正交試驗法優(yōu)化制備用于小分子物質(zhì)分離的聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯-二乙烯基苯)型整體柱

馬 偉, 徐環(huán)昕,2, 劉坐鎮(zhèn),2＊, 寧方紅,2

(1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器國家重點實驗室,上海200237;2.上海華震科技有限公司,上海200237)

正交試驗法優(yōu)化制備用于小分子物質(zhì)分離的聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯-二乙烯基苯)型整體柱

馬 偉1, 徐環(huán)昕1,2, 劉坐鎮(zhèn)1,2＊, 寧方紅1,2

(1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器國家重點實驗室,上海200237;2.上海華震科技有限公司,上海200237)

以甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)為單體,二乙烯基苯(DVB)為交聯(lián)劑,以環(huán)己醇和正十二醇為致孔劑,過氧化苯甲酰(BPO)為引發(fā)劑,直接以50mm×4.6mm色譜柱為模具,通過原位聚合制備聚(GMA-DVB)型整體柱。以GMA和DVB的體積比、環(huán)己醇和十二醇的體積比以及BPO占聚合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為三因素,以分離苯和乙苯等小分子物質(zhì)時的半峰寬分離度(R1/2)為考察指標(biāo),進(jìn)行三因素三水平的正交試驗,通過測定整體柱的比表面積、孔徑和孔容分布對其進(jìn)行表征。結(jié)果表明,制備整體柱的最優(yōu)配方為V(GMA):V(DVB)∶V(環(huán)己醇)∶V(正十二醇)=0.825∶0.825∶1.32∶2.03,BPO的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%。應(yīng)用所制備的整體柱分離苯和乙苯等小分子物質(zhì),理論塔板數(shù)達(dá)到37 000塔板/m,R1/2值達(dá)到7.14,完全達(dá)到基線分離,分離時間小于10m in。該方法制備整體柱的重復(fù)性好,柱效較高,基本滿足商品化要求。

聚(甲基丙烯酸縮水甘油酯-二乙烯基苯);整體柱;制備;高效液相色譜;小分子物質(zhì)

Abstract:Amonolithic column of macro porouspoly(glycidyl methacrylate-divinyl benzene)(poly(GMA-DVB))has been p repared by free radical polym erization within the confines of a Chromatographic stainless steel tube(50mm×4.6mm).For the best separation and low back pressure,orthogonal experiments were carried out with V(cyclohexanol)∶V(dodecanol),V(GMA)∶V(DVB)and BPO dosage as the three main factors.The characteristic feature of the column,including specific surface area,pore volume as well as pore diameter distribution,was studied by scanning electron microscopy(SEM),mercury intrusion porosimetry analysis and B ET analysis.The obtained optimump reparation conditions were that the volume ratio of GMA,DVB,cyclohexanol and dodecanol was0.825∶0.825∶1.32∶2.03and the B PO dosage was 0.7%(mass percentage),then it was heated at70℃for24h.U sing this m onolithic colum n,benzene and ethylbenzene and a drug of oxiracetam can be w ell separated on a high performance liquid Chromatographic(HPLC)system equipped with a ultraviolet(UV)detector at254 nm.A solution of acetonitrile-water(50∶50,v/v)for the separation of benzene and ethylbenzene,and acetonitrile-water(80∶20,v/v)for the separation of oxiracetam were used as mobile phases at a flow rate of1mL/m in.The theoretical p late number was37 000p lates/m and the resolution of peak width at half height(R1/2)was7.14.The separation time was less than10m in.The monolithic column prepared by this method is reproducible and has high column efficiency.It is an economical method to prepare monolithic column,which can be ap-plied to separate small molecules.

Key words:poly(glycidyl methacrylate-divinylbenzene);monolithic column;p reparation;high perform ance liquid Chromatography(HPLC);small molecular

整體柱(monolithic column),又稱棒柱(rod)、連續(xù)床(continuous bed)、無塞柱(fritless colum n),被人們稱為繼多聚糖、交聯(lián)與涂漬、單分散之后的第四代分離介質(zhì)[1]。整體柱是利用有機(jī)或無機(jī)聚合方法在色譜柱內(nèi)進(jìn)行原位聚合的連續(xù)床固定相。它具有制備方法簡單、內(nèi)部結(jié)構(gòu)均勻、重現(xiàn)性好、有較高的柱效和可進(jìn)行快速分離等優(yōu)點,是近年來發(fā)展較快的一種色譜柱。整體柱主要分為有機(jī)聚合物整體柱和無機(jī)硅膠整體柱。有機(jī)聚合物整體柱由單體、引發(fā)劑、致孔劑等混合物通過原位聚合制備而成。由于整體柱在制備時選材范圍廣,因而其具有不同的選擇性,適用的pH范圍寬。目前已在反相高效液相色譜(HPLC)[2-5]、疏水作用色譜[6,7]、離子交換色譜[8,9]、親和色譜[10]等中獲得了廣泛的應(yīng)用。

聚甲基丙烯酸縮水甘油酯類整體柱表面具有環(huán)氧結(jié)構(gòu),可以進(jìn)一步修飾使其具有不同的選擇性,而且可以在pH2～12范圍內(nèi)使用,擴(kuò)大了應(yīng)用范圍。例如,以甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)為單體的聚合物易于引入離子基團(tuán)而制備離子交換色譜柱[8,11,12],或者用β-環(huán)糊精對GMA進(jìn)行修飾,從而制備手性色譜柱[13,14]。我們前期制備有機(jī)聚合物整體柱分離小分子的研究表明使用二乙烯基苯(DVB)作為交聯(lián)劑,制得的整體柱的剛性較好[15]。

基于以上分析,我們設(shè)計了以GMA為單體,DVB為交聯(lián)劑,過氧化苯甲酰(BPO)為引發(fā)劑,以GMA和DVB的體積比、環(huán)己醇和十二醇的體積比以及B PO占聚合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為三因素的正交試驗優(yōu)化制備聚(GMA-DVB)整體柱的條件,并應(yīng)用所制得的整體柱對一些小分子物質(zhì)進(jìn)行了分離和分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);Agilent1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司);KQ-100D E型數(shù)控超聲波發(fā)生器(昆山超聲儀器有限公司);XL30FEG型場發(fā)射掃描電鏡(荷蘭Royal Philips電子公司);ASAP2010型全自動物理與化學(xué)吸附儀、Autopore9500全自動壓汞儀(美國麥克儀器公司)。

GMA(純度為99.9%,日本三菱化學(xué)株式會社);DVB(含量為80%,淄博東大化工股份有限公司,使用前經(jīng)減壓蒸餾,無水硫酸鎂脫水后低溫保存);過氧化苯甲酰(B PO,泰興市梅蘭化工有限公司);環(huán)己醇(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);十二醇(分析純,上海永華化學(xué)試劑有限公司);苯和乙苯(分析純,上海菲達(dá)工貿(mào)有限公司);乙腈(色譜純,美國Honeyw ell公司);奧拉西坦(實驗室自制,晶體);其他試劑均為分析純或色譜純。

1.2 實驗方法

1.2.1 聚(GMA-DVB)型整體柱的制備

以GMA為單體,DVB為交聯(lián)劑,環(huán)己醇和十二醇為致孔劑,B PO為引發(fā)劑,按V(GMA)∶V(DVB)∶V(環(huán)己醇)∶V(正十二醇)=0.825∶0.825∶1.32∶2.03的比例進(jìn)行配料,按7.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的比例加入BPO。將BPO溶解到由GMA、DVB、環(huán)己醇和十二醇組成的混合溶液中,超聲15 m in。將規(guī)格為50mm×4.6mm的不銹鋼色譜柱管的一端密封,另一端用連接頭連接一根空的色譜柱管,加入上述混合溶液,超聲15m in,以除掉溶液中以及溶液柱管壁之間的氣體。然后將另一端與一個加壓裝置相連,垂直放入70℃恒溫油浴中反應(yīng)24h。整體柱制備裝置如圖1所示。

圖1 整體柱制備裝置圖Fig.1 Se tup for p repa ra tion of m onolithic colum n

在整個反應(yīng)過程中,通過氬氣對反應(yīng)系統(tǒng)施加0.18M Pa的恒定壓力。反應(yīng)結(jié)束后,除去色譜柱一端封頭和另一端連接頭,用刀片切平,更換柱接頭后將其連接到HPLC系統(tǒng),用甲醇以0.8mL/m in的流速沖洗30m in,除去環(huán)己醇、十二醇以及其他反應(yīng)后殘留的可溶物質(zhì),得到聚(GMA-DVB)整體柱。

1.2.2 聚(GMA-DVB)型整體柱結(jié)構(gòu)的表征

利用HPLC系統(tǒng)將柱管中的整體柱打出,于真空下干燥。用壓汞法及B ET法分別測定整體柱的大孔和微孔孔徑分布、孔容及比表面積,掃描電子顯微鏡表征整體柱的微觀特征。

1.2.3 整體柱分離小分子的色譜條件

分離苯和乙苯:流動相為乙腈-水(50∶50,v/v),進(jìn)樣量10μL,檢測波長254nm,操作溫度30℃。

分離奧拉西坦:流動相為乙腈-水(80∶20,v/v),進(jìn)樣量10μL,檢測波長254nm,操作溫度25℃。

1.2.4 理論塔板的計算

其中,N為理論塔板數(shù),H為理論塔板高度,tR(m in)為保留時間,W1/2(m in)為半峰寬,L為柱長。

1.2.5 色譜柱半峰寬分離度(R1/2)的測定

分離度(R)是把柱效率和溶劑效率結(jié)合在一起的參數(shù),是標(biāo)識色譜柱在一定的色譜條件下對混合物綜合分離能力的指標(biāo)。R1/2和R相似,只是用W1/2代替峰寬(W),用公式(3)表示。在多數(shù)色譜圖中,半峰寬比峰寬更容易得到準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗

在單因素實驗的操作和分析基礎(chǔ)上,本文采取各因素相互獨立的正交試驗L9(34)進(jìn)一步優(yōu)化各參數(shù),最終得到更好的整體柱制備條件。該正交試驗以整體柱分離苯和乙苯的R1/2為響應(yīng)指標(biāo),考察了單體GMA和交聯(lián)劑DVB的體積比(因素A)、致孔劑中環(huán)己醇和十二醇的體積比(因素B)以及引發(fā)劑的用量(質(zhì)量分?jǐn)?shù),因素C)3個因素,每個因素設(shè)置3個水平,B lank列是實驗誤差列(見表1)。

表1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果的直觀分析Table1 Design and Visual Analysis of the orthogonal experiments

2.1.1 直觀分析

正交試驗直觀分析結(jié)果見表1。從表1的直觀分析結(jié)果可以看出,3個因素對整體柱分離苯和乙苯的R1/2的影響主次順序為B>A>C,即致孔劑中環(huán)己醇和十二醇的體積比是影響整體柱分離苯和乙苯效果的主要因素,其次為單體GMA和交聯(lián)劑DVB的體積比,而引發(fā)劑的量的極差比空白列的極差小,可以看成是誤差引起的,所以在方差分析中把C看成是誤差項。

2.1.2 方差分析

正交試驗方差分析結(jié)果見表2,從F分布表中查出臨界值F0.05(2,4)=6.94,F0.01(2,4)=18.00,F0.05(2,4)

表2 正交試驗方差分析Table2 Variance analysis of the orthogonal experiments

2.1.3 驗證試驗

將正交試驗得到的制備整體柱的最優(yōu)配方(V(GMA)∶V(DVB)∶V(環(huán)己醇)∶V(正十二醇)=0.825∶0.825∶1.32∶2.03,BPO占聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%)與表1中的試驗3(V(GMA)∶V(DVB)∶V(環(huán)己醇)∶V(正十二醇)=0.825∶0.825∶1.34∶2.01,BPO占聚合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%)進(jìn)行比較,結(jié)果見表3,從表3中可以看出,由正交試驗計算出的最優(yōu)條件制備的整體柱,R1/2達(dá)到7.14,比表1中的試驗3的分離度高,且相同條件不同批次制備的整體柱的R1/2相差不大,說明制備的重復(fù)性很好。

表3 驗證試驗結(jié)果Table3 The resu lts of ve rifica tion exp e riment

2.2 聚(GMA-DVB)型整體柱的表征

聚(GMA-DVB)型整體柱是一種具有一定剛性、充滿管空間結(jié)構(gòu)的多孔整體。圖2是整體柱的電鏡掃描圖,從中可以看到整體柱的孔徑分布均勻,其中既有連續(xù)分布的小孔,也有1μm到2μm左右的貫穿孔,使整體柱的滲透性良好,也使HPLC系統(tǒng)在流動相的流速較高時仍能保持低的柱壓。圖3是采用壓汞法測得的整體柱的孔徑分布圖,整體柱的比表面積為230m2/g,孔容為1.92mL/g。由圖3可以看出,直徑為100～1 000nm的中孔和大孔占總孔容的80%以上。圖4是采用BET法測得的整體柱孔徑分布圖,從中可以看出所制備的整體柱還有一定數(shù)量的幾納米到幾十納米的小孔,這使得整體柱有較大的比表面積,從而有利于對小分子物質(zhì)進(jìn)行保留和分離。

圖2 聚(GMA-DVB)內(nèi)部結(jié)構(gòu)掃描電鏡圖Fig.2 Scanning electron micrograph of the inner part of apoly(GMA-DVB)monolithic column

圖3 壓汞法測得的聚(GMA-DVB)型整體柱的孔徑分布圖Fig.3 Poresize distribution curve of a poly(GMA-DVB)monolithic column by mercury intrusion method

圖4 B ET法測得的聚(GMA-DVB)型整體柱的孔徑分布圖Fig.4 Pore size distribution curve of a poly(GMADVB)monolithic column by B ET method

2.3 聚(GMA-DVB)型整體柱的應(yīng)用

聚合物整體柱在分離大分子蛋白質(zhì)、多肽等方面已經(jīng)取得了突破性的進(jìn)展,但是在分離小分子物質(zhì)方面國內(nèi)外卻鮮有報道。

苯和乙苯是兩種相對分子質(zhì)量小于200的小分子物質(zhì),都含有苯環(huán)結(jié)構(gòu),兩者的分子形態(tài)結(jié)構(gòu)非常相似,比較有代表性,所以我們用制備的聚(GMADVB)型整體柱對苯和乙苯進(jìn)行分離,以期反映該整體柱對小分子物質(zhì)的分離能力。圖5是聚(GMA-DVB)型整體柱對苯和乙苯的分離譜圖。當(dāng)流動相流速為1mL/m in時,整體柱的背壓為5M Pa,在10m in以內(nèi)就能完成一次分離,理論塔板數(shù)達(dá)到37 000塔板/m,R1/2值達(dá)到7.14。

奧拉西坦的化學(xué)名稱為4-羥基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺,相對分子質(zhì)量為158.16,是一種副作用小的治療老年癡呆的處方藥。圖6是所制備的整體柱對奧拉西坦的分離圖。從圖6中可以看出,分析時間少于5m in,可以對奧拉西坦進(jìn)行快速的定性檢測。

圖5 聚(GMA-DVB)型整體柱分離苯和乙苯的色譜圖Fig.5 Chromatogram of separation of benzene and ethylbenzene on a poly(GMA-DVB)monolithic column

圖6 聚(GMA-DVB)型整體柱分離藥物奧拉西坦的色譜圖Fig.6 Chrom a togram of oxirace tam drug on a poly(GMA-DVB)monolithic column.

3 結(jié)論

本文通過三因素三水平正交試驗優(yōu)化了聚(GMA-DVB)型整體柱的制備。制備的整體柱對小分子物質(zhì)有很好的分離分析效果,柱效和分離度很高,制備的重復(fù)性很好,經(jīng)濟(jì)適用,基本滿足商品化的要求。制備的聚(GMA-DVB)型整體柱可以進(jìn)一步對其表面的環(huán)氧基團(tuán)進(jìn)行修飾,對今后探索手性整體柱的制備工作有很大的指導(dǎo)意義。制備可以分離手性對映體的整體柱將是我們今后研究工作的重點。

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Optimization of preparation of poly(glycidyl methacrylated ivinylbenzene)monolithic column with orthogonal experiments for separation of small molecules

MA Wei1,XU Huanxin1,2,L IU Zuozhen1,2＊,N ING Fanghong1,2
(1.Sta te Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,200237,China;2.Shanghai Huazhen Scientific& Technological Co.,Ltd.,Shanghai 200237,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0175-05

＊通訊聯(lián)系人:劉坐鎮(zhèn),教授,碩士生導(dǎo)師.Tel:(021)64252342,E-m ail:lzz@ecust.edu.cn.

2009-07-28

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00175