天冬氨酸作為非特異性吸附抑制劑在二氧化鈦選擇性富集磷酸肽中的應(yīng)用

遲 明, 畢 煒, 盧 莊, 宋麗娜, 賈 偉, 張養(yǎng)軍, 錢小紅, 蔡 耘

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所,蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京蛋白質(zhì)組研究中心,北京102206)

天冬氨酸作為非特異性吸附抑制劑在二氧化鈦選擇性富集磷酸肽中的應(yīng)用

遲 明, 畢 煒, 盧 莊, 宋麗娜, 賈 偉, 張養(yǎng)軍, 錢小紅, 蔡 耘＊

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所,蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京蛋白質(zhì)組研究中心,北京102206)

二氧化鈦富集法作為目前使用最為廣泛的金屬氧化物富集磷酸肽的方法,在富集過(guò)程中常常對(duì)富含天冬氨酸和谷氨酸的酸性非磷酸化肽段存在一定的非特異性吸附作用。這些肽段與磷酸化肽段一同被富集,降低了磷酸肽富集的選擇性。傳統(tǒng)方法中使用的非特異性吸附抑制劑常會(huì)對(duì)質(zhì)譜的電噴霧離子源造成污染,因而限制了其在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)系統(tǒng)中的應(yīng)用。本研究將天冬氨酸作為一種新型的非特異性吸附抑制劑加入到二氧化鈦富集體系中,并分別對(duì)3種和9種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)酶切肽段混合物進(jìn)行富集實(shí)驗(yàn),同時(shí)與添加另一種非特異性吸附抑制劑——谷氨酸以及不添加任何非特異性吸附抑制劑的富集體系進(jìn)行了富集效果的比較。結(jié)果表明,天冬氨酸可以有效地提高二氧化鈦對(duì)磷酸肽富集的選擇性。將添加天冬氨酸的二氧化鈦富集體系應(yīng)用于鼠肝全蛋白質(zhì)磷酸肽的富集中,同樣取得了很好的效果,表明天冬氨酸在復(fù)雜的生物樣本的磷酸肽富集中也同樣具有良好的應(yīng)用前景。此外,由于天冬氨酸在反相色譜中極易被洗脫去除,從而避免了傳統(tǒng)抑制劑對(duì)LC-MS系統(tǒng)離子源的污染問(wèn)題。

二氧化鈦;富集;非特異性吸附抑制劑;天冬氨酸;磷酸肽;鼠肝

Abstract:Titanium dioxide(TiO2)is one of metal oxides widely used for phosphopep tide enrichment in phosphop roteomic research now a days.How ever it can bind to some non-phosphorylated peptides containing one or more aspartic acid residues and/or glutamic acid residues.These non-phosphorylated pep tides can be eluted along with phosphorylated pep tides and cause the reduction of the selectivity.Conventional inhibitors for the non-specific binding of nonphosphorylated pep tides can often contaminate the ion source of mass spectrometry and therefore their applications are limited in liquid Chromatography-mass spectrometry(LC-MS).In this study,aspartic acid was reported as a novel non-specific binding inhibitor for phosphopeptide enrichment by titanium dioxide.Firstly,the tryptic peptide mixtures of3and9standard proteins were used for the comparison of the enrichment efficiency of titanium dioxide.The effects with the presence of aspartic acid,glutamic acid and no-inhibitor in the enrichment system s were com pared separately.The results show ed that as partic acid can greatly improve the selectivity of titanium dioxide for phosphopep tide enrichment.Then,aspartic acid was used for the enrichment of tryptic pep tide mixture of C57BL/6J mouse liverlysate and good results were also obtained which demonstrated that aspartic acid was a promising non-specific binding inhib-it or for complex biological samples.Besides,no contamination in the ion source occurred during the mass spectrometric analysis.

Key words:titanium dioxide;enrichment;non-specific binding inhibitor;asparticacid;phosphopeptides;mouse liver

蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化過(guò)程是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)等諸多生命過(guò)程中最普遍也是最重要的調(diào)控手段之一[1],在生物學(xué)功能研究領(lǐng)域受到廣泛的關(guān)注。以質(zhì)譜技術(shù)為核心的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的方法可以系統(tǒng)、規(guī)?；貙?duì)復(fù)雜體系中的磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行定性及定量分析,從而為與蛋白質(zhì)磷酸化相關(guān)的各種生物學(xué)功能研究提供通量化的技術(shù)平臺(tái)和極有價(jià)值的數(shù)據(jù)集。但由于磷酸化修飾的蛋白質(zhì)含量少、化學(xué)計(jì)量值低、質(zhì)譜檢測(cè)離子化效率低,使得磷酸肽的質(zhì)譜檢測(cè)較為困難。而在復(fù)雜的生物樣本中,大量高豐度、非磷酸化肽段的存在進(jìn)一步抑制了磷酸肽的質(zhì)譜信號(hào),若對(duì)生物樣品直接進(jìn)行質(zhì)譜分析,磷酸肽的檢出率會(huì)更低,因此在質(zhì)譜檢測(cè)前對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行相應(yīng)的分離富集是必不可少的步驟之一。目前比較常用的磷酸肽富集方法包括固定化金屬離子親和色譜法( IMAC),如Fe3+- IMAC[2]、Ga3+- IMAC[3]、Zr4+- IMAC[4]等;金屬氧化物富集法,如二氧化鈦[5]、二氧化鋯[6]等;離子交換色譜法,如強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜(SCX)[7]、強(qiáng)陰離子交換色譜(SAX)[8]等。其中金屬氧化物富集法特別是二氧化鈦富集法,由于對(duì)磷酸肽的富集效果好,且價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便,從而成為最為廣泛的磷酸肽富集方法之一。但由于二氧化鈦除了可以吸附磷酸基團(tuán)外,對(duì)天冬氨酸及谷氨酸這樣的酸性氨基酸也有一定的吸附作用,因而在富集磷酸肽的同時(shí)也富集了富含天冬氨酸及谷氨酸殘基的非磷酸肽,從而對(duì)磷酸肽的質(zhì)譜檢測(cè)造成一定的干擾。為了減少這些非磷酸肽與二氧化鈦的結(jié)合,常常在上樣緩沖液中加入一些含苯環(huán)的小分子有機(jī)酸作為抑制劑來(lái)減少這種非特異性吸附,常用的有機(jī)酸有2,5-二羥基苯甲酸(2,5-DHB)和鄰苯二甲酸(PA)[9]。但由于這兩種有機(jī)酸會(huì)造成電噴霧離子源的污染,因此此類抑制劑在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)系統(tǒng)中的應(yīng)用受到一定的限制。W u等[10]采用谷氨酸這種酸性氨基酸作為非特異性吸附抑制劑,避免了對(duì)LC-MS系統(tǒng)中電噴霧離子源的污染,同時(shí)取得了很好的磷酸肽富集效果。本文選擇另一種側(cè)鏈含有羧基的酸性氨基酸——天冬氨酸作為二氧化鈦富集方法中的非特異性吸附抑制劑,并通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)酶切肽段混合物及復(fù)雜樣品中磷酸肽的富集效果的考察和比較,發(fā)現(xiàn)天冬氨酸可以作為一種新型、有效的非特異性吸附抑制劑,它可以顯著提高二氧化鈦富集磷酸肽的效率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LCQ-Deca質(zhì)譜儀(Therm o Fisher公司);LTQ-FTICR質(zhì)譜儀(Thermo Fisher公司);高效液相色譜儀(Agilent1100型,Agilent Technologies公司);蛋白測(cè)定儀(SmartSpec Plus,Bio-Rad公司);組織勻漿器(15mL,D ounce,美國(guó)安普科技中心);恒溫水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司);真空冰凍干燥機(jī)(SC100A Speedvac Plus,Thermo Savant公司);冷凍高速離心機(jī)(3K30,Sigma公司);體外超聲儀(Vibra Cell,Sonics公司);旋轉(zhuǎn)混合器(DH-II,寧波新芝生物科技股份有限公司)。α-酪蛋白(α-casein)、β-酪蛋白(β-casein)、卵清蛋白(ovalbum in)、心肌紅蛋白(myoglobin)、溶菌酶(lysozyme)、細(xì)胞色素C(cytochrome C)、α-淀粉酶(α-amylase)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)、磷酸酶抑制劑(美國(guó)Sigm a公司);牛血清白蛋白(bovine serum album in,BSA,北京方潤(rùn)生物科技有限公司)。蛋白酶抑制劑(complete protease inhibitor cocktail tablets)(瑞士Roche公司);測(cè)序級(jí)胰蛋白酶(trypsin)、1,4-二硫蘇糖醇(D TT)(美國(guó)Prom ega公司);碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA)、Bradford定量試劑盒(美國(guó)Bio-Rad公司);分析純乙醇、氯化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、尿素、碳酸氫銨、氟化鈉、焦磷酸鈉、礬酸鈉(北京化學(xué)試劑公司)。三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)(德國(guó)Aldrich公司);色譜純乙腈(acetonitrile,ACN)(美國(guó)J.T.B aker公司);25%氨水(NH3·H2O)、甲酸(formic acid,FA)(美國(guó)Fluka公司);去離子水(由美國(guó)M illipore公司M illi-Q純水系統(tǒng)制備)。二氧化鈦顆粒(粒徑40μm,孔徑30nm)(Sachtleben Chemie GmbH)。C18填料(北京金歐亞公司)。Sp in柱管(美國(guó)Pierce公司)。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為C57BL/6J(8～9周齡)小鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物的制備

3種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物由α-酪蛋白、β-酪蛋白和卵清蛋白組成;9種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物由α-酪蛋白、β-酪蛋白、卵清蛋白、心肌紅蛋白、細(xì)胞色素C、α-淀粉酶、β-乳球蛋白、溶菌酶和BSA組成。每種蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度均為1μg/μL。

1.2.2 C57BL/6J小鼠肝臟蛋白質(zhì)的制備

實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食16h,自由飲水。采用頸部脫臼法處死小鼠后立即取肝臟,稱重后加入裂解液(9.5mol/L尿素/1%D TT/磷酸酶抑制劑(與裂解液體積比為1∶100)/蛋白酶抑制劑(1片/50mL裂解液))(按照5mL/g的比例)。冰上勻漿后超聲破碎細(xì)胞(每次超聲1s,暫停1s;共計(jì)60次),于40 000g下冷凍離心1h,取蛋白質(zhì)層樣本用B radford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。樣本分裝后于-80℃下保存。

1.2.3 蛋白質(zhì)酶切產(chǎn)物的制備

將蛋白質(zhì)以1m g/mL的質(zhì)量濃度溶于50 mmol/L碳酸氫銨溶液中,加入適量D TT至其最終濃度為10mmol/L,在56℃下變性1h后加入適量IAA至其最終濃度為55mmol/L,室溫下暗處放置1h,按m(蛋白質(zhì))/m(酶)=50∶1的比例加入胰蛋白酶,于37℃水浴中酶解12h。

1.2.4 酶切產(chǎn)物的脫鹽

將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的酶切產(chǎn)物按每種蛋白質(zhì)肽段20pmol/μL的比例混合,每次實(shí)驗(yàn)取1μL。鼠肝全蛋白質(zhì)樣本取150μg,用0.1%TFA將樣本稀釋至400μL,并確認(rèn)pH<3。將適量的C18填料裝填入Sp in柱管中,將其作為脫鹽柱,預(yù)先用ACN活化后,用0.1%TFA平衡。將前述樣品溶液上樣至脫鹽柱,然后用0.1%TFA溶液去除鹽組分,最后用80%的ACN溶液洗脫肽段。

1.2.5 酶切產(chǎn)物磷酸肽的富集

所采用的富集方法為略有改進(jìn)的B ahl等[11]和Thingho lm等[12]方法。將脫鹽后的酶切產(chǎn)物溶液的組成調(diào)整為60%ACN/5%TFA,然后分別加入天冬氨酸或谷氨酸至飽和;每管中加入10m g二氧化鈦顆粒,在室溫下富集1h,隨后用200μL50%ACN/0.1%TFA溶液洗去非特異性結(jié)合的肽段,再用200μL50%ACN溶液洗滌一次。最后用100μL 0.3mol/L氨水(pH10.5)將結(jié)合在T iO2上的磷酸肽洗脫下來(lái)。真空凍干,于-20℃下保存待用。

1.2.6 分析條件

(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)酶切產(chǎn)物的分析條件

色譜條件:預(yù)柱為C18柱(5mm×100μm,5 μm),分析柱為PicoFritTM反相柱(BioBasic C18,10cm×75μm,5μm,美國(guó)New O bjective公司),噴頭直徑為15μm。流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的水溶液;流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的乙腈溶液。流速:300nL/m in。梯度設(shè)置:0-4.5m in,0.1%B-4%B;4.5-65m in,4%B-40%B;65-67m in,40%B-100%B;67-80m in,100%B;80-82 min,100%B-4%B。

質(zhì)譜條件:使用Finnigan Proteome X系統(tǒng)連接LCQ-Deca質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)。采用全掃描(m/z 350～1 800)的一級(jí)質(zhì)譜和數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)質(zhì)譜掃描模式(data dependent MS/MS scan),依次選取一級(jí)質(zhì)譜中離子強(qiáng)度最強(qiáng)的3個(gè)離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè),動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為30s。實(shí)驗(yàn)在質(zhì)譜水平上重復(fù)進(jìn)行3次。

(2)C57BL/6J小鼠肝臟蛋白質(zhì)酶切產(chǎn)物的分析條件

色譜條件:流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的水溶液-乙腈(98∶2,v/v);流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的水溶液-乙腈(20∶80,v/v)。流速:300nL/m in。梯度設(shè)置:0-14m in,100%A;14-15m in,100%A-5%B;15-105m in,5%B-50%B;105-115 m in,50%B-100%B;115-125m in,100%B;125-126m in,100%B-100%A。

質(zhì)譜條件:采用配備納升級(jí)電噴霧源的LTQFTICR質(zhì)譜儀,與Agilent1100高效液相色譜儀串聯(lián)使用。采用全掃描(m/z400～1 600)的一級(jí)質(zhì)譜和數(shù)據(jù)依賴的二級(jí)質(zhì)譜掃描模式,依次選取一級(jí)質(zhì)譜中離子強(qiáng)度最強(qiáng)的10個(gè)離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜檢測(cè),動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為30s。實(shí)驗(yàn)在質(zhì)譜水平上重復(fù)進(jìn)行3次。

1.2.7 數(shù)據(jù)檢索

(1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)檢索

串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Thermo Finnigan Bioworks3.2整合的Sequest軟件對(duì)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索。參數(shù)設(shè)置:固定修飾選擇Carbam idomethyl(C),可變修飾選擇O xidation(M)、Phosphorylation(ST)和Phosphorylation(Y),允許酶切的肽段有2個(gè)漏切位點(diǎn),肽質(zhì)量誤差1.4。數(shù)據(jù)過(guò)濾參數(shù)設(shè)置:單電荷肽段Xcorr≥1.5,二電荷肽段Xcorr≥2.0,三電荷肽段Xcorr≥2.5;ΔCn≥0.08(ΔCn:排名前兩位的兩條肽段得分的差值)。

(2)鼠肝全蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)檢索

數(shù)據(jù)檢索使用M ascot搜索引擎進(jìn)行。數(shù)據(jù)庫(kù)為IPI mouse正反庫(kù)(Version3.53),參數(shù)設(shè)置:母離子質(zhì)量誤差0.001%,MS/MS碎片離子質(zhì)量誤差為0.8,允許存在2個(gè)漏切位點(diǎn),固定修飾選擇Carbamidomethyl(C),可變修飾選擇O xidation(M)、Phosphorylation(ST)和Phosphorylation(Y)。根據(jù)M ascot搜索結(jié)果卡分設(shè)置為31分(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 天冬氨酸作為非特異性吸附抑制劑的原理

磷酸肽和非磷酸肽與二氧化鈦結(jié)合的化學(xué)原理不同,因此文獻(xiàn)中常有使用2,5-DHB和PA作為非特異性吸附抑制劑抑制非磷酸肽與二氧化鈦的結(jié)合。但這兩種有機(jī)酸都會(huì)造成電噴霧離子源的污染。而電噴霧離子源是LC-MS系統(tǒng)中最常使用的離子源,在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,特別是針對(duì)極其微量的蛋白質(zhì)的磷酸化修飾研究中,LC-MS系統(tǒng)是必不可少的技術(shù)平臺(tái),因此采用高濃度的2,5-DHB或PA作為非特異性吸附抑制劑的溶液體系在復(fù)雜樣品的磷酸化蛋白質(zhì)分析中受到了一定的限制。為了避免2,5-DHB或PA對(duì)電噴霧離子源的污染,有人[10]采用谷氨酸作為二氧化鈦的非特異性吸附抑制劑,取得了很好的磷酸肽富集效果。天冬氨酸和谷氨酸均為含有兩個(gè)羧酸基團(tuán)的直鏈化合物(結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1),在溶液中,兩個(gè)羧酸基可能通過(guò)配位作用與二氧化鈦結(jié)合。在LC-MS系統(tǒng)中,天冬氨酸和谷氨酸不會(huì)在反相色譜柱上保留,可以很容易地通過(guò)在線脫鹽步驟被清除,因此不會(huì)對(duì)LC及電噴霧電離源造成污染。此外,與谷氨酸相比,天冬氨酸具有較短的碳鏈,空間位阻較小,酸性較強(qiáng),因此以天冬氨酸作為非特異性吸附抑制劑時(shí)會(huì)更有效地去除非磷酸化肽段。

圖1 天冬氨酸和谷氨酸的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Sructures of aspartic acid and glutamic acid

2.2 天冬氨酸對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)磷酸肽富集效果的影響

以天冬氨酸作為非特異性吸附抑制劑,對(duì)3種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的酶切肽段混合物中的磷酸肽進(jìn)行富集,考察天冬氨酸對(duì)富集效果的影響。在二氧化鈦反應(yīng)溶液中分別添加天冬氨酸、谷氨酸作為非特異性吸附抑制劑及不添加任何非特異性吸附抑制劑作為對(duì)照實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表1。表1中“Redundant peptide”代表鑒定到的冗余肽段,“Unique peptide”代表鑒定到的非冗余肽段。從該結(jié)果可以看出,在溶液體系中加入非特異性吸附抑制劑能降低非磷酸肽在二氧化鈦材料上的吸附,提高二氧化鈦富集磷酸肽的選擇性。其中,采用天冬氨酸作為非特異性吸附抑制劑富集的組分,經(jīng)質(zhì)譜鑒定到的所有肽段均為磷酸肽,即二氧化鈦對(duì)磷酸肽的選擇性為100%,其富集磷酸肽的效果明顯優(yōu)于使用谷氨酸及不添加任何非特異性吸附抑制劑的富集體系。

表1 3種標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白質(zhì)酶切肽段混合物富集鑒定結(jié)果Table1 Enrichment results for tryptic peptides from 3 standard prote in mixture

實(shí)際的生物樣本的組成更復(fù)雜,且非磷酸化蛋白質(zhì)的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于磷酸化蛋白質(zhì)的含量。為了模擬真實(shí)樣本,我們采用了更為復(fù)雜的9種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(3種磷酸化蛋白質(zhì),6種非磷酸化蛋白質(zhì))的酶切肽段混合物對(duì)天冬氨酸作為非特異性吸附抑制劑時(shí)磷酸肽的富集效果作了進(jìn)一步的考察,結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中可以看出,對(duì)于更復(fù)雜的樣品體系,二氧化鈦對(duì)磷酸肽的富集選擇性大小順序依次為:添加天冬氨酸的富集體系(93.26%)>添加谷氨酸的富集體系(92.89%)>不添加抑制劑的富集體系(72.24%)。

表2 9種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)酶切肽段混合物的富集鑒定結(jié)果Table2 Enrichment results for tryptic peptides from 9 standard prote in mixture

將兩種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)體系的考察結(jié)果進(jìn)行比較后不難看出,在相對(duì)復(fù)雜的體系中,添加天冬氨酸可以將二氧化鈦的富集選擇性提高20%以上;而在相對(duì)簡(jiǎn)單的體系中,添加天冬氨酸只將二氧化鈦的富集選擇性提高了7%。因此,我們推測(cè)樣品體系越復(fù)雜,天冬氨酸對(duì)二氧化鈦富集磷酸肽的選擇性的提高效果越顯著。

2.3 天冬氨酸對(duì)復(fù)雜生物樣本中磷酸肽富集效果的影響

在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,樣品的復(fù)雜程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于上述標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的酶切肽段混合物。為了考察天冬氨酸作為非特異性吸附抑制劑在實(shí)際復(fù)雜樣本中的使用效果,我們使用C57BL/6J小鼠肝臟全蛋白質(zhì)作為樣本,分別對(duì)添加天冬氨酸、谷氨酸作為抑制劑及不添加抑制劑的二氧化鈦富集體系對(duì)磷酸肽的富集效果進(jìn)行了比較,結(jié)果見(jiàn)表3。從結(jié)果可以看出,添加天冬氨酸可以非常有效地增加復(fù)雜樣本中二氧化鈦對(duì)磷酸肽的選擇性,且效果略優(yōu)于谷氨酸。每個(gè)組別的實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,沒(méi)有觀察到明顯的離子源污染現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明了天冬氨酸作為非特異性吸附抑制劑在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的有效性和實(shí)用性,也證實(shí)了我們前面在標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)中所作出的推測(cè),即在越復(fù)雜的體系(如實(shí)際生物樣本)中,天冬氨酸對(duì)提高二氧化鈦材料的富集選擇性的效果越顯著。

此外,從表3的結(jié)果還可以看出,雖然加入天冬氨酸或谷氨酸能非常有效地提高二氧化鈦富集磷酸肽的選擇性,但該體系用于復(fù)雜樣本的選擇性仍然只有大約50%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于在標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物中的選擇性,說(shuō)明實(shí)際樣品組成的高度復(fù)雜性給磷酸肽富集帶來(lái)了更多的困難。這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)降低樣本的復(fù)雜程度來(lái)解決,即在富集之前對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)分離或用其他的策略對(duì)磷酸肽進(jìn)行預(yù)富集。

表3 鼠肝全蛋白質(zhì)酶切肽段混合物的富集鑒定結(jié)果Table3 Enrichment results for tryptic peptides from C57BL/6J mouse live rlysate

2.4 樣本的復(fù)雜程度對(duì)天冬氨酸作為非特異性吸附抑制劑效果的影響

通過(guò)上面的研究可以看出,在不同復(fù)雜程度的樣本中,是否使用非特異性吸附抑制劑及所用抑制劑的種類對(duì)二氧化鈦富集的選擇性具有不同的作用。圖2展示了不同的樣本復(fù)雜程度下非特異性吸附抑制劑對(duì)二氧化鈦富集選擇性的影響。在樣本相對(duì)簡(jiǎn)單的情況(3種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物)下,是否添加抑制劑對(duì)選擇性的影響并不是很明顯;而在相對(duì)復(fù)雜的情況(9種標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物)下,非特異性吸附抑制劑對(duì)磷酸肽的二氧化鈦富集展現(xiàn)出其作用的有效性;當(dāng)使用實(shí)際的復(fù)雜樣本(鼠肝全蛋白)時(shí),富集的結(jié)果充分證實(shí)了添加非特異性吸附抑制劑的必要性。在不同樣本復(fù)雜程度下,天冬氨酸作為抑制劑的效果均略優(yōu)于谷氨酸,顯示了其作為非特異性吸附抑制劑在二氧化鈦富集磷酸肽過(guò)程中的有效性。隋少卉等[13]證明經(jīng)由SCX分離降低系統(tǒng)復(fù)雜度有助于磷酸化肽段的鑒定。因此我們推測(cè),在添加非特異性吸附抑制劑的二氧化鈦富集方法前對(duì)樣本進(jìn)行初分離可進(jìn)一步提高材料的選擇性。這種推測(cè)需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明。

圖2 樣本復(fù)雜程度及抑制劑對(duì)二氧化鈦富集選擇性的影響Fig.2 Effects of sample complexities and inhibitors on the selectivity of titanium dioxide enrichment

3 結(jié)論

在二氧化鈦富集體系中,天冬氨酸作為新型的非特異性吸附抑制劑能有效地提高二氧化鈦富集磷酸肽的選擇性。天冬氨酸在反相色譜柱上的保留很弱,很容易通過(guò)在線脫鹽步驟被清除,避免了對(duì)電噴霧離子源的污染,從而實(shí)現(xiàn)了二氧化鈦高效富集磷酸肽的方法與LC-MS系統(tǒng)的有效聯(lián)接。這一富集方法的改進(jìn)在磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)領(lǐng)域研究中具有重要的實(shí)用價(jià)值。

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Application of asp artic acid as a non-specific binding inhibitor in the enrichment of phosphopep tides with titanium dioxide

CHIMing,BIWei,LU Zhuang,SONG Lina,JIA Wei,ZHANG Yangjun,QIAN Xiaohong,CAI Yun＊
(Sta te Key Laboratory of Proteomics,Beijing Proteome Research Center,Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 102206,China)

O658

A

1000-8713(2010)02-0152-06

＊通訊聯(lián)系人:蔡 耘,研究員,碩士生導(dǎo)師.Tel:(010)80705188,E-m ail:caiy_2007@yahoo.com.cn.

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展(“973”)計(jì)劃項(xiàng)目(No.2006CB910801)、國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展(“863”)計(jì)劃項(xiàng)目(No.2008AA02Z309)、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Nos.20735005,20875101,20905077)和蛋白質(zhì)組學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(Nos.SKLP-K200807,SKLP-O200808).

2009-12-28

DO I:10.3724/SP.J.1123.2010.00152