食物過敏原蛋白的定量檢測方法

閆 飛，廖志勇，吳志華,*，陳紅兵

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；2.溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

食物過敏原蛋白的定量檢測方法

閆 飛1，廖志勇2，吳志華1,*，陳紅兵1

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；2.溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035)

食物過敏現(xiàn)象的日益嚴(yán)重凸顯食物過敏原蛋白定量檢測的重要性。目前對食物過敏原蛋白進(jìn)行定量檢測的方法多是基于單個(gè)蛋白的間接測定。隨著質(zhì)譜分析方法的進(jìn)步，定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已開始并將廣泛應(yīng)用于復(fù)雜食品混合物中微量過敏原的直接定量檢測。本文分別對基于單個(gè)蛋白和蛋白質(zhì)組學(xué)的食物過敏原蛋白的定量測定方法進(jìn)行綜述。

定量；過敏原；質(zhì)譜；蛋白質(zhì)組學(xué)

Abstract:The increasing phenomena of food allergy have highlighted the importance of quantitative analysis of food allergens.Currently, most methods for the quantitative detection of food allergens are indirect methods based on a single protein. Due to the development of mass spectrometry, quantitative proteomics is being widely used for the direct quantitative detection of trace allergens in complex food mixtures. In this paper, the research progress in quantitative detection methods for food allergens is discussed.

Key words：quantification；food allergen；mass spectrometry (MS)；proteomics

現(xiàn)在食物過敏現(xiàn)象越來越引起人們的重視，在西方發(fā)達(dá)國家，1%～2%的成人與5%～8%的兒童都存在食物過敏現(xiàn)象[1]，其中兒童主要以牛奶和雞蛋過敏為主[2]，而成人主要以海鮮貝殼類食物過敏為主[3]。有明顯跡象表明，食物過敏現(xiàn)象在近幾年有嚴(yán)重的趨勢，Sicherer等[4]于1997—2002年間在美國對花生過敏癥患病率進(jìn)行了跟蹤研究，發(fā)現(xiàn)患病率增加了一倍。在世界衛(wèi)生組織報(bào)告的威脅人類健康的因素中，食物過敏排在第4位，并且現(xiàn)在仍然沒有徹底有效的治療食物過敏的方法。在食品加工工業(yè)中，原料里幾乎不可避免的含有各種致敏蛋白，例如雞蛋、牛奶、花生等，食物過敏患者想完全避免接觸致敏物非常困難。

為確保食品標(biāo)簽的準(zhǔn)確性和消費(fèi)者的安全，可靠、定量的過敏原蛋白檢測方法是非常必要的。因?yàn)槭澄镞^敏原在食品中的含量較少并可能包裹于食品基質(zhì)中，所以食物過敏原的檢測十分困難。極少量的過敏原蛋白即可引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，這對食物過敏原蛋白定量檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性提出了更高的要求。本文分別對基于單個(gè)蛋白(如ELISA法)和定量蛋白質(zhì)組學(xué)的食物過敏原定量檢測方法進(jìn)行綜述，單個(gè)蛋白檢測技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)較為成熟，但尚不足以滿足實(shí)際需要，而蛋白質(zhì)組學(xué)方法的運(yùn)用，為實(shí)現(xiàn)對多種食品過敏原同時(shí)進(jìn)行高通量、高靈敏度的快速檢測提供了新的手段。

1 基于單個(gè)蛋白的食物過敏原定量檢測

基于單個(gè)蛋白的食物過敏原定量檢測方法主要為免疫學(xué)方法，除傳統(tǒng)免疫學(xué)方法外，生物傳感器也被應(yīng)用于檢測當(dāng)中。目前主要的過敏原定量檢測方法主要包括如下幾類：

1.1 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA法)

隨著全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀的普及，ELISA法在上世紀(jì)90年代末期發(fā)展迅速，其特異性和靈敏度也有了很大的提高，大大擴(kuò)展了其在食品檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用。ELISA法是一種免疫測定技術(shù)，基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及酶標(biāo)記。在最常用的雙抗體夾心ELISA法中，首先將抗體結(jié)合在固相載體表面，使其與樣品蛋白反應(yīng)，然后加入酶標(biāo)記的二抗來檢測已結(jié)合于固相載體表面的樣品蛋白。結(jié)合于固相載體表面的樣品蛋白越多，酶標(biāo)記二抗的顯色反應(yīng)就越強(qiáng)，由此進(jìn)行樣品蛋白的定量分析[5]。

目前，在食物過敏原的各種檢測方法中，ELISA法是使用范圍最廣的檢測方法，多采用雙抗體夾心法，具有特異性高、敏感性強(qiáng)、快速方便、設(shè)備投資小等優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)比較精確的定量檢測。根據(jù)報(bào)道，使用雙抗體夾心ELISA法檢測牛奶過敏原蛋白的最低檢出限可達(dá)25μg/L[6]。此外，還有用此法對大豆和花生過敏原蛋白進(jìn)行檢測的相關(guān)報(bào)道[7-8]，也能達(dá)到相當(dāng)?shù)臋z測水平。正因?yàn)镋LISA法的諸多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)實(shí)施過敏原法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)的歐盟、美國、加拿大和日本等國家均推薦ELISA法為過敏原檢測方法[9]，而且現(xiàn)在商業(yè)食物過敏原檢測試劑盒絕大多數(shù)也都是基于ELISA技術(shù)，在西方發(fā)達(dá)國家其應(yīng)用已經(jīng)比較普及[10]。

為了進(jìn)一步提高ELISA法的靈敏度與準(zhǔn)確度，近年新興了一種將ELISA與電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS)相結(jié)合的方法，即ELISA-ICP-MS法，在此方法中，用穩(wěn)定同位素取代酶對二抗進(jìn)行標(biāo)記，然后可通過質(zhì)譜進(jìn)行定量分析。根據(jù)報(bào)道，用此法可以在1g的谷類食品混合物中檢測出2μg的花生過敏原[11]。

1.2 RAST/EAST及RAST/EAST抑制實(shí)驗(yàn)

自從IgE成功純化及抗IgE抗體成功制備后，放射過敏原吸附實(shí)驗(yàn)(radio allergo sorbent test，RAST)與酶標(biāo)記過敏原吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked allergo sorbent assays，EAST)檢測技術(shù)就建立起來[12-13]，其基本原理都是在固相載體上使特異性IgE抗體與食物過敏原結(jié)合，然后進(jìn)行檢測，現(xiàn)在已是一種標(biāo)準(zhǔn)化的食物過敏原檢測方法，使用廣泛[14]。

在此基礎(chǔ)上又建立了放射過敏原吸附抑制實(shí)驗(yàn)(RAST抑制實(shí)驗(yàn))和酶標(biāo)記過敏原吸附抑制實(shí)驗(yàn)(EAST抑制實(shí)驗(yàn))，可對食物過敏原進(jìn)行定量測定，其在食物過敏原檢測中獲得了廣泛的應(yīng)用[15]。RAST/EAST抑制實(shí)驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是可以實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)操作，避免了人為操作帶來的誤差；缺點(diǎn)是對人血清的依賴，人血清的個(gè)體差異性限制了這兩種方法在食物過敏原定量檢測中的應(yīng)用。

1.3 火箭電泳(rocket immuno-electrophoresis，RIE)法

RIE法是將含有已知抗體的瓊脂制成瓊脂板，冷凝后，在液板上的陰極端挖一排小孔，孔中分別加入一定量的待檢樣品及不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)抗原，進(jìn)行電泳。抗原向陽極移動(dòng)，并與抗體結(jié)合。在抗原、抗體比例適當(dāng)?shù)牟课恍纬慑F形沉淀峰，其形狀如火箭，該峰的高度與抗原量成正比，可快速測出標(biāo)本中過敏原的含量[16]。

RIE用于食物過敏原檢測的報(bào)道不多。Malmheden-Yman等[17]用其檢測了不同食品中雞蛋、牛奶和花生蛋白的含量。RIE的優(yōu)點(diǎn)是檢測速度快，缺點(diǎn)是制膠操作和染色過程比較繁瑣。

1.4 組胺釋放實(shí)驗(yàn)

致敏靶細(xì)胞被食品過敏原蛋白激發(fā)后會(huì)釋放出組胺，然后用放射免疫法、熒光測定法檢測組胺含量，再與合適參照進(jìn)行比較，就可以對食品過敏原蛋白進(jìn)行測定。其中陽性參照與陰性參照一般分別為抗IgE抗體與樣品介質(zhì)，這樣可以排除在實(shí)驗(yàn)中非特異性組胺釋放造成的影響[18]。

現(xiàn)已有通過體外組胺釋放實(shí)驗(yàn)對大豆、牛奶和雞蛋過敏原蛋白經(jīng)行檢測的報(bào)道[19-21]，都表現(xiàn)出了很高的靈敏度與很好的重現(xiàn)性。

1.5 生物傳感器

生物傳感器是一項(xiàng)還未普及應(yīng)用到食品分析中的技術(shù)。生物傳感器可以即時(shí)測定特定分子之間的反應(yīng)，把一個(gè)目標(biāo)分子(可能是抗體或DNA片段)固定到傳感器的表面，然后定量測定一個(gè)或兩個(gè)分子間的鍵合作用。特點(diǎn)是分析時(shí)間短、自動(dòng)化程度高。生物探測器技術(shù)可以用來測定特定的蛋白質(zhì)或過敏原，也可以用于測定特定的DNA片段。目前國內(nèi)該技術(shù)的應(yīng)用仍較少，國外已見報(bào)道，Wohrl等[22]用微芯片技術(shù)檢測食物過敏原，與其他檢測方法相比，該法重現(xiàn)性和靈敏性較好，檢測時(shí)間也短，在1h內(nèi)就可以完成檢測。此外，Matsuya等[23]也做了類似的實(shí)驗(yàn)。

以上是食物過敏原定量分析的一些經(jīng)典方法，通過表1可以對各方法有更加直觀的了解。

表1 食物過敏原檢測常用方法[24]Table 1 Commonly used methods for the detection of food allergens

對比這些檢測食物過敏原蛋白的方法可以發(fā)現(xiàn)，雖然檢測方法各不相同，但共同點(diǎn)都是對單個(gè)蛋白進(jìn)行的間接檢測。以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測方法其相似點(diǎn)是運(yùn)用血清進(jìn)行抗原-抗體的特異性反應(yīng)，但是由于血清個(gè)體的差異性以及過敏原致敏表位被包埋等因素的影響，以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的檢測方法就不可避免依賴于抗體/血清的制備和分離純化。不同批次的抗體/血清對食物過敏原蛋白定量檢測具有主要的影響。

近年來發(fā)展迅速的定量蛋白質(zhì)組學(xué)為食物過敏原的定量分析提供了一條新的途徑，無需抗體/血清可直接測定過敏原蛋白的含量。

2 基于定量蛋白質(zhì)組學(xué)的食物過敏原定量檢測

定量蛋白質(zhì)組學(xué)是把一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜的混合體系內(nèi)所有的蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的定量和鑒定的一門學(xué)科[25]。而食品過敏原就是食品所含蛋白質(zhì)混合體系中能引起人們過敏反應(yīng)的一類蛋白質(zhì)，所以，現(xiàn)在定量蛋白質(zhì)組學(xué)與質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于食品過敏原檢測已有報(bào)道。

因?yàn)椴煌N類的蛋白質(zhì)具有不相同的離子化能力，所以質(zhì)譜在傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組研究中一般只用于對未知蛋白質(zhì)的鑒定，不能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的定量分析。直到Oda等[26]提出穩(wěn)定同位素代謝標(biāo)記方法和Gygi等[27]提出同位素親和標(biāo)簽技術(shù)才解決了這個(gè)問題。下面詳細(xì)介紹這些技術(shù)。

2.1 蛋白質(zhì)水平的定量分析

被分析物是蛋白質(zhì)本身，在定量分析過程中蛋白質(zhì)并沒有修飾。將蛋白質(zhì)混合物直接經(jīng)過質(zhì)譜分析儀，得到質(zhì)譜分析圖，不同于人類血清質(zhì)譜圖，食物混合物的質(zhì)譜圖并沒有那么復(fù)雜，因此可以使用外標(biāo)法對不同的蛋白進(jìn)行定量分析。

以牛奶為例，牛奶中20%是乳清蛋白，其中包含α-乳白蛋白、β-乳球蛋白(A和B)、牛血清白蛋白和免疫球蛋白等，Huber等[28]第一次運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)對牛乳清蛋白進(jìn)行了定量分析，在濃縮液中測得α-乳白蛋白、β-乳球蛋白B和β-乳球蛋白A的質(zhì)量濃度分別為0.684、1.839mg/mL和1.599mg/mL。Monaci等[29]在某牛奶果汁的樣品中對以上這3種牛奶過敏原進(jìn)行了定量測定，最后所得檢測限為4μg/mL。

2.2 肽段水平的定量分析

此方法的基礎(chǔ)在于肽段豐度可以用質(zhì)譜峰的信號強(qiáng)度來表現(xiàn)，它可以分為兩大類：第一類為標(biāo)記定量技術(shù)；第二類則為無標(biāo)記定量技術(shù)。而前者則可細(xì)分為同位素標(biāo)記目標(biāo)肽段的質(zhì)譜分析方法和同位素標(biāo)記合成肽段作為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜分析方法[30]。由于此方法的檢測物是肽段，所以在檢測前必須對檢測食物進(jìn)行處理以獲得可檢測肽段。

2.2.1 同位素標(biāo)記目標(biāo)肽段的質(zhì)譜分析方法

使用同位素標(biāo)記目標(biāo)肽段的質(zhì)譜分析方法在近十年來取得了很大的發(fā)展，其基本原理是分別用輕型和重型同位素標(biāo)記必需氨基酸，然后將不同標(biāo)記的蛋白按一定比例混合并處理，分離純化后進(jìn)行質(zhì)譜分析。通過對氨基酸序列相同但由不同同位素標(biāo)記的肽段豐度的比較，就可以得到各種蛋白的定量關(guān)系，所以此方法主要應(yīng)用于相對定量分析，但其中很多方法同樣也可以應(yīng)用于絕對定量分析[31]。

根據(jù)引入標(biāo)記同位素方法的不同主要可以分為同位素代謝標(biāo)記法(stable isotope labeling by amino acids in cell culture，SILAC)、同位素親和標(biāo)簽法(isotope coded affinity tags，ICAT)、酶催化18O同位素標(biāo)記法和同重同位素標(biāo)簽標(biāo)記定量法(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)等[31]。

Weber 等[32]使用同位素標(biāo)記酪蛋白肽段，通過質(zhì)譜分析，在餅干中可定量檢測出1.25μg/g的酪蛋白；Shefche等[33]使用相似的方法在某香草冰淇淋中可定量檢測出10μg/g的主要花生過敏原蛋白Arah 1。

2.2.2 同位素標(biāo)記合成肽段作為內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜分析方法

同位素標(biāo)記的合成肽段作為內(nèi)標(biāo)的絕對定量蛋白質(zhì)組學(xué)基本原理是：在需檢測蛋白質(zhì)的氨基酸序列中選擇一段合適的肽段作為模板，用化學(xué)合成或基因表達(dá)的方法合成帶有一定同位素標(biāo)記的相同肽段作為內(nèi)標(biāo)，此合成肽段與模板肽段僅相對分子質(zhì)量有差異，然后通過檢測肽段的質(zhì)譜信號強(qiáng)度之比來對相應(yīng)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析[34]。

Careri等[35]使用合成肽段做內(nèi)標(biāo)物的方法對某巧克力果仁進(jìn)行了花生過敏源Arah 2與Arah 3/4的分析，其中Arah 2的檢測限達(dá)到了5μg/g混合物，Arah 3/4的檢測限更是達(dá)到了1μg/g混合物。

2.2.3 無標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析方法

無標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析方法是近幾年興起的一種新技術(shù)，只需分析通過質(zhì)譜大規(guī)模鑒定蛋白時(shí)所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)即可實(shí)現(xiàn)定量分析。現(xiàn)有的無標(biāo)記定量技術(shù)主要有兩種：基于一級質(zhì)譜信息和基于二級質(zhì)譜信息。前者的依據(jù)是與一級質(zhì)譜相關(guān)的肽段峰強(qiáng)度、峰面積、液相色譜保留時(shí)間等信息，后者的依據(jù)是與二級質(zhì)譜相關(guān)的每個(gè)蛋白質(zhì)鑒定到的肽段總次數(shù)、所鑒定肽段的離子價(jià)位等信息[34]。

無標(biāo)記定量技術(shù)不需要同位素標(biāo)簽做內(nèi)標(biāo)，具有經(jīng)濟(jì)、高通量和省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)，但它也比較依賴于儀器的狀態(tài)和樣品的復(fù)雜性等因素，所以現(xiàn)階段無標(biāo)記定量技術(shù)的應(yīng)用還不廣泛，暫未見在食物過敏原定量檢測方面的報(bào)道。

3 結(jié) 語

近年來，食物過敏現(xiàn)象在世界范圍普遍存在，因而食物過敏原蛋白的定量分析對保障食品安全、維護(hù)消費(fèi)者健康有著重要意義。隨著免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于單蛋白及其抗體的食物過敏原蛋白檢測方法已經(jīng)成熟，如ELISA方法。但以免疫學(xué)為基礎(chǔ)的食物過敏原蛋白定量分析方法都不是對過敏原蛋白進(jìn)行直接定量分析，在檢測的過程中都會(huì)受到諸如抗原、抗體及兩者反應(yīng)不完全等其他因素的影響，造成定量分析的不準(zhǔn)確，而且這些常規(guī)方法一般來說都是對單一蛋白進(jìn)行檢測。定量蛋白質(zhì)組學(xué)與質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展為食物過敏原檢測開辟了新的道路，現(xiàn)階段依靠同位素標(biāo)記技術(shù)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法已經(jīng)在食物過敏原的定量分析方面取得了令人可喜的成績，而且無標(biāo)記的絕對定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究也越來越引起人們的重視。定量蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測方法具有高通量、高靈敏的特點(diǎn)，可以一次對食品中的各種過敏原蛋白進(jìn)行檢測，節(jié)省了人力與反應(yīng)時(shí)間，隨著研究的深入，此方法必會(huì)成為蛋白質(zhì)定量分析的重要方法，最終實(shí)現(xiàn)其在食物過敏原蛋白定量分析中的實(shí)際應(yīng)用。

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A Review of Quantitative Detection of Food Allergens

YAN Fei1，LIAO Zhi-yong2，WU Zhi-hua1,*，CHEN Hong-bing1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University,Nanchang 330047, China；2. College of Life and Environmental Science, Wenzhou University, Wenzhou 325035, China)

TS207.3

A

1002-6630(2010)19-0426-04

2010-06-29

江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2007GQN2001)；江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(贛教技字[GJJ08052]號)

閆飛(1983—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锛庸み^程。E-mail：abcd_7221522@yahoo.com.cn

*通信作者：吳志華(1976—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锛庸み^程。E-mail：wuzhihua@ncu.edu.cn