注射用哌拉西林鈉中高分子聚合物的測定

江蘇省泰州藥品檢驗所（225500） 屈蓉

注射用哌拉西林鈉是半合成青霉素類抗生素，過敏反應(yīng)包括蕁麻疹等各類皮疹、白細(xì)胞減少、間質(zhì)性腎炎、哮喘發(fā)作和血清病型反應(yīng)，嚴(yán)重者偶見如過敏性休克。大量實驗和研究已證實，β-內(nèi)酰胺類抗生素所致的速發(fā)型過敏反應(yīng)并非由藥物本身所致，而是與藥物中存在的高分子聚合物有關(guān)[1]。因此，在生產(chǎn)和貯存過程中應(yīng)嚴(yán)格控制高分子聚合物的含量，以保證該類產(chǎn)品的質(zhì)量以及臨床用藥安全。本品已為《中國藥典》2010年版收載品種，但未收載高分子聚合物測定項。本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[2]，利用分子排阻色譜法，建立了注射用哌拉西林鈉中高分子聚合物的測定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Amersham Biosciences AKTA prime 抗生素高分子雜質(zhì)儀，Primeview Evaluation 色譜軟件；METTLER AG135 電子天平。

1.2 藥品和試劑 磷酸二氫鈉（分析純），磷酸氫二鈉（分析純），注射用哌拉西林鈉（A廠批號：8100231BI、0010202BH，B廠批號：09102701），哌拉西林鈉對照品（中檢所 批號130419-200103 含量：90.5%）。

附表1 系統(tǒng)試驗數(shù)據(jù)

附表2 對照溶液的濃度及峰面積

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性 色譜柱：葡聚糖凝膠 Pharmadex G10柱（16mm×37cm），流動相A： pH值為7的0.025mol/L磷酸鹽緩沖液[0.025mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.025mol/L磷酸二氫鈉溶液（61：39）]，流動相B為超純水。流速：1.0ml，檢測波長：254nm，進(jìn)樣量200μl。分別以流動相A、B為流動相，取0.1mg/ml藍(lán)色葡聚糖2000溶液200μl注入液相色譜儀，理論塔板數(shù)按藍(lán)色葡聚糖2000峰計算應(yīng)不低于700，拖尾因子小于2.0。在兩種流動相系統(tǒng)中，藍(lán)色葡聚糖2000峰保留時間的比值為0.93～1.07，對照品溶液主峰與和供試品溶液中聚合物與相應(yīng)色譜系統(tǒng)中，藍(lán)色葡聚糖2000的保留時間的比值均應(yīng)在0.93～1.07。另以流動相B為流動相，精密量取對照液200μl，連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不得大于5.0% （結(jié)果見附表1）。

2.2 實驗結(jié)果

2.2.1 對照溶液的線性關(guān)系 精密稱取哌拉西林鈉對照品20.36mg，置100ml量瓶中，用少量甲醇溶解后，加純水稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。再分別精密量取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml置于10ml量瓶中，用純水稀釋至刻度，搖勻。將此6種溶液分別重復(fù)進(jìn)樣2次，每次進(jìn)樣200μl，記錄色譜圖，計算2次平均峰面積對濃度的一元回歸議程。結(jié)果表明哌拉西林在濃度18～110μg·ml-1的范圍內(nèi)線性良好。以哌拉西林對照溶液峰面積為縱坐標(biāo)，濃度（μg·ml-1）為橫坐標(biāo)，求得回歸方程：Y=0.4228X-0.2778，相關(guān)系數(shù)為0.9993。（結(jié)果見附表2）

2.2.2 對照溶液峰的重復(fù)性 取2.2.1項下55.2774μg/ml對照溶液，以流動相B為流動相，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，峰面積分別為22.0880、22.7169、23.0411、22.7647、22.5272，計算相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）為1.6%。

2.2.3 高分子聚合物峰的線性范圍 取同一批樣品（批號：8100231BI），分別稱取50.08mg、99.60mg、199.52mg、402.92mg、599.24mg置10ml量瓶中，用少量甲醇溶解后，加水稀釋至刻度，制成供試液，立即進(jìn)樣，聚合物的峰面積分別為3.5600、7.0488、16.3512、34.0616、49.4497。以注射用哌拉西林鈉的濃度（mg·ml-1）為橫坐標(biāo)，以聚合物的峰面積為縱坐標(biāo)。求得回歸方程為：Y=0.8464X-0.7814，相關(guān)系數(shù)為0.9996。結(jié)果供試液濃度在5～60 mg·ml-1范圍內(nèi)對聚合物的峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.4 聚合物峰的重復(fù)性 取同一批樣品（批號：8100231BI）約0.2g 5份，精密稱定，置10ml的量瓶中，用少量甲醇溶解后，加水稀釋至刻度，分別進(jìn)樣，聚合物的峰面積分別為16.3512、15.7606、16.9819、16.6477、15.9660，計算相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD） 為3.0%。

2.2.5 以信噪比10：1為指標(biāo)，測得定量限為2×10-3mg·ml-1。

2.2.6 樣品測定 分別取三批不同批號的樣品，精密稱取約0.2g，置于10ml量瓶中，用少量甲醇溶解后，加水稀釋至刻度，搖勻，立即精密量取200μl進(jìn)樣，以流動相A為流動相進(jìn)行測定，記錄色譜圖，測得8100231BI、0010202BH和 09102701 的聚合物含量分別為0.22%、0.19%、0.12%。

3 討論

3.1 流動相A 的磷酸鹽濃度 實驗中分別采用0.01mol·L-1、0.025mol·L-1、0.05mol·L-1、0.1mol·L-1pH7.0的磷酸鹽緩沖液為流動相進(jìn)行實驗，結(jié)果表明，在0.025 mol·L-1磷酸鹽緩沖液中分離度最大，且聚合物的峰形較對稱。故選用0.025 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液作為流動相。

3 .2 流速的選擇 實驗中分別采用0.8 ml·min-1、1.0 ml·min-1、1.5 ml·min-1流速，記錄色譜圖。結(jié)果表明，0.8ml·min-1主峰流出時間過長，1.5 ml·min-1其分離度不好，選用1.0ml·min-1測定時，主峰分離度較好，且出峰時間適宜，故選用流速為1.0ml·min-1。

3.3 流動相A 的pH 值 分別以pH 8.0，pH7.0，pH6.0的0.025 mol·L-1磷酸鹽緩沖液為流動相，進(jìn)行實驗。結(jié)果表明，在pH6.0和pH8.0的緩沖液中，聚合物的分離效果不理想，在pH7.0的緩沖液中分離情況較好，故選用pH為7.0的0.025 mol·L-1磷酸鹽緩沖液作為流動相A。

3.4 為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，供試品溶液在制備完成后應(yīng)立即進(jìn)樣。