亞砷酸鈉對NIT-1細(xì)胞增殖及胰島素基因表達(dá)的影響

王瑞,張冰蔭,李莉,李媛媛,楊元元,慕曉玲

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院∕新疆地方與民族高發(fā)病重點實驗室,石河子832002)

亞砷酸鈉對NIT-1細(xì)胞增殖及胰島素基因表達(dá)的影響

王瑞,張冰蔭,李莉,李媛媛,楊元元,慕曉玲

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院∕新疆地方與民族高發(fā)病重點實驗室,石河子832002)

為了觀察亞砷酸鈉(NaAsO2)對胰島β細(xì)胞NIT-1增殖及胰島素(Insulin)基因表達(dá)的影響,本實驗使用不同濃度的NaAsO2(1,2,4,8,16和32μmol/L)分別不同時間(24 h和48 h)作用于NIT-1細(xì)胞,以MTT法檢測細(xì)胞的增殖活性,RT-PCR方法檢測Insulin mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示:1)NaAsO2對NIT-1細(xì)胞增殖活性的影響:當(dāng)NaAsO2濃度小于2μmol/L的時候輕度促進(jìn)NIT-1細(xì)胞增殖(P>0.05)。當(dāng)NaAsO2濃度大于4μmol/L時抑制細(xì)胞增殖(P<0.01),細(xì)胞增殖抑制率隨NaAsO2濃度的增加及作用時間的延長而增加(P<0.01)。2)NaAsO2(1,4和8μmol/L)對NIT-1細(xì)胞Insulin mRNA的表達(dá)的影響:作用24 h,各劑量組Insulin mRNA表達(dá)降低,其中8μmol/L組與對照組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義;作用48 h,各劑量組 Insulin mRNA表達(dá)降低,其中4μmol/L組和8μmol/L組與對照組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。由此可得出砷對NIT-1細(xì)胞增殖及 Insulin基因表達(dá)的影響與作用時間、劑量有關(guān),Insulin mRNA表達(dá)水平的改變可能是砷影響胰島β細(xì)胞功能進(jìn)而引發(fā)糖尿病的機(jī)制之一。

砷;NIT-1細(xì)胞;胰島素基因;糖尿病

Abstract:T o investigate the effects of NaAsO2on proliferation and insulin mRNA expression of NIT-1 insulinoma cells(pancreatic isletβ-cells),NIT-1 cells were cultured with NaAsO2(1,2,4,8,16and32μmol/L respectively).NIT-1 cells were incubatedfor 24 and 48h,and then the vability were determined by MTT.Meanwhile,the levels of insulin mRNA expression were detected by RT-PCR method.The results display:1)The proliferation of NIT-1 insulinoma cells:The proliferation of NIT-1 insulinoma cells was slightly promoted by NaAsO2when its concentration was in 0-2μmol/L(P>0.05).However,the proliferation of NIT-1 insulinoma cells was inhibited by degrees in time-and dose dependant manner as the concentration of NaAsO2was higher than 4μmol/L(P<0.01).2)Insulin mRNA expression of NIT-1 insulinoma cells were evaluated in the presence of 1,4 and 8μmol/L NaAsO2for 24h and 48h:NaAsO2decreased insulin mRNA expression in all groups.We also showed a significant decrease in insulin mRNA expression of cells exposed to 8μmol/L NaAsO2during 24h and exposed to 4 or 8μmol/L NaAsO2during 48h.Our data suggest that acting on the timing and concentrations,arsenic can exert both stimulatory and inhibitory effects on the prolieration and insulin mRNA expression of NIT-1 insulinoma cells.Influnce of Arsenic on the alteration of insulin mRNA expression may be involved the function of pancreatic isletβ-cells and led to diabetes mellitus.

Key words:arsenic;NIT-1 insulinoma cells;insulin gene;diabetes mellitus

砷(As)是自然界中普遍存在的一種毒性很強(qiáng)的類金屬元素,以不同的化學(xué)形式存在于自然界。人類攝砷的主要途徑是飲水和食物,食物中含有機(jī)砷和無機(jī)砷,飲水中則主要含無機(jī)砷。砷的污染已嚴(yán)重影響許多國家的公眾健康[1-2],我國青藏高原、云貴高原和新疆由于其地理環(huán)境的特殊性,現(xiàn)已查明部分地區(qū)存在砷、碘、氟、硒等異常,導(dǎo)致其相關(guān)疾病的發(fā)病率增加。慢性接觸砷可以導(dǎo)致肺損傷、外周神經(jīng)損傷、皮膚病或心血管病,并且是引起皮膚癌、膀朧癌、肝癌、肺癌的因素之一[3-5]。近年來大量流行病調(diào)查結(jié)果顯示,長期接觸砷可以導(dǎo)致糖尿病(diabetes mellitus,DM)的發(fā)生[6-10]。2002年 Tseng等[7]認(rèn)為由環(huán)境因素慢性接觸砷可引發(fā)2型糖尿病(T2DM)。胰島素抵抗和β細(xì)胞功能障礙是 T2DM發(fā)病的兩大機(jī)制,胰島素抵抗是 T2DM發(fā)生的始動因素,而胰島β細(xì)胞功能正常與否則是 T2DM是否發(fā)生的決定因素。

砷對胰島β細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制在砷與DM關(guān)系的研究中至關(guān)重要。本研究以轉(zhuǎn)基因小鼠胰島β細(xì)胞(NIT-1細(xì)胞)為研究對象,觀察不同劑量NaAsO2作用不同時間后細(xì)胞活性,并采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測Insulin mRNA的表達(dá)變化,初步探討砷影響胰島素β細(xì)胞功能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

NIT-1細(xì)胞株由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室提供。NaAsO2(美國Sigma公司),低糖胎牛血清培養(yǎng)液(DMEM)培養(yǎng)基(Gibco公司)、胎牛血清(FBS,Hyclone公司)、PBS平衡鹽粉、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞酚(DMSO)、胰酶(美國Sigma公司)。RNA提取試劑(Trizol),(美國Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄體系、PCR體系(Fermentas公司)。Insulin引物、β-actin引物(上海捷瑞生物工程有限公司)。無水乙醇等其他試劑均為國產(chǎn)分析純以上等級。

1.2 方法1.2.1 NIT-1細(xì)胞培養(yǎng)

采用低糖DMEM培養(yǎng)基加10%的胎牛血清,置于37℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),2-3 d換液,當(dāng)細(xì)胞生長密度>80%時(4-5 d)胰酶消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞活力實驗

用胰酶消化培養(yǎng)皿中處于對數(shù)生長期的細(xì)胞為單細(xì)胞懸液,以每孔1.0×104～1.5×104的密度接種于96孔板,每孔培養(yǎng)液體積為100μL,待細(xì)胞貼壁后吸出培養(yǎng)液 ,分別加入含 0(對照組)、1、2、4、8、16和32μmol/L濃度的NaAsO2培養(yǎng)液,繼續(xù)分別培養(yǎng)24 h和48 h。每組設(shè)6個平行孔,以MTT法在酶聯(lián)免疫檢測儀上檢測各組在490 nm波長的吸光度值,以對照組吸光度值為參照,其他各濃度組與其比較,計算各組的細(xì)胞抑制率。此實驗重復(fù)3次。

1.2.3 NIT-1細(xì)胞Insulin mRNA表達(dá)的RT-PCR半定量檢測

不同劑量 NaAsO2作用后,提取總 RNA,將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后行PCR。各基因引物序列及反應(yīng)條件如下:

PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃1 min,60℃30 s,72℃1 min,30個循環(huán);72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物分析經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)觀察,照相。對目的片段和β-actin內(nèi)參片段相應(yīng)條帶進(jìn)行光密度值檢測。

靶基因mRNA相對表達(dá)量=靶基因光密度值/β-actin光密度值。

1.2.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果

NaAsO2對NIT-1細(xì)胞增殖抑制率隨濃度和時間變化見圖1。

結(jié)果顯示NaAsO2對細(xì)胞增殖的抑制作用呈濃度和時間依賴性,當(dāng)NaAsO2濃度小于2μmol/L的時候促進(jìn) NIT-1細(xì)胞增殖(P>0.05)。當(dāng)NaAsO2濃度大于4μmol/L時抑制細(xì)胞增殖(P<0.01),細(xì)胞增殖抑制率隨NaAsO2濃度的增加及作用時間的延長而增加(P<0.01)。

圖1 不同濃度NaAsO2作用NIT-1細(xì)胞生長抑制曲線(±S,n=3)Fig.1 The inhibition ratio of NIT-1 insulinoma cells treated with NaAsO2

2.2 NaAsO2對NIT-1細(xì)胞 Insulin基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

用 RT-PCR方法檢測不同濃度NaAsO2處理后的NIT-1細(xì)胞 Insulin mRNA的表達(dá),可見512 bp處的β-actin基因(cDNA)條帶和210 bp處的Insulin基因(cDNA)條帶(圖2)。

對條帶進(jìn)行光密度分析,測得 Insulin mRNA相對表達(dá)量,NaAsO2作用24 h,各劑量組 Insulin mRNA表達(dá)降低,其中8μmol/L組與對照組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義;NaAsO2作用48 h,各劑量組Insulin mRNA表達(dá)降低,其中4μmol/L組和8μmol/L組與對照組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1,圖3)。

表1 不同濃度NaAsO2作用NIT-1細(xì)胞Insulin mRNA相對表達(dá)量(insulin/β-actin)±S,n=3Tab.1 Relative level of insulin mRNA expression of NIT-1 insulinoma cells

表1 不同濃度NaAsO2作用NIT-1細(xì)胞Insulin mRNA相對表達(dá)量(insulin/β-actin)±S,n=3Tab.1 Relative level of insulin mRNA expression of NIT-1 insulinoma cells

注:＊表示與對照組比較 P<0.05。

組別 24 h 48 h對照 1.2117±0.0602 1.2224±0.0913 1μmo/L 1.1546±0.0466 1.193±0.0769 4μmo/L 1.1326±0.0634 1.1143±0.0909＊8μmo/L 1.0265±0.0394＊0.9903±0.0388＊

圖3 不同濃度NaAsO2作用NIT-1細(xì)胞Insulin mRNA表達(dá)的影響Fig.3 The effect of NaAsO2on insulin mRNA expression of NIT-1 insulinoma cells

3 討論

DM是一種慢性疾病,已成為世界范圍的嚴(yán)重危害人們健康的疾病,因此預(yù)防和控制DM已成為世界各國亟待解決的問題。近年來流行病調(diào)查資料已顯示,長期接觸砷可以導(dǎo)致DM的發(fā)生[6-10],砷也可能是DM發(fā)生發(fā)展的另一重要因素之一。

目前大家公認(rèn)的DM的病因與機(jī)制:DM不是唯一病因所致的單一疾病,而是復(fù)合病因的綜合癥,與遺傳、自身免疫及環(huán)境因素有關(guān)。從胰島β細(xì)胞合成和分泌Insulin,經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)體內(nèi)各組織器官的靶細(xì)胞,與特異受體結(jié)合,引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝的效應(yīng),在這個過程中任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生變異,均可導(dǎo)致DM。而砷引發(fā)DM的作用環(huán)節(jié)和機(jī)制的資料報導(dǎo)甚少,砷作用的具體機(jī)制目前仍未闡明,砷可以通過多種途徑參與影響細(xì)胞增殖及基因表達(dá)等。本實驗發(fā)現(xiàn)低濃度砷對胰島β細(xì)胞功能產(chǎn)生一定程度的影響,MTT結(jié)果顯示NaAsO2抑制NIT-1細(xì)胞的增殖呈濃度和時間依賴性,選擇在NaAsO2不引起胰島細(xì)胞明顯死亡的濃度和時間范圍內(nèi)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),NaAsO2可以抑制胰島β細(xì)胞 Insulin mRNA表達(dá)并具有時間劑量依賴性,而 Insulin合成與Insulin mRNA表達(dá)密切相關(guān)。因此,砷可以通過影響胰島β細(xì)胞Insulin mRNA的表達(dá),進(jìn)而影響Insulin合成功能。這也可能是砷引發(fā)DM的機(jī)制之一,其具體作用機(jī)制以及是否還影響 Insulin分泌有待繼續(xù)研究。

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The Effect of NaAsO2on Proliferation and Insulin mRNA Expression of NIT-1 Insulinoma Cells

WANG Rui,ZHANG Bingyin,LI Li,LI Yuanyuan,YANG Yuanyuan,MU Xiaoling
(Medicine College,Shihezi University/Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases,Shihezi 832002,China)

R329.1

A

1007-7383(2010)04-0457-04

2009-10-11

王瑞(1979-),男,碩士生,專業(yè)方向為砷與糖尿病關(guān)系的研究。

慕曉玲(1962-),女,教授,從事砷與糖尿病關(guān)系的研究;e-mail:xiaolingmr@163.com。