高效液相色譜手性固定相法拆分阿折地平對(duì)映體

張 愷, 薛 娜, 李 林, 李 凡, 杜玉民＊

(1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,河北石家莊050017;2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河北石家莊050026)

高效液相色譜手性固定相法拆分阿折地平對(duì)映體

張 愷1, 薛 娜2, 李 林1, 李 凡1, 杜玉民1＊

(1.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,河北石家莊050017;2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河北石家莊050026)

建立了阿折地平對(duì)映體的高效液相色譜拆分方法。采用Chiralpak AD-H(250mm×4.6mm,5.0μm,D aicel公司)手性色譜柱在正相條件下直接拆分阿折地平對(duì)映體,考察了固定相種類(lèi)、流動(dòng)相組成及柱溫等對(duì)阿折地平對(duì)映體分離的影響。確定了最佳的拆分條件:流動(dòng)相為正己烷-異丙醇(90∶10,v/v),流速為0.8mL/m in,檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm;柱溫為20℃;在此條件下阿折地平對(duì)映體的分離度為3.3。該法簡(jiǎn)單快速,重現(xiàn)性好。

高效液相色譜法;手性固定相;手性拆分;阿折地平

Abstract:A high performance liquid Chromatographic(HPLC)method was established for the enantiomeric separation of azelnidipine.Baseline chiral separation of azelnidipine was achieved under normal-phase Chromatographic mode using the Chiralpak AD-H chiral column(250mm×4.6mm,5.0μm,Daicel).The influences of the nature of chiral stationary phase,form of the mobile phase,and column temperature on the enantiomeric separation were studied.The optimized Chromatographic conditions were hexane-isopropyl alcohol(90∶10,v/v)as the mobile phase with a flow rate of0.8mL/m in and detection at the wavelength of254nm.The column temperature was set at20℃.The resolution of3.3for azelnidipine was achieved under the above Chromatographic conditions.The method is simple,rap id and with good rep roducibility.

Key words:high performance liquid Chromatography(HPLC);chiral stationary phase;chiral sp lit;azelnidipine

阿折地平(azelnidipine)是由日本三共制藥研發(fā),2003年上市的一種新型的長(zhǎng)效鈣拮抗劑,結(jié)構(gòu)屬于1,4-二氫吡啶類(lèi)化合物[1],可以選擇性阻滯L型鈣通道,適用于緩解心衰和高血壓等癥狀。由于其藥效作用迅速,副作用小,所以是一種非常具有開(kāi)發(fā)前途的抗高血壓藥物[2]。

目前應(yīng)用于臨床的阿折地平為外消旋體[3],其分子結(jié)構(gòu)中1,4-二氫吡啶環(huán)的4位碳原子為一個(gè)手性中心(見(jiàn)圖1),具有R、S型兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體。據(jù)報(bào)道,阿折地平對(duì)映體中,R體具有活性,S體無(wú)活性[4],并且此類(lèi)藥物中已有左旋氨氯地平作為氨氯地平的替代產(chǎn)品成功上市[5],因此,研究阿折地平的手性拆分方法對(duì)其安全用藥和新藥研發(fā)具有重要意義。Kiyoshi等[6]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法測(cè)定了人血漿中的阿折地平對(duì)映體,該方法靈敏度高,適用于血漿樣品的分析。為了直接拆分阿折地平對(duì)映體,我們采用Chiralpak AD-H手性色譜柱,以正己烷-異丙醇(90∶10,v/v)為流動(dòng)相,結(jié)果顯示該方法對(duì)阿折地平對(duì)映體的分離度良好,簡(jiǎn)便、快速、實(shí)用性強(qiáng)。

圖1 阿折地平的結(jié)構(gòu)Fig.1 S tructu re of aze ln id ip ine

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

W aters高效液相色譜儀515泵和2487紫外檢測(cè)器(W aters公司,美國(guó)),浙江大學(xué)N2000色譜工作站。阿折地平對(duì)照品(消旋體,純度99.46%),河北醫(yī)科大學(xué)藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供;正己烷、異丙醇均為色譜純,購(gòu)于迪馬公司。

1.2 阿折地平供試品溶液的配制

取阿折地平對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,用流動(dòng)相正己烷-異丙醇(90∶10,v/v)溶解并稀釋配制成0.1 m g/mL的溶液,過(guò)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾。

1.3 色譜條件

Chiralpak AD-H手性固定相色譜柱(250mm×4.6mm,5.0μm,D aicel公司);流動(dòng)相:正己烷-異丙醇(90∶10,v/v);流速:0.8mL/m in;檢測(cè)波長(zhǎng):254nm;柱溫:20℃;進(jìn)樣量:20μL。

1.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

取供試品溶液,以直鏈淀粉氨基甲酸酯為填充劑,以正己烷-異丙醇(90∶10,v/v)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm,記錄色譜圖,計(jì)算2個(gè)對(duì)映體的分離度。

2 結(jié)果與討論

2.1 手性固定相的選擇

我們分別用Chiralcel OD-R和Chiralpak ADH手性色譜柱進(jìn)行了試驗(yàn),采用Chiralcel OD-R手性色譜柱,以乙腈-水為流動(dòng)相,無(wú)法使兩個(gè)對(duì)映體達(dá)到基線分離。采用Chiralpak AD-H手性色譜柱,通過(guò)選擇與優(yōu)化,最終確定流動(dòng)相為正己烷-異丙醇(90∶10,v/v),阿折地平異構(gòu)體達(dá)到了良好分離。Chiralpak AD-H為直鏈淀粉氨基甲酸酯類(lèi)手性固定相,直鏈淀粉是D-葡萄糖以α-1,4-糖苷鍵相連而形成的線形聚合物[7]。該類(lèi)手性柱應(yīng)用廣泛,尤其適用于含酰胺基、芳香基、羰基、羥基和羧酸基等基團(tuán)的手性化合物的拆分。

2.2 流動(dòng)相組成對(duì)阿折地平對(duì)映體分離的影響

通常,在以二元混合溶劑體系為流動(dòng)相的正相色譜分離模式中,隨著流動(dòng)相中極性組分的不斷減少,對(duì)映體分離因子值逐漸增大,分離因子值與流動(dòng)相組成關(guān)系曲線一般呈線性[8]。本實(shí)驗(yàn)以正己烷-異丙醇為流動(dòng)相,考察了正己烷-異丙醇的比例對(duì)對(duì)映體分離的影響,結(jié)果見(jiàn)表1。可以看出,流動(dòng)相中異丙醇的含量對(duì)阿折地平的保留時(shí)間影響較大;隨著異丙醇比例的增大,不但使流動(dòng)相極性增強(qiáng),而且它與固定相之間的氫鍵作用抑制了對(duì)映體與固定相之間的相互作用,從而使對(duì)映體的保留時(shí)間明顯縮短,分離度也隨之下降。另外,隨著異丙醇含量的增加,它與對(duì)映體分子競(jìng)爭(zhēng)作用于固定相手性位點(diǎn)的強(qiáng)度也相應(yīng)增強(qiáng),從而可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)映體分離因子的降低。但本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著異丙醇比例的減小,分離因子并非一直增大,而是出現(xiàn)了拐點(diǎn),這說(shuō)明在該正相色譜分離體系中,流動(dòng)相中的極性組分異丙醇以一種較為特殊的方式競(jìng)爭(zhēng)與手性固定相分子或溶質(zhì)對(duì)映體分子之間形成氫鍵。因此,我們綜合考慮分離時(shí)間和分離效果,選擇正己烷與異丙醇的最佳體積比為90∶10,在該流動(dòng)相配比條件下對(duì)映體分離效果良好。

表1 異丙醇含量對(duì)分離的影響Table1 Effects of isopropy lalcohol con ten t on the enantiomeric separation

2.3 柱溫對(duì)分離的影響

溫度對(duì)高效液相色譜分離不同手性化合物的影響不盡相同。一般而言,對(duì)映體分離的Van’t Hoff曲線呈線性。低溫條件下,對(duì)映體與手性固定相形成的絡(luò)合物比高溫度時(shí)穩(wěn)定,有利于提高分離因子。柱溫升高,使得溶質(zhì)與固定相之間的結(jié)合能力減弱,保留時(shí)間變短,分離度變差。本實(shí)驗(yàn)在上述色譜條件下,考察了柱溫在20～35℃范圍內(nèi)變化對(duì)手性分離的影響,結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可以看出,隨著分離溫度的升高,保留因子減少,樣品保留時(shí)間減少,分離因子和分離度大體上也是相應(yīng)減少的,Van’t Hoff曲線基本呈線性,這說(shuō)明阿折地平對(duì)映體在該手性固定相上的保留行為隨色譜分離溫度的變化而改變,手性分離過(guò)程受吸附反應(yīng)熱影響。因此20℃為最佳柱溫。

表2 柱溫對(duì)分離的影響Table2 Effects of columntem perature on the enantiomeric separation

2.4 重現(xiàn)性

在優(yōu)化的色譜條件下,連續(xù)進(jìn)樣6次,阿折地平對(duì)映體出峰時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.23%和0.46%,峰面積的RSD分別為1.4%和1.9%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該方法簡(jiǎn)單、快速、重現(xiàn)性好,可用于阿折地平對(duì)映體的手性分離。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

典型的系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)色譜圖見(jiàn)圖2,阿折地平對(duì)映體的分離度為3.3。

圖2 阿折地平對(duì)映體的分離色譜圖Fig.2 Chromatogram of azelnidipineenan tiomers

3 結(jié)語(yǔ)

本文采用Chiralpak AD-H手性色譜柱,在正相色譜分離條件下成功地拆分了阿折地平對(duì)映體,分離度達(dá)3.3。方法方便快速,為阿折地平對(duì)映體的進(jìn)一步研究提供了有效的分離手段。由于應(yīng)用化學(xué)方法還未拆分出阿折地平單一對(duì)映體,因此今后還需要更深入的研究,進(jìn)一步考察對(duì)實(shí)際樣品分析檢測(cè)的可行性,證明本方法的實(shí)用性。

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Enantiomeric separation of azelnidipine by high performance liquid chromatography with chiral stationary phase

ZHANG Kai1,XU E N a2,L I L in1,L I Fan1,DU Yum in1＊
(1.School of Pharmacy,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China;2.Heibei Chemical and Pharmaceutical College,Shijiazhuang 050026,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0215-03

＊通訊聯(lián)系人:杜玉民,教授,從事藥物合成研究.Tel:(0311)86265624,E-m ail:yum indu@yahoo.com.cn.

2009-07-08

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00215