灰樹花菌絲體β-葡聚糖的毒理學實驗

王寶琴，徐澤平，楊傳倫

(1.濱州市食品安全重點實驗室，濱州學院生命科學系，山東 濱州 256600；2.山東仁和生物有限公司，山東 濱州 256500)

灰樹花菌絲體β-葡聚糖的毒理學實驗

王寶琴1，徐澤平2，楊傳倫2

(1.濱州市食品安全重點實驗室，濱州學院生命科學系，山東 濱州 256600；2.山東仁和生物有限公司，山東 濱州 256500)

目的：對灰樹花菌株GF-932發(fā)酵菌絲體β-葡聚糖的食用安全性進行初步研究及評價。方法：采用最大限量法進行急性毒性實驗；通過微生物回復(fù)突變實驗(Ames實驗)和小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗考察其致突變性；通過小鼠精原細胞染色體畸變實驗和小鼠精子畸形實驗考察其生殖毒性；通過大鼠30d喂養(yǎng)實驗進行體質(zhì)量、進食量、血液和生化等指標測定。結(jié)果：灰樹花菌絲體β-葡聚糖小鼠急性毒性實驗LD50大于20g/kg bw；灰樹花菌絲體β-葡聚糖對鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株的回復(fù)突變實驗結(jié)果為陰性；無致小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核作用，無致小鼠精原細胞染色體畸變作用，也無致小鼠精子畸形作用；大鼠30d 喂養(yǎng)實驗期內(nèi)，與對照組相比，體質(zhì)量、食物利用率、血常規(guī)、血液生化、臟器系數(shù)等各項指標均無顯著差異(P＞0.05)，各實驗組大鼠生長發(fā)育良好。結(jié)論：灰樹花菌株GF-932發(fā)酵菌絲體β-葡聚糖屬實際無毒物質(zhì)，無遺傳毒性作用，對動物的生長發(fā)育無不良影響。

灰樹花；β-葡聚糖；急性毒性實驗；遺傳毒性

Abstract：Objective:To evaluate the food safety ofβ-glucan from the fermented mycelia ofGrifola frondosastrain GF-932.Methods:Maximum limited amount method was used for the evaluation of acute toxicity. Microorganism reverse mutation test(Ames test) and mouse bone marrow cell micronucleus test were used to explore mutagenesis. Mouse spermatogonium chromosomal aberration test and sperm malformation test were used to assess reproductive toxicity. After 30-day feeding, rat body weight,food intake, blood cell and biochemical index were determined. Results:according to acute toxicity test, the LD50 ofβ-glucan from fermented the mycelia ofGrifola frondosawas more than 20 g/kg bw. Negative results were observed in Ames test and mouse bone marrow cell micronucleus test and spermatogonium chromosomal aberration test and sperm malformation test. Through 30-day feeding, the growth and development status of rats was improved. Compared with the control group, body weight, food utilization rate, organ-weight ratio, hematology and serum biochemical indices in rats fed the polysaccharide fromGrifola frondosaat different dosages did not exhibited an obvious difference (P> 0.05). Conclusion:β-glucan fromGrifola frondosais nontoxic and has no genetic toxicity. It does not have any negative effect on the growth and development status of animals.

Key words：Grifola frondosa；β-glucan；acute toxicity test；genetic toxicity

灰樹花(Grifola frondosa(Dichs.ex Fr.) S.F.Gray)又名栗子蘑、蓮花菌、貝葉多孔菌、干佛菌、葉奇果菌、云蕈等，在日本稱為舞茸(maitake)[1]。研究證明，灰樹花多糖有顯著抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、調(diào)節(jié)血糖和血脂水平、改善脂肪代謝等多種生物活性[2-3]?；覙浠ǖ闹饕πС煞譃槎嗵牵渲衅鹬饕饔玫氖铅?葡聚糖?；覙浠ňz體β-葡聚糖的化學結(jié)構(gòu)為β-1,6/1,3-葡聚糖，即由葡萄糖以β-1,6-糖苷鍵連接形成主鏈，以β-1,3-糖苷鍵連接的葡萄糖支鏈生成的生物大分子[4]?；覙浠ǘ嗵且驯恢瞥啥喾N劑型的保健食品服用[5]，灰樹花藥用口服制劑和注射劑也在研究開發(fā)中。

灰樹花為我國部分地區(qū)的習用食用菌，有長期食用歷史但未發(fā)現(xiàn)有害作用。有關(guān)灰樹花菌絲體β-葡聚糖的毒理和代謝等食用安全性方面的基礎(chǔ)研究很少，尤其是特殊毒性研究還很不系統(tǒng)。本研究主要針對灰樹花菌絲體β-葡聚糖的食品毒理學進行探討，以期為灰樹花菌絲體β-葡聚糖的應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

受試菌株是從野生環(huán)境中的天然菌株分離篩選并經(jīng)過長期馴化得到的，經(jīng)中科院微生物所鑒定為灰樹花(Grifola frondosa(Dichs.ex Fr.) S.F.Gray)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.1709[6]。

受試物灰樹花β-葡聚糖為白色粉末，由灰樹花發(fā)酵菌絲體提取純化獲得，含量為30%，由山東仁和生物有限公司提供，批號為：20060802。推薦日用量200mg。

清潔級昆明種小鼠：7～12周齡，體質(zhì)量25～30g；清潔級Wistar大鼠：體質(zhì)量50～70g。均由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所動物繁育場提供(許可證號：SCXK 11-00-0006)。實驗動物使用許可證號：SYXK(魯)20030006。

多氯聯(lián)苯、瘧的平、正定霉素、疊氮鈉、絲裂霉素、二氨基芴(2,7-diaminofluorene，2-AF)均為國產(chǎn)醫(yī)藥級。

HY318全自動血細胞分析儀 法國Celly公司；HITACHI 7180全自動生化分析儀 日本日立公司；DMLB顯微鏡 徠卡公司；DYML-S50A高壓滅菌器 北京勤誠盛達科學儀器有限公司；FA2104電子天平 上海上天精密儀器有限公司；載玻片、血細胞計數(shù)板、勻漿器、容量瓶、冰箱、培養(yǎng)皿、注射器、解剖剪、鑷子。

1.2 方法

參照GB/T 15193—2003《食品安全性毒理評價程序和方法》[7]進行。

1.2.1 急性毒性實驗

采用最大限量法。選擇雌雄小鼠各10只，體質(zhì)量18～22g。受試物劑量為20g/kg bw，分兩次灌胃給予受試物，每次灌胃0.2mL/10g bw，間隔4h，記錄動物的中毒表現(xiàn)及死亡情況，連續(xù)觀察14d。

1.2.2 遺傳毒性實驗

微生物回復(fù)突變實驗(Ames實驗，平板滲入法)、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗、精原細胞染色體畸變實驗與小鼠精子畸形實驗均按文獻[7-8]進行。各實驗所用陰性對照為滅菌蒸餾水，陽性對照為環(huán)磷酰胺(40mg/kg bw)。

按照《食品安全性毒理評價程序和方法》的要求，Ames實驗受試樣品的毒性由預(yù)實驗獲得，需設(shè)置5個劑量，且最高劑量為5mg/皿；骨髓嗜多染紅細胞微核實驗受試樣品劑量一般取LD50的1/5、1/10、1/20三個劑量，LD50大于5g/kg bw時，最高劑量取5g/kg bw；結(jié)合急性毒性實驗和微核實驗的結(jié)果，精原細胞染色體畸變實驗與小鼠精子畸形實驗的最高劑量設(shè)置為2g/kg bw，按照等比級數(shù)向下設(shè)置中劑量和低劑量，分別為1g/kg bw和0.5g/kg bw。

1.2.3 大鼠30d喂養(yǎng)實驗

選用體質(zhì)量50～70g的斷乳大鼠80只，隨機分成4組，每組20只，雌雄各半。根據(jù)人體推薦劑量設(shè)立3個實驗組，受試物劑量分別為0.1、0.2、0.4g/kg bw(分別相當于人用推薦劑量的30、60、120倍)，將受試物摻入飼料中，按照動物體質(zhì)量的10%計算食物攝入量(即受試物質(zhì)量占食物質(zhì)量的0.1%、0.2%、0.4%)飼喂實驗動物。對照組大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料。單籠喂養(yǎng)，自由飲食，每周稱質(zhì)量，記錄飼料加入量、剩余量。進食量為加入食物量和食物剩余量的差值，食物利用率=一定時間內(nèi)動物體質(zhì)量的增加量/一定時間內(nèi)動物的進食量。連續(xù)觀察30d。第30天按照參考文獻[7]進行血像、生化指標、臟器系數(shù)等指標測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性實驗結(jié)果

灌胃給予受試物后，雌、雄小鼠均未出現(xiàn)中毒癥狀，14d內(nèi)實驗小鼠無死亡。即該受試物對雌、雄小鼠的急性毒性LD50均大于20g/kg bw。根據(jù)急性毒性分級標準，該受試物屬實際無毒物質(zhì)。

2.2 遺傳毒性實驗結(jié)果

2.2.1 Ames實驗結(jié)果

受試物各劑量組的回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，也不呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。說明在加與不加S-9時，該樣品對4株鼠傷寒沙門氏菌實驗株TA97、TA98、TA100、TA102均未呈現(xiàn)遺傳毒性，即微生物回復(fù)突變實驗結(jié)果為陰性(表1)。

2.2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗

經(jīng)Poisson分布檢驗結(jié)果表明，受試物各劑量組與陰性對照組小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率無顯著性差異(P＞0.05)，而陽性對照組與陰性對照組小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率有極顯著性差異(P＜0.01)，說明該受試物無致小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核作用，小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗結(jié)果為陰性(表2)。

表1 灰樹花β-葡聚糖對微生物回復(fù)突變的影響(Ames實驗)Table 1 Results of Ames test ofβ-glucan from fermented mycelia ofGrifola frondosa CFU

表2 灰樹花β-葡聚糖對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率的影響(n=5)Table 2 Results of mouse bone marrow cell micronucleus test ofβ-glucan from fermented mycelia ofGrifola frondosa(n=5)

2.2.3 小鼠精原細胞染色體畸變實驗與小鼠精子畸形實驗

由表3可見，受試物各劑量組與陰性對照組小鼠精原細胞染色體畸變率相比無顯著性差異(P＞0.05)，而陽性對照組與陰性對照組小鼠精原細胞染色體畸變率有極顯著性差異(P＜0.01)，說明該受試物無致小鼠精原細胞染色體畸變作用，小鼠精原細胞染色體畸變實驗結(jié)果為陰性。受試物各劑量組與陰性對照組的小鼠精子畸形率相比無顯著性差異(P＞0.05)，而環(huán)磷酰胺陽性對照組小鼠與陰性對照組的小鼠精子畸形率有極顯著性差異(P＜0.01)，該受試物無致小鼠精子畸形作用，小鼠精子畸形實驗結(jié)果為陰性。

2.3 大鼠30d喂養(yǎng)實驗

2.3.1 動物的體質(zhì)量和食物利用率

表3 灰樹花β-葡聚糖對小鼠精原細胞染色體畸變和精子畸形的影響Table 3 Results of mouse spermatogonium chromosomal aberration test and sperm malformation test ofβ-glucan from fermented mycelia ofGrifola frondosa

表4 灰樹花β-葡聚糖對30d喂養(yǎng)實驗大鼠體質(zhì)量的影響Table 4 Effect of 30-day feeding ofβ-glucan from fermented mycelia ofGrifola frondosaon body weight in Wistar rats

表5 灰樹花β-葡聚糖對30d喂養(yǎng)實驗大鼠食物利用率的影響Table 5 Effect of 30-day feeding ofβ-glucan from fermented mycelia ofGrifola frondosaon food utilization rate in Wistar rats

在大鼠30d喂養(yǎng)實驗中，各試驗組動物均未出現(xiàn)拒食現(xiàn)象，活動正常。由表4、5可知，各實驗組大鼠與對照組大鼠的體質(zhì)量、進食量、食物利用率無顯著性差異(P＞0.05)。

2.3.2 血常規(guī)及生化指標

表6 灰樹花β-葡聚糖對30d喂養(yǎng)實驗大鼠血細胞的影響Table 6 Effect of 30-day feeding ofβ-glucan from fermented mycelia ofGrifola frondosaon blood cells in Wistar rats

從表6、7可知，與對照組比較，各實驗組大鼠血紅蛋白、紅細胞總數(shù)、白細胞總數(shù)及其分類、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌苷、膽固醇、甘油三酯、血糖、總蛋白、白蛋白等指標均無顯著性差異(P＞0.05)。

表7 灰樹花β-葡聚糖對30d喂養(yǎng)實驗?zāi)┢诖笫笱荷笜说挠绊慣able 7 Effect of 30-day feeding ofβ-glucan from fermented mycelia ofGrifola frondosaon serum biochemical indexes in Wistar rats

2.3.3 組織學檢查

大體觀察各實驗組大鼠未發(fā)現(xiàn)異常，解剖時亦未發(fā)現(xiàn)膀胱、肝總管結(jié)石，臟器系數(shù)未見異常(表8)。其他臟器如脾、腎、腸、睪丸、卵巢等均未見明顯異常。與對照組相比未出現(xiàn)有意義的病理改變。

表8 灰樹花β-葡聚糖對30d喂養(yǎng)實驗大鼠臟器質(zhì)量/體質(zhì)量的影響(n=10)Table 8 Effect of 30-day feeding ofβ-glucan from fermented mycelia ofGrifola frondosaon organ/weight ratio in Wistar rats (n=10)

3 討 論

本研究中，小鼠急性毒性實驗結(jié)果表明，受試物灰樹花菌株GF-932發(fā)酵的菌絲體β-葡聚糖LD50大于20g/kg bw。按照WHO化學物質(zhì)的急性毒性分級標準[7]，灰樹花菌株GF-932發(fā)酵的菌絲體β-葡聚糖屬于實際無毒物質(zhì)。在大鼠30d喂養(yǎng)實驗中，各實驗組動物均未出現(xiàn)拒食現(xiàn)象，活動正常；各實驗組大鼠與對照組大鼠的體質(zhì)量、進食量、食物利用率無顯著性差異(P＞0.05)；與對照組比較，各實驗組大鼠血紅蛋白、紅細胞總數(shù)、白細胞總數(shù)及其分類、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌苷、膽固醇、甘油三酯、血糖、總蛋白、白蛋白等指標均無顯著性差異(P＞0.05)；組織學檢查表明，與對照組相比未出現(xiàn)有意義的病理改變。實驗說明灰樹花菌絲體β-葡聚糖對動物的生長發(fā)育無不良影響。

ICH推薦的遺傳毒性實驗標準組合是：一項細菌基因突變實驗；一項哺乳動物細胞染色體損傷細胞遺傳學評價或小鼠淋巴瘤TK檢測體外實驗；一項嚙齒類動物造血細胞染色體損傷實驗；這3個組合符合國際有關(guān)的遺傳毒性實驗標準組合[9]。按照ICH推薦的遺傳毒性實驗標準組合，本研究分別通過微生物回復(fù)突變實驗(Ames實驗)、小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核實驗、小鼠精原細胞染色體畸變實驗、小鼠精子畸形實驗以考察灰樹花菌株GF-932菌絲體β-葡聚糖的致突變性和生殖毒性。結(jié)果表明：灰樹花菌絲體β-葡聚糖無致小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核作用；無致小鼠精原細胞染色體畸變作用；無致小鼠精子畸形作用和對鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株的回復(fù)突變實驗結(jié)果為陰性。即灰樹花菌絲體β-葡聚糖無致突變作用和無遺傳毒性作用。

食品安全性毒理學評價分為4個階段，其中第一階段實驗是急性毒性實驗；第二階段實驗是遺傳毒性實驗、30d喂養(yǎng)實驗和傳統(tǒng)致畸實驗；第三階段實驗是90d喂養(yǎng)實驗和繁殖實驗；第四階段是慢性毒性實驗。以普通食品和藥食同源物質(zhì)為原料生產(chǎn)的保健食品必須進行第一和第二階段的毒理學實驗[7]。本研究中的灰樹花是有長期食用歷史的食用菌，其發(fā)酵菌絲體提取的β-葡聚糖按食品安全性毒理學評價要求，需進行第一和第二階段的毒理學實驗。因此，灰樹花菌株GF-932發(fā)酵菌絲體β-葡聚糖在致突變性、生殖毒性、遺傳毒性、小鼠急性毒性和大鼠30d喂養(yǎng)實驗等方面的研究結(jié)果可以對灰樹花菌株GF-932菌絲體β-葡聚糖進行食品安全性的初步評價。即灰樹花菌絲體β-葡聚糖屬實際無毒物質(zhì)。

本研究中灰樹花菌絲體β-葡聚糖與報道的香菇多糖[10]和靈芝孢子粉[11]都屬于實際無毒物質(zhì)。作為一種具有生物活性的真菌多糖來說，灰樹花菌絲體β-葡聚糖在食品添加劑、保健食品方面具有較高開發(fā)應(yīng)用價值。

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Toxicological Evaluation ofβ-Glucan from Fermented Mycelia ofGrifola frondosa

WANG Bao-qin1，XU Ze-ping2，YANG Chuan-lun2
(1. Key Laboratory for Food Safety of Binzhou, Department of Life Science, Binzhou University, Binzhou 256600, China；2. Shandong Renhe Biological Co. Ltd., Binzhou 256500, China)

TS255.1

A

1002-6630(2010)17-0368-05

2010-02-01

國家重點新產(chǎn)品計劃項目(2007GRC60031)；濱州市應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項目(200705)；濱州學院校內(nèi)重大招標課題

王寶琴(1970—)，女，副教授，博士，研究方向為生物活性物質(zhì)。E-mail：wangbaoqin1999@126.com