• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    細(xì)胞外鈣受體調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞游離鈣離子濃度的研究

    2010-10-28 06:21:42陳雄英王振煥胡清華鐘華鄧峰美何芳
    關(guān)鍵詞:游離鈣內(nèi)鈣精胺

    陳雄英,王振煥,胡清華,鐘華,鄧峰美,何芳

    (1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方與民族高發(fā)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832002;2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院/衛(wèi)生部呼吸系統(tǒng)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢430030)

    細(xì)胞外鈣受體調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞游離鈣離子濃度的研究

    陳雄英1,王振煥1,胡清華2,鐘華1,鄧峰美1,何芳1

    (1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方與民族高發(fā)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832002;2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院/衛(wèi)生部呼吸系統(tǒng)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢430030)

    為探討人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)游離鈣離子濃度是否受細(xì)胞外鈣受體(CaR)的調(diào)節(jié)。采用Western blot及RT-PCR技術(shù)檢測(cè)CaR在 HUVEC中蛋白及mRNA表達(dá)。使用CaR激動(dòng)劑精胺,負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Calhex231,通過鈣熒光探針(Fura-2/AM)負(fù)載 HUVEC檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)。結(jié)果顯示:(1)HUVEC中有CaR的表達(dá)。(2)在Fura-2/AM負(fù)載 HUVEC中加入精胺刺激,[Ca2+]i為△ratio=0.24±0.01,先加入Calhex231作用1min后再加入Calhex231+精胺刺激,[Ca2+]i為△ratio=0,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由此可知,CaR調(diào)節(jié) HUVEC游離鈣離子濃度。

    細(xì)胞外鈣受體;Calhex231;細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度

    Abstract:To study whether intracellular Ca2+concentration([Ca2+]i)is regulated by Ca-sensing receptor(CaR)in human umbilical vein endothelial cells(HUVEC).CaR protein was demonstrated by Western blot.The mRNA expression of CaR was investigated by RT-PCR in HUVEC.The fluorescence Ca2+indicator Fura-2/AM was used to observe[Ca2+]iin the presence of CaR agonists spermine and negative allosteric modulator Calhex231.(1)CaR is present in HUVEC.(2)There was significantly difference in[Ca2+]ibetween spermine(△ratio=0.24 ±0.01)and Calhex231+spermine(△ratio=0)(P<0.05).CaR regulates[Ca2+]iin HUVEC.

    Key words:calcium-sensing receptor;Calhex231;intracellular Ca2+concentration

    鈣離子作為金屬離子并不象其它大分子可被表達(dá)和降解,其無論在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外執(zhí)行功能必須首先達(dá)到或維持一定濃度,而且在細(xì)胞內(nèi)外維持一定的濃度差。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度可由各種信號(hào)分子、鈣泵及鈣離子通道等多種因素精確調(diào)控。其中包括由細(xì)胞外鈣受體(The extracellular Ca-sensing receptor,CaR)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣池釋放和電壓門控性鈣離子通道(Voltage-gated Ca2+channels,VOC)、受體操縱鈣離子通道(Receptor-operated channels,ROC)、及瞬時(shí)型感受器電位(transient receptor potential canonical,TRPC)通道等介導(dǎo)的外鈣內(nèi)流[1,2]。有研究表明在人的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)中,激動(dòng)劑ATP、組胺通過觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣池釋放激活小電導(dǎo)系數(shù)鈣敏感鉀通道(small-conductance,SKCa)和中電導(dǎo)系數(shù)鈣敏感鉀通道(intermediateconductance Ca2+-activated K+,IKCa),介導(dǎo)細(xì)胞膜超極化。而這種激動(dòng)劑觸發(fā)的細(xì)胞內(nèi)鈣池釋放是否與激活 G蛋白偶聯(lián)受體有關(guān)尚不清楚[3],有待進(jìn)一步研究。

    CaR為 G蛋白偶聯(lián)受體超家族中的成員,屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族中C亞族的成員,其基本結(jié)構(gòu)與一般 G蛋白偶聯(lián)受體相同,由1078個(gè)氨基酸組成[4]。該受體最早克隆于甲狀旁腺,在維持全身鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用,通過感受細(xì)胞外Ca2+濃度(extracellular Ca2+concentration,[Ca2+]o)變化調(diào)節(jié)甲狀旁腺素(PTH)的分泌。當(dāng)[Ca2+]o升高時(shí),激活 CaR經(jīng)磷脂酶 C(phospholipid lipoidase,PLC),增加胞內(nèi)三磷酸肌醇和二磷酸甘油,使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(intracellular Ca2+concentration,[Ca2+]i)升高、抑制PTH的分泌。

    本研究以原代培養(yǎng) HUVEC為研究對(duì)象,通過鈣熒光探針(Fura-2/AM)負(fù)載 HUVEC檢測(cè)精胺與Calhex231+精胺共孵育時(shí)[Ca2+]i的變化。探討HUVEC游離鈣離子濃度是否受CaR的調(diào)節(jié)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    剖宮產(chǎn)健康胎兒的新鮮臍帶,性別、體重不限。

    ECM培養(yǎng)基購(gòu)自 Sciencellg公司,精胺、Calhex231為 sigma公司產(chǎn)品。CaR一抗為 Affinity Bioreagents產(chǎn)品。辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠二抗為Sigma產(chǎn)品。RNA提取用 Trizol,RTPCR試劑盒購(gòu)自東盛科技。Fruo-2購(gòu)自invitrogen公司。其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

    1.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)原代及傳代培養(yǎng)

    取剖宮產(chǎn)健康胎兒新鮮臍帶,以胰蛋白酶消化法培養(yǎng) HUVEC。胰蛋白酶注入臍靜脈內(nèi),室溫消化10 min后,10%FBS的M199培養(yǎng)基終止反應(yīng)。1000r/min,離心8min,ECM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀,置于37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。細(xì)胞生長(zhǎng)融合后,以104~105/mL的密度傳代培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的2~5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    1.3 細(xì)胞的蛋白樣品制備和Western blot檢測(cè)

    棄去培養(yǎng)基,加入冷的0.01 mol/L PBS洗2次,加入100μL蛋白裂解液,細(xì)胞刮棒刮下貼壁細(xì)胞,將黏稠狀細(xì)胞裂解產(chǎn)物收集于eppendorf管中。冰浴中靜置30 min,12 000 r/min,4℃,離心5 min。將上清移入另一eppendorf管中,棄去沉淀。BCA方法蛋白定量。樣品置于加樣緩沖液中,沸水煮5 min,以 SDS-PAGE電泳分離蛋白,電轉(zhuǎn)至醋酸纖維素膜(PVDF膜)上,室溫下用 5%脫脂奶粉TBST溶液封閉1h。隨后加入CaR(1∶1 000)一抗,4℃孵育過夜。次日用 TBST緩沖液洗4次。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶10 000),室溫輕搖1 h,TBST洗膜4次。ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色,顯影定影處理,獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

    1.4 RT-PCR檢測(cè)

    用 Trizol從 HUVEC中提取總 RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。體系含 Rnase Free H2O 6μL,5×RTBuffer4μL,dNTPMxituro2μL,Rnase inhibitor1 μL,oligo(dT)201μL,RNA 5μL,ReverTraAce1 μL。反應(yīng)條件:42℃,20 min;99℃,5 min;4℃,5 min。

    PCR法檢測(cè)CaR mRNA的表達(dá)。上游引物:5′-GAA GTCGGGTATTACAACG-3′,下 游 引 物 :5′-GAGCAGGGAGAAGA GGAG-3′,擴(kuò)增片段為459 bp。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min;30次循環(huán)(94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,電泳條帶經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析后獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

    1.5 HUVEC[Ca2+]i的測(cè)定

    將第2代或第3代 HUVEC接種于放有圓形玻片的六孔板中。待細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí),將玻片取出放入自制的灌流槽中,用含有2μmol/L Fura-2/AM的HBS(CaCl21.5 mmol/L,NaCl 140 mmol/L,KCl 5 mmol/L,HEPES 20 mmol/L,MgCl22 mmol/L,Glucose.H2O 10 mmol/L)溶液37℃孵育細(xì)胞15 min后,沖洗,并繼續(xù)用 HBS溶液孵育15~20 min使 Fura-2/AM去酯化。然后用 HBS溶液反復(fù)沖洗。

    將灌流槽放于倒置熒光顯微鏡(Olympus XI70)上,40倍鏡下調(diào)整細(xì)胞層面,用本實(shí)驗(yàn)室自行研制的全自動(dòng)顯微灌流控制系統(tǒng)來控制所加藥物灌流液的轉(zhuǎn)換。同時(shí)用340 nm與380 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)鈣離子熒光探針Fura-2發(fā)射熒光,用CCD拍攝熒光的動(dòng)態(tài)變化并通過鈣熒光成像系統(tǒng) IPA software進(jìn)行分析。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 ˉx±S差表示,組間比較用單因素方差分析,均數(shù)間的比較采用 t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,以 P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 HUVEC中CaR的表達(dá)

    2.1.1 HUVEC中CaR蛋白表達(dá)

    見圖1,可見100~130 ku CaR蛋白表達(dá),2條帶均為目的蛋白。

    2.1.2 HUVEC中CaRmRNA表達(dá)

    見圖2,可見459 bp的CaRmRNA表達(dá)。

    圖1 Western blot檢測(cè)CaR蛋白的表達(dá)Fig.1 The protein expression of CaR analyzed by Western blo t

    2.2 精胺、Calhex231+精胺刺激下對(duì)HUVEC細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

    2.2.1 精胺刺激下HUVEC細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯增加

    Fura-2/AM負(fù)載 HUVEC后,用 Ca2+-free HBS溶液(EGTA 1 mmol/L,NaCl 140 mmol/L,KCl 5mmol/L,HEPES 20mmol/L,MgCl22 mmol/L,Glucose.H2O 10 mmol/L)檢測(cè)1 min后換Ca2+-free HBS配制的2 mmol/L的精胺持續(xù)灌流,大約8 min時(shí)[Ca2+]i濃度達(dá)最高峰,共檢測(cè)20 min[Ca2+]i(0.38±0.02)(0.62±0.01),n=3,P<0.05)。結(jié)果(圖3)顯示:精胺刺激下,HUVEC細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯增加。

    圖3 精胺刺激下HUVEC細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化Fig.3 The change of[Ca2+]istimulated by spermine in HUVEC

    圖2 RT-PCR檢測(cè)CaR mRNA的表達(dá)Fig.2 The mRNA expression of CaR analyzed by RT-PCR

    2.2.2 Calhex231抑制精胺刺激下HUVEC細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加

    Fura-2/AM負(fù)載 HUVEC,Ca2+-free HBS溶液檢測(cè)1 min后,使用全自動(dòng)顯微灌流控制系,用Ca2+-free HBS配制的 1μmol/L Calhex231將 Ca2+-free HBS溶液置換掉,繼續(xù)檢測(cè)1 min,再用 Ca2+-free HBS配制Calhex231+精胺(濃度同前)置換掉Ca2+-free HBS配制的Calhex231灌流20 min,[Ca2+]i(ratio 0.29±0.04 to 0.29±0.04,n=3,P<0.05),結(jié)果見圖4。比較圖4與圖3所得[Ca2+]i結(jié)果(△ratio=0.24±0.01與0,P=0.000),有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這顯示:Calhex231明顯抑制精胺刺激下 HUVEC細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加。

    圖4 Calhex231刺激下H UVEC細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化Fig.4 The change of[Ca2+]istimulated by Calhex231 in HUVEC

    3 討論

    CaR具有廣泛宿主表達(dá)的特點(diǎn),除了功能性表達(dá)于骨、腎、腸這3個(gè)主要的與鈣轉(zhuǎn)移和鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)有關(guān)的器官外,CaR也廣泛分布于腦、皮膚、血管及內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等各種不同組織和細(xì)胞,通過PLC、磷脂酰肌醇激酶及促絲裂原活化蛋白激酶等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起著除鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)以外重要的細(xì)胞內(nèi)作用,如保護(hù)細(xì)胞抗凋亡,促細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化,促進(jìn)激素分泌和離子通道激活等[4]。本研究證明HUVEC中有CaR的表達(dá)。

    CaR可被不同的激動(dòng)劑激活,其中 Ca2+、新霉素、釓及精胺等都可以作為配體來激活 CaR[5]。Ziegelstein RC等證實(shí)在人的主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中有功能性的CaR表達(dá),激動(dòng)劑精胺刺激下,通過三磷酸肌醇和ryanodine敏感的鈣池釋放,可引起[Ca2+]i增加[6]。本研究證實(shí)HUVEC中有CaR表達(dá),以激動(dòng)劑精胺作為配體來激活CaR,發(fā)現(xiàn)在精胺的刺激下,HUVEC細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯增加。但精胺并不是CaR特異性的激動(dòng)劑。有研究表明Calhex231是一種新型的CaR負(fù)性變購(gòu)調(diào)節(jié)劑[7],CaR激動(dòng)劑Ca2+或calindol的增加,可引血管平滑肌細(xì)胞去極化,而這種去極化的效應(yīng)可被 Calhex231抑制[8]。本研究在負(fù)性變購(gòu)調(diào)節(jié)劑 Calhex231作用 HUVEC后,再用精胺刺激。結(jié)果表明,Calhex231明顯抑制精胺刺激下 HUVEC細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加。充分證明 HUVEC中游離鈣離子濃度受CaR的調(diào)節(jié)。

    血管系統(tǒng)中的一氧化氮(nitric oxide,NO)等舒血管物質(zhì)的生成與血管內(nèi)皮細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度有關(guān)。生理?xiàng)l件下,NO主要源于內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS),而eNOS-NO信息系統(tǒng)的健全又是內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮生理作用的關(guān)鍵,內(nèi)皮細(xì)胞的正常與否直接關(guān)系到血管內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的研究,可能對(duì)深入了解血管生理和病理生理起著重要的作用。再者細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度維持與內(nèi)鈣釋放和外鈣內(nèi)流的調(diào)節(jié)有關(guān),CaR在此相互關(guān)聯(lián)的兩個(gè)過程中的作用和機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

    [1] Sanderson M J,Delmotte Y.Regulation of airway smooth muscle cell contractility by Ca2+signaling and sensitivity[J].Proc Am Thorac Soc,2008,5(1):23-31.[2]Nilius B,Owsianik G,Voets T,et al.Transient receptor potential cation channels in disease[J].Physiol Rev,2007,87(1):165-217.

    [3]Sheng J Z,Braun A P.Small-and intermediate-conductance Ca2+-activated K+channels directly control agonist-evoked nitric oxide synthesis in human vascular endothelial cells[J].Am J Physilo Cell Physiol,2007,293(1):458-467.

    [4]Smajilovic S,Tfelt-Hansen J.Calcium acts as a first messenger through the calcium-sensing receptor in the cardiovascular system[J].CardiovascularResearch,2007,75(3):457-467.

    [5]D’Souza-Li L.The calcium-sensing receptor and related diseases[J].Arq Bras Endocrinol Metabol,2006,50(4):628-639.

    [6]Ziegelstein R C,Xiong Y,He C,et al.Expression of a functional extracellular calcium-sensing receptor in human aortic endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,342(1):153-163.

    [7]Kessler A,Faure H,Petrel C,et al.N1-Benzoyl-N2-[1-(1-naphthyl)ethyl]-trans-1,2-diaminocyclohexanes:development of 4-chlorophenyl carboxamide(Calhex 231)as a new calcium sensing receptor ligand demonstrating potent calcilytic activity[J].J Med Chem,2006,49(17):5119-5128.

    [8]Weston A H,Absi M,Ward D T,et al.Evidence in favor of a calcium-sensing receptor in arterial endothelial cells:studies with calindol and Calhex 231[J].Circ Res,2005,97(4):391-398.

    Extracellular Ca-sensing Receptor Regulating Intracellular Ca2+Concentration in Human Umbilical Vein Endothelial Cells

    CHEN Xiongying1,WANG Zhenghuang1,HU Qinghua2,ZNONG Hua1,DENG Fengmei1,HE Fang1
    (1 Medical College,Shihezi University/Ministry of Education Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases,Shihezi 832002,China;2 Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology/Key Laboratory of Pulmonary Disease of Ministry of Health of China,Wuhan 430030,China)

    R363.272

    A

    1007-7383(2010)04-0453-04

    2009-10-11

    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30860099)

    陳雄英(1983-),女,碩士生,專業(yè)方向?yàn)樾难懿±砩硌芯俊?/p>

    何芳(1964-),女,教授,從事心血管病理生理研究;e-mail:FangF2002shz@126.com。

    猜你喜歡
    游離鈣內(nèi)鈣精胺
    鐵對(duì)過表達(dá)α-syn誘發(fā)iPC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子增多影響
    異丙酚靜脈麻醉對(duì)大面積燒傷患者凝血功能和血小板聚集的影響
    腦絡(luò)欣通對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度的影響
    中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:11:46
    腹腔注射亞精胺對(duì)小鼠卵巢組織多胺含量及代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響
    糖皮質(zhì)激素對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響
    咖啡易引起骨質(zhì)疏松癥嗎?
    外源精胺對(duì)斷奶仔豬血液精胺含量、臟器發(fā)育和生產(chǎn)性能的影響
    粉防己堿對(duì)β-葡聚糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)、胞內(nèi)游離鈣及cAMP表達(dá)的影響
    外源精胺在哺乳仔豬和哺乳母豬飼料中的穩(wěn)定性研究
    亞精胺對(duì)誘導(dǎo)DNA凝聚行為的影響研究
    亚洲经典国产精华液单| 国产精品爽爽va在线观看网站| 哪里可以看免费的av片| a级毛片a级免费在线| 午夜精品在线福利| 51国产日韩欧美| 美女高潮的动态| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美高清成人免费视频www| 久久久久久久久中文| 两个人的视频大全免费| АⅤ资源中文在线天堂| 在线免费十八禁| 真实男女啪啪啪动态图| 久久精品91蜜桃| 黄色女人牲交| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产精品久久视频播放| 高清在线国产一区| 色综合婷婷激情| 在线观看av片永久免费下载| 嫩草影院精品99| 能在线免费观看的黄片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产午夜福利久久久久久| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 一个人看视频在线观看www免费| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产伦精品一区二区三区视频9| 最近中文字幕高清免费大全6 | 日韩国内少妇激情av| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国内精品久久久久久久电影| 成人永久免费在线观看视频| 国产一区二区在线观看日韩| 最近最新免费中文字幕在线| 一本精品99久久精品77| 国产午夜福利久久久久久| 高清日韩中文字幕在线| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美一级a爱片免费观看看| 熟女电影av网| 九色成人免费人妻av| 一本一本综合久久| 国产伦人伦偷精品视频| 色视频www国产| 91狼人影院| 亚洲av中文av极速乱 | 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲精品在线观看二区| 一个人免费在线观看电影| 色视频www国产| 韩国av一区二区三区四区| 男人舔奶头视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 又爽又黄无遮挡网站| av在线亚洲专区| 婷婷精品国产亚洲av在线| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 99在线视频只有这里精品首页| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲成人久久性| 国产一区二区在线av高清观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 97碰自拍视频| 最近中文字幕高清免费大全6 | 精品人妻1区二区| 91久久精品国产一区二区三区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产精品野战在线观看| 午夜免费成人在线视频| 岛国在线免费视频观看| 久久精品国产亚洲av天美| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久久久久久久大av| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产av一区在线观看免费| 波野结衣二区三区在线| 在线免费观看的www视频| 最后的刺客免费高清国语| 级片在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 真人一进一出gif抽搐免费| 免费观看精品视频网站| 中文字幕av成人在线电影| 丰满乱子伦码专区| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 日本色播在线视频| 午夜老司机福利剧场| 中文在线观看免费www的网站| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 97碰自拍视频| 91久久精品国产一区二区成人| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 99在线人妻在线中文字幕| 午夜精品久久久久久毛片777| av专区在线播放| 亚洲精品亚洲一区二区| av视频在线观看入口| 国产久久久一区二区三区| 日本成人三级电影网站| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 国产老妇女一区| 88av欧美| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 欧美激情国产日韩精品一区| 香蕉av资源在线| 国产精华一区二区三区| netflix在线观看网站| 午夜福利在线在线| 一个人观看的视频www高清免费观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 欧美日韩综合久久久久久 | 别揉我奶头 嗯啊视频| 国产老妇女一区| 国产av不卡久久| 在线免费观看不下载黄p国产 | a在线观看视频网站| 国产成人a区在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久久精品欧美日韩精品| 如何舔出高潮| 国产午夜福利久久久久久| 色综合站精品国产| 中文字幕免费在线视频6| 国产精品亚洲一级av第二区| 天堂动漫精品| 91精品国产九色| 亚洲经典国产精华液单| 欧美精品国产亚洲| 中出人妻视频一区二区| 在线a可以看的网站| 欧美精品国产亚洲| 亚洲av不卡在线观看| 小说图片视频综合网站| or卡值多少钱| 久久久久精品国产欧美久久久| 1000部很黄的大片| 91久久精品国产一区二区成人| 男女那种视频在线观看| 午夜影院日韩av| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 中文字幕免费在线视频6| 成人特级黄色片久久久久久久| 有码 亚洲区| 国产亚洲欧美98| 波野结衣二区三区在线| 哪里可以看免费的av片| 国产精品久久电影中文字幕| 国产爱豆传媒在线观看| 免费搜索国产男女视频| 午夜日韩欧美国产| 一进一出好大好爽视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国语自产精品视频在线第100页| 国产成年人精品一区二区| 日韩 亚洲 欧美在线| 成人永久免费在线观看视频| 免费av毛片视频| 麻豆成人午夜福利视频| 色综合色国产| 九色成人免费人妻av| 国产精品伦人一区二区| 麻豆久久精品国产亚洲av| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲图色成人| 免费看a级黄色片| 欧美成人a在线观看| 免费人成在线观看视频色| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲国产精品成人综合色| 精品一区二区三区av网在线观看| av在线观看视频网站免费| 久久午夜福利片| 精品久久久噜噜| 最好的美女福利视频网| 色播亚洲综合网| 日本一本二区三区精品| 国产不卡一卡二| 亚洲四区av| 中文资源天堂在线| 国产成年人精品一区二区| 桃色一区二区三区在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 超碰av人人做人人爽久久| 黄色丝袜av网址大全| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产黄色小视频在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 美女免费视频网站| 给我免费播放毛片高清在线观看| 91狼人影院| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 小说图片视频综合网站| 超碰av人人做人人爽久久| av在线老鸭窝| 五月伊人婷婷丁香| 国产成人av教育| 看十八女毛片水多多多| 国国产精品蜜臀av免费| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 一级a爱片免费观看的视频| 成年人黄色毛片网站| 国产成人一区二区在线| 男女边吃奶边做爰视频| 成人亚洲精品av一区二区| 身体一侧抽搐| 丝袜美腿在线中文| 午夜日韩欧美国产| 免费电影在线观看免费观看| 婷婷丁香在线五月| 久久欧美精品欧美久久欧美| 成年人黄色毛片网站| 日本熟妇午夜| 乱人视频在线观看| 国内精品久久久久精免费| eeuss影院久久| 午夜精品久久久久久毛片777| 黄色一级大片看看| 国产精品精品国产色婷婷| 99久久成人亚洲精品观看| 午夜免费成人在线视频| 久99久视频精品免费| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99热精品在线国产| 美女黄网站色视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 深夜a级毛片| av女优亚洲男人天堂| 亚洲经典国产精华液单| 69人妻影院| 啦啦啦韩国在线观看视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 婷婷精品国产亚洲av| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产精品永久免费网站| eeuss影院久久| 热99re8久久精品国产| 国产熟女欧美一区二区| 两个人视频免费观看高清| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 香蕉av资源在线| 成人二区视频| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久久色成人| 亚洲国产高清在线一区二区三| 最近中文字幕高清免费大全6 | 五月玫瑰六月丁香| 尤物成人国产欧美一区二区三区| eeuss影院久久| 很黄的视频免费| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久6这里有精品| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 天堂√8在线中文| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 尤物成人国产欧美一区二区三区| 一区福利在线观看| 免费看日本二区| 久久精品人妻少妇| 久久久国产成人免费| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲精品国产成人久久av| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲综合色惰| 精品日产1卡2卡| 嫩草影视91久久| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 日本 欧美在线| 亚洲性久久影院| 国产av不卡久久| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲精品成人久久久久久| bbb黄色大片| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 69av精品久久久久久| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产精品三级大全| 中文字幕久久专区| 欧美精品国产亚洲| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 91精品国产九色| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久久国产成人免费| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲精品久久国产高清桃花| 成人国产综合亚洲| 91久久精品国产一区二区成人| 国产午夜精品论理片| 久久久久久久午夜电影| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲av成人av| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 国内精品久久久久精免费| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日本与韩国留学比较| 国产精品一区www在线观看 | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产麻豆成人av免费视频| 国产熟女欧美一区二区| 夜夜爽天天搞| 亚洲专区国产一区二区| 岛国在线免费视频观看| 黄色一级大片看看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 韩国av一区二区三区四区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国内精品久久久久精免费| 久久中文看片网| 亚洲不卡免费看| www日本黄色视频网| 久久99热6这里只有精品| 日韩欧美国产一区二区入口| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 中文字幕av成人在线电影| 国产淫片久久久久久久久| 成人特级黄色片久久久久久久| 成人无遮挡网站| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲精华国产精华精| 看十八女毛片水多多多| 男女视频在线观看网站免费| 国产黄片美女视频| 亚洲精华国产精华精| 亚洲色图av天堂| 亚洲七黄色美女视频| 成人永久免费在线观看视频| 日本a在线网址| 国产精品亚洲美女久久久| 综合色av麻豆| av在线亚洲专区| 乱人视频在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 女同久久另类99精品国产91| 国产成人影院久久av| 欧美日韩综合久久久久久 | 天天一区二区日本电影三级| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 岛国在线免费视频观看| 亚洲av二区三区四区| 天美传媒精品一区二区| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久久精品欧美日韩精品| netflix在线观看网站| 久久久精品欧美日韩精品| 在线播放无遮挡| 亚洲最大成人av| 看黄色毛片网站| 露出奶头的视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 成人三级黄色视频| 如何舔出高潮| 国产伦精品一区二区三区视频9| 日韩欧美在线二视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久久成人免费电影| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品久久久久久精品电影| 内地一区二区视频在线| 一区福利在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| av专区在线播放| 九九热线精品视视频播放| 亚洲午夜理论影院| 制服丝袜大香蕉在线| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲精华国产精华精| 国产视频一区二区在线看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲四区av| 悠悠久久av| 午夜爱爱视频在线播放| 日本五十路高清| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 深夜a级毛片| 人妻久久中文字幕网| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久久久久久久久久丰满 | 亚洲男人的天堂狠狠| 成人国产麻豆网| 日本三级黄在线观看| 久久99热这里只有精品18| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲18禁久久av| av专区在线播放| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久久久久久精品吃奶| 在线天堂最新版资源| 麻豆国产av国片精品| 嫩草影视91久久| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲美女视频黄频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 长腿黑丝高跟| 中国美白少妇内射xxxbb| 嫩草影院新地址| 网址你懂的国产日韩在线| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 麻豆成人午夜福利视频| 国产三级在线视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产精品,欧美在线| 午夜精品一区二区三区免费看| 色综合站精品国产| 亚洲欧美日韩东京热| 毛片一级片免费看久久久久 | 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品久久久久久久电影| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产一区二区三区av在线 | 成人二区视频| 精品一区二区免费观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 成人av在线播放网站| 日韩一本色道免费dvd| 国产日本99.免费观看| 婷婷色综合大香蕉| 十八禁国产超污无遮挡网站| 91久久精品国产一区二区三区| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 校园人妻丝袜中文字幕| 一个人看的www免费观看视频| 国产亚洲精品久久久com| 国产乱人视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 看黄色毛片网站| 最近中文字幕高清免费大全6 | 成人午夜高清在线视频| 日本黄色视频三级网站网址| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产在视频线在精品| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产精品亚洲美女久久久| 99久久无色码亚洲精品果冻| 人妻夜夜爽99麻豆av| 欧美色欧美亚洲另类二区| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产大屁股一区二区在线视频| 少妇的逼好多水| 欧美人与善性xxx| 99久久无色码亚洲精品果冻| 悠悠久久av| 免费看av在线观看网站| www.色视频.com| 亚洲三级黄色毛片| 观看美女的网站| 亚洲专区国产一区二区| 乱系列少妇在线播放| 午夜影院日韩av| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产成人一区二区在线| www.www免费av| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产午夜精品论理片| videossex国产| 日韩人妻高清精品专区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲精品色激情综合| 久久久久久久久中文| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 精品人妻熟女av久视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产高清三级在线| 偷拍熟女少妇极品色| 日本成人三级电影网站| x7x7x7水蜜桃| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 一个人看视频在线观看www免费| 国模一区二区三区四区视频| 男人舔奶头视频| 国产久久久一区二区三区| 精品久久久久久久久av| 成人国产综合亚洲| 成人av在线播放网站| 五月伊人婷婷丁香| 国产探花在线观看一区二区| 欧美成人性av电影在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲综合色惰| 国产亚洲精品av在线| videossex国产| 欧美+亚洲+日韩+国产| 色av中文字幕| 亚洲精品粉嫩美女一区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 亚洲人成伊人成综合网2020| 久久99热这里只有精品18| 波多野结衣巨乳人妻| 国产精品久久久久久av不卡| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 精品久久国产蜜桃| 免费无遮挡裸体视频| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲精品成人久久久久久| 国产色婷婷99| 日本爱情动作片www.在线观看 | 国产成年人精品一区二区| 欧美日韩国产亚洲二区| 高清毛片免费观看视频网站| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 日韩 亚洲 欧美在线| 一区福利在线观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 久久午夜福利片| 亚洲精品在线观看二区| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲av一区综合| 亚洲国产高清在线一区二区三| 成年免费大片在线观看| 美女黄网站色视频| 内射极品少妇av片p| 日韩亚洲欧美综合| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 色综合色国产| 亚洲欧美清纯卡通| 国内精品美女久久久久久| 人妻少妇偷人精品九色| 此物有八面人人有两片| 久久99热6这里只有精品| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲久久久久久中文字幕| 丰满人妻一区二区三区视频av| 日韩欧美国产在线观看| 天堂动漫精品| 中文字幕高清在线视频| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲欧美日韩东京热| 欧美黑人巨大hd| 成人特级黄色片久久久久久久| 日韩亚洲欧美综合| 97碰自拍视频| 成人二区视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 赤兔流量卡办理| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 毛片一级片免费看久久久久 | 国产一区二区亚洲精品在线观看| 在线国产一区二区在线| 乱人视频在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 美女 人体艺术 gogo| 美女黄网站色视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 成人国产麻豆网| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲最大成人手机在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 亚洲精华国产精华精| 欧美日本亚洲视频在线播放| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 精品久久久久久久久久免费视频| 日本-黄色视频高清免费观看| 最近视频中文字幕2019在线8| av专区在线播放| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 麻豆一二三区av精品| 免费观看人在逋| 欧美不卡视频在线免费观看| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 88av欧美| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲精华国产精华精| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品久久视频播放| 亚洲 国产 在线| 成年女人毛片免费观看观看9| 99久久精品热视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 日本爱情动作片www.在线观看 | 久久久午夜欧美精品| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲精品影视一区二区三区av| 成人av一区二区三区在线看|