293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)ARG1及其對(duì)砷代謝的影響

李莉,楊元元,王瑞,張冰蔭,李媛媛,慕曉玲

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832002)

293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)ARG1及其對(duì)砷代謝的影響

李莉,楊元元,王瑞,張冰蔭,李媛媛,慕曉玲

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832002)

研究含有ARGI基因的真核表達(dá)載體PcDNA3.1-IE-ARG1轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后,在細(xì)胞中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞砷代謝的影響。由脂質(zhì)體介導(dǎo)將PcDNA3.1-IE-ARG1轉(zhuǎn)染入293T中,用real-timePCR方法檢測(cè)ARG1基因的表達(dá),用原子吸收分光光度法測(cè)定24h砷染毒后細(xì)胞內(nèi)砷含量及細(xì)胞排砷量。重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中且表達(dá)良好;與轉(zhuǎn)染前細(xì)胞比較,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞在不同濃度砷染毒下細(xì)胞內(nèi)砷含量明顯降低(P<0.05),并且細(xì)胞的排砷量也高于轉(zhuǎn)染前的;此外,轉(zhuǎn)染表達(dá)ARGI基因的細(xì)胞在砷染毒48h后其內(nèi) GSH及 GST的含量高于轉(zhuǎn)染前細(xì)胞。這些表明,ARG1基因在真核細(xì)胞中相對(duì)高表達(dá)后在砷代謝排出中發(fā)揮了一定的作用。

ARG1基因;轉(zhuǎn)染;砷代謝;GSH;GST

Abstract:To examine the expression ofARG1 in eukaryotic cell and the effect of arsenic metabolism after transfecting the eukaryotic cell vector.293T cell was transfected with the recombinant plasmid and the expression of recombinant ARG1 was examined by real-timePCR.Cells were exposed to arsenite for 24h,Arsenite accumulation and efflux of cell was determined by atomic absorption spectrophotometry.The recombinant plasmid was successfully transfected into 293T cell.Arsenite contents in the transfected-cells that were exposed to arsenite with different consistency were lower than those in the 293T cell(P<0.05),and the efflux of cell was higher than those in the 293T cell.The transfected-cells were exposed to arsenite for 48h,intracellular concentration of GSH and GST activity were higher than those in the 293T cell.ARG1 plays an important role in arsenic metabolism after high expression of ARG1 in eukaryotic cell.

Key words:ARG1gene,transfection;arsenic metabolism;glutathiome;glutathione-S-transferase

谷胱甘肽(glutathiome,GSH)及谷胱甘肽轉(zhuǎn)-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase,GST)已被證明在砷的代謝過程中發(fā)揮重要作用。了解影響砷代謝的因素對(duì)解析砷中毒發(fā)生機(jī)制具有重要意義,ARG1(arsenite related gene 1)基因是顧永清[1-2]等人從胎腦中獲得mRNA建立cDNA文庫克隆出的一條新基因,全長 2255bp,開放閱讀框(ORF)1532bp,該基因在未用砷染毒的細(xì)胞中幾乎不表達(dá),而在砷染毒細(xì)胞中表達(dá)量明顯增加,且有隨劑量增加表達(dá)量亦增加的趨勢(shì)。他們推測(cè)ARG1可能是一條新的砷代謝相關(guān)基因。本實(shí)驗(yàn)通過真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)ARG1基因,檢測(cè)細(xì)胞砷代謝相關(guān)指標(biāo)的變化,從而進(jìn)一步確定ARG1基因的抗砷作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

H-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于 G ibco公司;Lipofectamine2000試劑購于invitrogen公司;DNA少量質(zhì)粒抽提試劑盒購于 T akara公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自北京華美生物工程公司。二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司;GSH測(cè)定試劑盒、GST測(cè)定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.1.2 質(zhì)粒及細(xì)胞

293T細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室所存,ARG1質(zhì)粒及pcDNA3.1載體購于北京泛基諾科技有限公司,PcDNA3.1-IE-ARG1質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒抽提

對(duì)PcDNA3.1-IE-ARG1質(zhì)粒及PcDNA3.1空質(zhì)粒進(jìn)行小量抽提純化,方法按照質(zhì)粒抽提試劑盒說明書進(jìn)行,用于轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%FBS、雙抗的 H -DMEM的培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞,無菌條件下置于75 mL培養(yǎng)瓶中37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長滿瓶底后,棄原液,PBS沖洗2遍,加0.125%胰酶1 mL,放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中消化1 min,加適量含10%FBS、雙抗的 H -DMEM的培養(yǎng)基終止消化,移入10 mL的離心管中1000 r/min離心7 min,棄上清,加入6mL H-DMEM培養(yǎng)基吹打成細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),取適量細(xì)胞懸液稀釋后鋪入6孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法,設(shè)三組即 P cDNA3.1-IE-ARG1轉(zhuǎn)染組、空載體組,未轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染前1 d用0.25%胰酶消化293T細(xì)胞,加入適量的H-DMEM終止消化,移入10 mL的離心管中1000 r/min離心 7 min,棄上清,加入 6mL HDMEM培養(yǎng)基吹打成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù),將5×105個(gè)每孔細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)24 h,次日細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%,棄原液,PBS沖洗1遍,加入無血清、無雙抗的DMEM培養(yǎng)24 h,將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-IE-ARG1和空質(zhì)粒pcDNA3.1分別取2 μg,分別加入無血清、無雙抗的 H -DMEM培養(yǎng)基250μL作為A液,Lipofectamine2000 8μL加入到250μL無血清、無雙抗的 H -DMEM培養(yǎng)基作為B液,5 min內(nèi)混勻,室溫放置20 min,PBS沖洗6孔板中的293T細(xì)胞1次,然后將混合后的轉(zhuǎn)染液加入其中,放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h,之后換含10%FBS、雙抗的 H -DMEM的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),用real-timePCR方法檢測(cè)基因表達(dá)。其余細(xì)胞分別加入含NaAsO2濃度為0、4、8μmol/L的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h檢測(cè)ARG1基因表達(dá)情況。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi) G SH與 G ST含量測(cè)定

取含 N aAsO2濃度為 0 、4、8μmol/L 的培養(yǎng)基,培養(yǎng)48h的轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞2×107個(gè)/mL,PBS沖洗2次,冰浴中勻漿,15000 r/min,4℃離心10 min,分別按照試劑盒說明操作檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) G SH和 G ST含量。本實(shí)驗(yàn) GSH及 GST測(cè)定采用二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)法。

1.2.5 細(xì)胞內(nèi)砷蓄積及排出

取轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞按2×107個(gè)/mL密度種于100 mm的一次性培養(yǎng)皿中,用不含砷的 H -DMEM(含10%FBS)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞鋪至70%～80%,換成含NaAsO2濃度為1、4、8μmol/L 的 H -DMEM(含 1 0%FBS),繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)皿中液體于干凈的離心管中,用PBS沖洗 3 次,加入不含砷的 H-DMEM(含10%FBS)培養(yǎng)基培養(yǎng),分別于24 h,48 h收集其培養(yǎng)基,用原子熒光分光光度計(jì)檢測(cè)培養(yǎng)基中砷含量,間接反映轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)砷蓄積及排出量的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間的比較采用 t 檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞結(jié)果

轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組細(xì)胞48 h后,在激光共聚焦顯微鏡下觀察可見細(xì)胞膜上熒光較強(qiáng),如圖1 b所示,鏡下觀察并計(jì)算轉(zhuǎn)染率為70%以上;而未轉(zhuǎn)染組與空載體組沒有熒光顯示,如圖1a和c所示。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞情況(×400)Fig.1 Observe the transfection of recombinant plasmid by laser scanning confocal microscopy(x400)

2.2 293T細(xì)胞中ARG1基因mRNA表達(dá)的檢測(cè)

以β-actin為內(nèi)參,Real-time PCR反應(yīng)ARG1、β-actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)性良好,擴(kuò)增曲線呈“S”形指數(shù)擴(kuò)增(見圖2)條件符合相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果說明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組的293T細(xì)胞有ARG1基因表達(dá),且隨著砷染毒濃度的增加有著ARG1基因相對(duì)表達(dá)量亦增加的趨勢(shì),在砷染毒濃度為0、4、8 μmol/L時(shí)相對(duì)應(yīng)的ARG1基因相對(duì)表達(dá)量分別為2.83×10-3±0.2×10-3,3.07×10-3±0.2×10-3,3.58×10-3±0.17×10-3(見圖3)。而空載體組與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞幾乎中沒有ARGI基因mRNA的表達(dá)。

圖2 ARG1基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線、擴(kuò)增曲線、溶解曲線Fig.2 The amplification,melting and standard curves of ARG1 gene

圖3 不同濃度砷染毒48h重組質(zhì)粒組細(xì)胞內(nèi)ARG1mRNA的表達(dá)Fig.3 The expression of ARG1mRNA in the group of recombinant plasmid after 48h exposure to various concentrations of arsenite

2.3 細(xì)胞內(nèi)GSH含量與GST活性的測(cè)定結(jié)果

不同濃度砷染毒48 h后,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組細(xì)胞內(nèi)的GSH含量與 G ST活性增高,與未轉(zhuǎn)染組及空載體組細(xì)胞相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 細(xì)胞內(nèi)GSH含量和 G ST含量比較Tab.1 Cellular GSH levels and GST enzyme activity in cells

表1 細(xì)胞內(nèi)GSH含量和 G ST含量比較Tab.1 Cellular GSH levels and GST enzyme activity in cells

注:與未轉(zhuǎn)染組及空載體組相比,＊表示 P<0.05。A為未轉(zhuǎn)染組;B為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組;C為空載體組。

組別 砷濃度/(μmol/L)GSH含量/(g/g protein)GST含量/(U/mg protein)0 5.51±0.09 55.91±1.0 A 4 7.48±0.14 64.05±2.74 8 8.63±0.01 74.22±1.21 0 5.46±0.03 54.83±0.75 B 4 10.06±0.35＊102.34±5.74＊8 10.56±0.14＊165.11±7.83＊0 5.18±0.34 51.27±4.68 C 4 7.06±0.70 63.53±3.62 8 8.61±0.97 73.7±2.1

2.4 細(xì)胞內(nèi)砷蓄積及排出能力的測(cè)定結(jié)果

不同濃度砷染毒24 h后,轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞內(nèi)砷的蓄積量降低,排砷能力增高,與未轉(zhuǎn)染組及空載體組細(xì)胞相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 不同濃度砷染毒24h細(xì)胞內(nèi)砷蓄積及排出量比較Fig 4.The comparison of intracellular arsenic efflux for 48h after 24h exposure to various concentrations of arsenite

3 討論

砷中毒能引發(fā)生物體多系統(tǒng)損傷,因此砷中毒發(fā)生機(jī)制備受關(guān)注。砷廣泛分布,使得長期暴露于砷環(huán)境的個(gè)體產(chǎn)生了抗砷性,具有相應(yīng)的基因介導(dǎo)來對(duì)抗砷毒的機(jī)制[3]。砷的毒性作用以及細(xì)胞對(duì)砷產(chǎn)生抗性涉及到眾多基因的參與,至今抗砷基因的研究在原核生物已經(jīng)比較清楚,對(duì)真核生物特別是哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的抗砷基因及其抗砷機(jī)制的研究乃處于起始階段。Wang[4]首次報(bào)道了哺乳動(dòng)物(中國倉鼠V79)細(xì)胞也具備可誘導(dǎo)的對(duì)砷的耐受性,發(fā)現(xiàn)并克隆了兩條具有抗砷性的cDNA片段asr1和asr2;進(jìn)一步的研究顯示,在人體內(nèi)也存在著抗砷基因及抗砷相關(guān)基因:Kurdi-Haidar[5]等首先分離出了一條人類的與細(xì)菌arsA同源的基因(hARSA-I),該基因?qū)貯TP酶超基因家族,沒有跨膜區(qū);楊磊[6-7]等從人胎腦cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)并克隆出了中國倉鼠asr2的同源基因hARRG;Brambila[8]等用低劑量砷長期誘導(dǎo)對(duì)人前列腺上皮細(xì)胞株做癌性轉(zhuǎn)化時(shí)培養(yǎng)出了能穩(wěn)定耐砷的細(xì)胞株。

ARG1基因通過 GenBank上作BLASTn和BLASTx同源性比較時(shí)發(fā)現(xiàn)其與日本NEBO human cDNA sequencing project在 GenBank上登陸的A K000371是不同的剪切體,而關(guān)于 A K000371編碼的蛋白沒有任何報(bào)道。ARG1蛋白的氨基酸序列于GenBank上作BLASTn和BLASTx同源性比較時(shí),沒有發(fā)現(xiàn)與已知功能蛋白同源的蛋白質(zhì),說明ARG1是一個(gè)未知功能的新基因。當(dāng)ARG1蛋白的氨基酸序列于 GenBank上作 PSI-BLAST時(shí),與一個(gè)116kD的液泡-ATP酶亞基家族同源性最高,提示ARG1具有一個(gè)液泡-ATP酶(Vacuolar-A TPase,V-ATPase)樣的功能域。V-ATP酶屬于ATP依賴的質(zhì)子泵,負(fù)責(zé)真核細(xì)胞細(xì)胞器內(nèi)的酸化反應(yīng),細(xì)胞器內(nèi)的酸化反應(yīng)參與許多重要的細(xì)胞反應(yīng),尤其是膜運(yùn)輸反應(yīng)。顧永清等[2]前期研究表明ARG1基因在未用砷誘導(dǎo)的細(xì)胞中幾乎不表達(dá),而在砷誘導(dǎo)細(xì)胞中表達(dá)量明顯增加,且有隨劑量增加表達(dá)量亦增加的趨勢(shì);據(jù)此認(rèn)為ARG1可能是一條新的全長砷代謝相關(guān)基因。

本次試驗(yàn)成功轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞,研究該基因是否參與砷代謝過程。GSH與GST在砷代謝過程中發(fā)揮重要作用。GSH是機(jī)體內(nèi)一種重要的抗氧化物,可以清除多種自由基,其水平增高可以減輕砷中毒引起的氧化應(yīng)激毒性作用[9],在砷的代謝過程中GSH還可與三價(jià)砷結(jié)合形成砷-硫復(fù)合物加速砷排出體外,并參與無機(jī)砷代謝中的還原甲基化過程[10-11]。GST是機(jī)體內(nèi)參與外源性化學(xué)物質(zhì)代謝解毒和活化的Ⅱ相代謝酶系,是砷代謝過程的限速酶[12]。在 Romach[13]和 Wang[14]的研究中發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞排砷能力的增加與細(xì)胞內(nèi) GSH及 GST水平升高有關(guān)。另有有資料顯示,在生理?xiàng)l件下,存在一個(gè)依賴 MRP2的谷胱甘肽輸出體系,通過MRP2與GSH共轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制將內(nèi)源性有毒物質(zhì)共同泵出細(xì)胞外,并且細(xì)胞內(nèi) GSH水平可調(diào)節(jié)MRP2對(duì)底物的主動(dòng)外運(yùn)[15]。高怡等[16]研究表明MRP2轉(zhuǎn)運(yùn)砷及其代謝產(chǎn)物的作用與細(xì)胞內(nèi) GSH水平相關(guān),抑制 GSH合成,可使MRP2-GSH共轉(zhuǎn)運(yùn)功能減弱,進(jìn)一步導(dǎo)致砷在肝臟內(nèi)蓄積增加。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示ARG1基因在293T細(xì)胞中隨著砷染毒濃度的增加相對(duì)表達(dá)量逐漸增加;與對(duì)照組細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染ARG1基因組細(xì)胞內(nèi) GSH含量與 GST活性增高,細(xì)胞排砷能力增高,細(xì)胞內(nèi)砷蓄積量降低,但隨著砷染毒濃度的增加各組細(xì)胞內(nèi)砷蓄積量逐漸增高,排砷能力逐漸降低。由此推斷ARG1基因是一條與砷代謝相關(guān)的抗砷基因,在低濃度砷中毒時(shí),它可能是通過增強(qiáng)多藥耐藥相關(guān)蛋白與谷胱甘肽共同轉(zhuǎn)運(yùn)體功能來促進(jìn)砷代謝及其產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)排出進(jìn)行,進(jìn)一步提高了細(xì)胞對(duì)砷的耐受性,但其具體的作用機(jī)制還有待深入研究。

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Expression of ARG1 Gene in 293T Cell and Its Influence on Arsenic Metabolism

LI Li,YANG Yuanyuan,WANG Rui,ZHANG Bingyin,LI Yuanyuan,MU Xiaoling
(Medical College of Shihezi University/Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases,Shihezi 832002,China)

R541.4

A

1007-7383(2010)05-0582-05

2010-03-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30360095)

李莉(1981-),女,碩士生,專業(yè)方向?yàn)榄h(huán)境與基因、干細(xì)胞研究。

慕曉玲(1962-),女,教授,從事環(huán)境與基因、干細(xì)胞研究;e-mail:xiaolingmr@163.com 。