拮抗菌防治棉苗爛根病小區(qū)試驗效果

田間小區(qū)試驗的結(jié)果(表3)顯示,4株拮抗菌對棉苗立枯病均有一定的防治效果,4株拮抗菌都可顯著降低棉苗立枯病的發(fā)病率和病情指數(shù),其中S228和S44的相對防效分別達(dá)到了59%和57%,高于種衣劑福多甲54.5%的相對防效,S37和S71的相對防效略低于福多甲,其相對防效分別為47.8%和43.9%。

表3 拮抗菌防治棉花立枯病的小區(qū)試驗結(jié)果Tab.3 Effects of antagonistic bacterium to control cotton damping-off disease in plot tests

2.2.3 拮抗菌防治棉苗爛根病大田試驗效果

所選拮抗菌在2塊大田中對棉苗立枯病均有防治效果(表4)。在143團(tuán)10連發(fā)病較輕的地塊中,其中S37相對防效達(dá)到37.5%,化學(xué)種衣劑福多甲的相對防效為32.55%,S228、S44和S71的相對防效分別為29.61%、20.01%和14.06%,均低于福多甲。148團(tuán)4連棉苗立枯病發(fā)生較為嚴(yán)重,福多甲防病效果最好,其相對防效達(dá)到39.93%;其次為S37,相對防效為37.5%,與福多甲防病效果相當(dāng),S228、S44和 S71的相對防效分別為 19.6%、13.8%和15.1%,均低于福多甲。

表4 大田生產(chǎn)條件下幾種拮抗菌對棉花立枯病的防治作用Tab.4 Effects of antagonistic bacterium to control cotton damping-off disease in the field

2.3 拮抗菌的初步鑒定

2.3.1 拮抗菌的形態(tài)觀察

取防病和促生效果最好的拮抗菌S37和S44進(jìn)行鑒定,經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察,2株拮抗菌菌體形態(tài)均為短桿狀(圖1a)。實驗結(jié)果表明,大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株染色后呈紅色,KOH實驗有明顯的絲狀物拉出,為革蘭氏陰性菌;2株拮抗菌經(jīng)革蘭氏染色后均呈藍(lán)紫色,KOH實驗均無絲狀物拉出,為革蘭氏陽性菌。將培養(yǎng)48 h的2株拮抗菌經(jīng)芽孢染色后鏡檢,可以看見紅色短桿狀的菌體中間有綠色的芽孢,形狀近似橢圓形,并且沒有膨大的孢囊(圖 1b)。

圖1 拮抗菌S37和S44革蘭氏染色和芽孢染色情況Fig.1 Gram stain and sporangium stain of antagonistic bacteria S37 and S44

2.3.2 菌株S37和S44的ITS序列分析

將S37和S44的DNA提取后經(jīng)電泳檢測,所得DNA片段約為22 kbp。以所提的總DNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,均能擴(kuò)增出1條大小約為1500 bp的特異性條帶,純化測序后,菌株 S37和 S44的16S rDNA序列DNA長度分別為870和897 bp。與文獻(xiàn)已經(jīng)報道的具有生物防治作用的并且具有促生作用的 B acillus subtilis進(jìn)行比對,并用 Paeni-bacillus polymy xa作為外群,結(jié)果得到了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 2)。

從圖2可以看出,S37和S44與B acillus subtilis(AM501549)和 B acillus subtilis(FJ984438)親緣關(guān)系最近,相似率達(dá)到100%,通過2株生防菌的16S rDNA分析,初步將S37和S44鑒定為B acillus subtilis。

圖2 菌株S37和S44的系統(tǒng)發(fā)育樹狀Fig.2 Phylogenetic tree based on alignment of strain S37 and S44 and other other 12 Bacillus species including 16S rDNA sequencing data

3 討論

目前,篩選能夠有效防治棉苗爛根病的生防微生物并制成生物種衣劑以替代化學(xué)農(nóng)藥或化學(xué)種衣劑日益受到關(guān)注。

Howell等[11]和 Hagedorn等[12]研究了木霉防治棉花立枯病的生防機(jī)制,認(rèn)為木霉主要通過重寄生、產(chǎn)生抗生素、誘導(dǎo)棉苗根部植保素積累、萜烯類化合物的形成以及在棉株根部的有效定殖來防治棉苗爛根病。Djonovic等[13]研究認(rèn)為木霉能產(chǎn)生1種誘導(dǎo)棉花產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)的蛋白類激發(fā)子Sm1,其能夠誘導(dǎo)棉株活性氧的迸發(fā)和相關(guān)防衛(wèi)基因的表達(dá),從而獲得局部的或系統(tǒng)的抗病性減輕棉花病害的發(fā)生。張亞平等[3,14]和閻小雪等[15]分別從新疆棉田土壤中分離、篩選獲得了對棉苗苗期病害有較好防治作用的芽孢桿菌;紀(jì)春艷等[2]從新疆棉田土壤篩選到了對棉苗立枯病有較好防治作用的拮抗細(xì)菌和放線菌,并初步研究了其防治機(jī)理;羅明等[16]則從新疆不同種植區(qū)的棉花植株組織中分離獲得一批對立枯絲核菌抑菌作用較強(qiáng)的內(nèi)生細(xì)菌。上述研究的結(jié)果均表明,篩選、獲得能夠替代化學(xué)拌種劑的高效生防菌株來防治棉苗爛根病從理論和實踐上都很有發(fā)展前景。

本研究針對前期篩選獲得的對立枯絲核菌具有較好拮抗活性的拮抗細(xì)菌開展了促進(jìn)棉種發(fā)芽和防治棉苗立枯病的研究,結(jié)果表明:拮抗菌株 S37和S44既具有提高棉種發(fā)芽率、促進(jìn)棉花提前出苗和增加棉苗生物量的作用,又能較好地防治棉苗立枯病的效果。在小區(qū)試驗中,S44防病效果好于種衣劑的效果,S37則與種衣劑的防病效果相當(dāng)。在大田試驗中,S37在2個點上的防病效果與種衣劑相當(dāng),而S44的防病效果與種衣劑相差較遠(yuǎn),這可能是由于新疆地域遼闊,生態(tài)環(huán)境復(fù)雜,存在長期低溫或干旱等不利于棉苗生長和生防菌定殖的氣候因子,同時生防菌進(jìn)入棉田土壤后受其他微生物的影響也可能影響其生物活性。如果能在劑型和使用方式上找到能使生防菌活性更穩(wěn)定的制約因子,使其真正能夠發(fā)揮其防病和促生作用將最終可以化學(xué)種衣劑,從而使其具有較好的推廣應(yīng)用前景,這將是今后需要深入探討的重要工作。

對這2株具有應(yīng)用前景的拮抗菌進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定,最終將其鑒定為枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis),這將為明確其防病機(jī)理和適用范圍提供理論和技術(shù)依據(jù)。

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Screening and Identification of Antagonistic Bacteria Control Rhizoctonia solani-onduced Damping-off of Cotton

LUO Yanna,DU Juan,LI Junhua,XU Qijun,ZHAO Sifeng
(The Key Laboratory of Prevention and Control for Oasis Crop Disease,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

S435.111.4;S562

A

1007-7383(2010)05-0555-06

2009-11-19

農(nóng)業(yè)部“948”重大項目(2006-G62),公益性行業(yè)科研專項(農(nóng)業(yè))(200803031),教育部春暉計劃項目(Z2006-1-83016),新疆兵團(tuán)基礎(chǔ)研究計劃項目(ZD2007JC02)

羅燕娜(1985-),女,碩士生,專業(yè)方向為植物病害生物防治;e-mail:luoyn0408@163.com。

趙思峰(1975-),男,副教授,從事植物病害生物防治研究;e-mail:zhsf?agr@shzu.edu.cn。