灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)

王寶琴，徐澤平，楊傳倫

(1.濱州市食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濱州學(xué)院生命科學(xué)系，山東 濱州 256600；2.山東仁和生物有限公司，山東 濱州 256500)

灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)

王寶琴1，徐澤平2，楊傳倫2

(1.濱州市食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濱州學(xué)院生命科學(xué)系，山東 濱州 256600；2.山東仁和生物有限公司，山東 濱州 256500)

目的：對(duì)灰樹(shù)花菌株GF-932發(fā)酵菌絲體β-葡聚糖的食用安全性進(jìn)行初步研究及評(píng)價(jià)。方法：采用最大限量法進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)；通過(guò)微生物回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)(Ames實(shí)驗(yàn))和小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)考察其致突變性；通過(guò)小鼠精原細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)和小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)考察其生殖毒性；通過(guò)大鼠30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行體質(zhì)量、進(jìn)食量、血液和生化等指標(biāo)測(cè)定。結(jié)果：灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)LD50大于20g/kg bw；灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖對(duì)鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株的回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性；無(wú)致小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核作用，無(wú)致小鼠精原細(xì)胞染色體畸變作用，也無(wú)致小鼠精子畸形作用；大鼠30d 喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，與對(duì)照組相比，體質(zhì)量、食物利用率、血常規(guī)、血液生化、臟器系數(shù)等各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P＞0.05)，各實(shí)驗(yàn)組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育良好。結(jié)論：灰樹(shù)花菌株GF-932發(fā)酵菌絲體β-葡聚糖屬實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)，無(wú)遺傳毒性作用，對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)不良影響。

灰樹(shù)花；β-葡聚糖；急性毒性實(shí)驗(yàn)；遺傳毒性

Abstract：Objective:To evaluate the food safety ofβ-glucan from the fermented mycelia ofGrifola frondosastrain GF-932.Methods:Maximum limited amount method was used for the evaluation of acute toxicity. Microorganism reverse mutation test(Ames test) and mouse bone marrow cell micronucleus test were used to explore mutagenesis. Mouse spermatogonium chromosomal aberration test and sperm malformation test were used to assess reproductive toxicity. After 30-day feeding, rat body weight,food intake, blood cell and biochemical index were determined. Results:according to acute toxicity test, the LD50 ofβ-glucan from fermented the mycelia ofGrifola frondosawas more than 20 g/kg bw. Negative results were observed in Ames test and mouse bone marrow cell micronucleus test and spermatogonium chromosomal aberration test and sperm malformation test. Through 30-day feeding, the growth and development status of rats was improved. Compared with the control group, body weight, food utilization rate, organ-weight ratio, hematology and serum biochemical indices in rats fed the polysaccharide fromGrifola frondosaat different dosages did not exhibited an obvious difference (P> 0.05). Conclusion:β-glucan fromGrifola frondosais nontoxic and has no genetic toxicity. It does not have any negative effect on the growth and development status of animals.

Key words：Grifola frondosa；β-glucan；acute toxicity test；genetic toxicity

灰樹(shù)花(Grifola frondosa(Dichs.ex Fr.) S.F.Gray)又名栗子蘑、蓮花菌、貝葉多孔菌、干佛菌、葉奇果菌、云蕈等，在日本稱為舞茸(maitake)[1]。研究證明，灰樹(shù)花多糖有顯著抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、調(diào)節(jié)血糖和血脂水平、改善脂肪代謝等多種生物活性[2-3]?；覙?shù)花的主要功效成分為多糖，其中起主要作用的是β-葡聚糖。灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)為β-1,6/1,3-葡聚糖，即由葡萄糖以β-1,6-糖苷鍵連接形成主鏈，以β-1,3-糖苷鍵連接的葡萄糖支鏈生成的生物大分子[4]。灰樹(shù)花多糖已被制成多種劑型的保健食品服用[5]，灰樹(shù)花藥用口服制劑和注射劑也在研究開(kāi)發(fā)中。

灰樹(shù)花為我國(guó)部分地區(qū)的習(xí)用食用菌，有長(zhǎng)期食用歷史但未發(fā)現(xiàn)有害作用。有關(guān)灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖的毒理和代謝等食用安全性方面的基礎(chǔ)研究很少，尤其是特殊毒性研究還很不系統(tǒng)。本研究主要針對(duì)灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖的食品毒理學(xué)進(jìn)行探討，以期為灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖的應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

受試菌株是從野生環(huán)境中的天然菌株分離篩選并經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期馴化得到的，經(jīng)中科院微生物所鑒定為灰樹(shù)花(Grifola frondosa(Dichs.ex Fr.) S.F.Gray)，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.1709[6]。

受試物灰樹(shù)花β-葡聚糖為白色粉末，由灰樹(shù)花發(fā)酵菌絲體提取純化獲得，含量為30%，由山東仁和生物有限公司提供，批號(hào)為：20060802。推薦日用量200mg。

清潔級(jí)昆明種小鼠：7～12周齡，體質(zhì)量25～30g；清潔級(jí)Wistar大鼠：體質(zhì)量50～70g。均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物繁育場(chǎng)提供(許可證號(hào)：SCXK 11-00-0006)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(魯)20030006。

多氯聯(lián)苯、瘧的平、正定霉素、疊氮鈉、絲裂霉素、二氨基芴(2,7-diaminofluorene，2-AF)均為國(guó)產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)。

HY318全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀 法國(guó)Celly公司；HITACHI 7180全自動(dòng)生化分析儀 日本日立公司；DMLB顯微鏡 徠卡公司；DYML-S50A高壓滅菌器 北京勤誠(chéng)盛達(dá)科學(xué)儀器有限公司；FA2104電子天平 上海上天精密儀器有限公司；載玻片、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、勻漿器、容量瓶、冰箱、培養(yǎng)皿、注射器、解剖剪、鑷子。

1.2 方法

參照GB/T 15193—2003《食品安全性毒理評(píng)價(jià)程序和方法》[7]進(jìn)行。

1.2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)

采用最大限量法。選擇雌雄小鼠各10只，體質(zhì)量18～22g。受試物劑量為20g/kg bw，分兩次灌胃給予受試物，每次灌胃0.2mL/10g bw，間隔4h，記錄動(dòng)物的中毒表現(xiàn)及死亡情況，連續(xù)觀察14d。

1.2.2 遺傳毒性實(shí)驗(yàn)

微生物回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)(Ames實(shí)驗(yàn)，平板滲入法)、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)、精原細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)與小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)均按文獻(xiàn)[7-8]進(jìn)行。各實(shí)驗(yàn)所用陰性對(duì)照為滅菌蒸餾水，陽(yáng)性對(duì)照為環(huán)磷酰胺(40mg/kg bw)。

按照《食品安全性毒理評(píng)價(jià)程序和方法》的要求，Ames實(shí)驗(yàn)受試樣品的毒性由預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得，需設(shè)置5個(gè)劑量，且最高劑量為5mg/皿；骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)受試樣品劑量一般取LD50的1/5、1/10、1/20三個(gè)劑量，LD50大于5g/kg bw時(shí)，最高劑量取5g/kg bw；結(jié)合急性毒性實(shí)驗(yàn)和微核實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，精原細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)與小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)的最高劑量設(shè)置為2g/kg bw，按照等比級(jí)數(shù)向下設(shè)置中劑量和低劑量，分別為1g/kg bw和0.5g/kg bw。

1.2.3 大鼠30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

選用體質(zhì)量50～70g的斷乳大鼠80只，隨機(jī)分成4組，每組20只，雌雄各半。根據(jù)人體推薦劑量設(shè)立3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，受試物劑量分別為0.1、0.2、0.4g/kg bw(分別相當(dāng)于人用推薦劑量的30、60、120倍)，將受試物摻入飼料中，按照動(dòng)物體質(zhì)量的10%計(jì)算食物攝入量(即受試物質(zhì)量占食物質(zhì)量的0.1%、0.2%、0.4%)飼喂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。對(duì)照組大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料。單籠喂養(yǎng)，自由飲食，每周稱質(zhì)量，記錄飼料加入量、剩余量。進(jìn)食量為加入食物量和食物剩余量的差值，食物利用率=一定時(shí)間內(nèi)動(dòng)物體質(zhì)量的增加量/一定時(shí)間內(nèi)動(dòng)物的進(jìn)食量。連續(xù)觀察30d。第30天按照參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行血像、生化指標(biāo)、臟器系數(shù)等指標(biāo)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

灌胃給予受試物后，雌、雄小鼠均未出現(xiàn)中毒癥狀，14d內(nèi)實(shí)驗(yàn)小鼠無(wú)死亡。即該受試物對(duì)雌、雄小鼠的急性毒性LD50均大于20g/kg bw。根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，該受試物屬實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)。

2.2 遺傳毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果

受試物各劑量組的回變菌落數(shù)均未超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，也不呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。說(shuō)明在加與不加S-9時(shí)，該樣品對(duì)4株鼠傷寒沙門氏菌實(shí)驗(yàn)株TA97、TA98、TA100、TA102均未呈現(xiàn)遺傳毒性，即微生物回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性(表1)。

2.2.2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)

經(jīng)Poisson分布檢驗(yàn)結(jié)果表明，受試物各劑量組與陰性對(duì)照組小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，而陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率有極顯著性差異(P＜0.01)，說(shuō)明該受試物無(wú)致小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核作用，小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性(表2)。

表1 灰樹(shù)花β-葡聚糖對(duì)微生物回復(fù)突變的影響(Ames實(shí)驗(yàn))Table 1 Results of Ames test ofβ-glucan from fermented mycelia ofGrifola frondosa CFU

表2 灰樹(shù)花β-葡聚糖對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的影響(n=5)Table 2 Results of mouse bone marrow cell micronucleus test ofβ-glucan from fermented mycelia ofGrifola frondosa(n=5)

2.2.3 小鼠精原細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)與小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)

由表3可見(jiàn)，受試物各劑量組與陰性對(duì)照組小鼠精原細(xì)胞染色體畸變率相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，而陽(yáng)性對(duì)照組與陰性對(duì)照組小鼠精原細(xì)胞染色體畸變率有極顯著性差異(P＜0.01)，說(shuō)明該受試物無(wú)致小鼠精原細(xì)胞染色體畸變作用，小鼠精原細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。受試物各劑量組與陰性對(duì)照組的小鼠精子畸形率相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，而環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組小鼠與陰性對(duì)照組的小鼠精子畸形率有極顯著性差異(P＜0.01)，該受試物無(wú)致小鼠精子畸形作用，小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。

2.3 大鼠30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

2.3.1 動(dòng)物的體質(zhì)量和食物利用率

表3 灰樹(shù)花β-葡聚糖對(duì)小鼠精原細(xì)胞染色體畸變和精子畸形的影響Table 3 Results of mouse spermatogonium chromosomal aberration test and sperm malformation test ofβ-glucan from fermented mycelia ofGrifola frondosa

表4 灰樹(shù)花β-葡聚糖對(duì)30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量的影響Table 4 Effect of 30-day feeding ofβ-glucan from fermented mycelia ofGrifola frondosaon body weight in Wistar rats

表5 灰樹(shù)花β-葡聚糖對(duì)30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)大鼠食物利用率的影響Table 5 Effect of 30-day feeding ofβ-glucan from fermented mycelia ofGrifola frondosaon food utilization rate in Wistar rats

在大鼠30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，各試驗(yàn)組動(dòng)物均未出現(xiàn)拒食現(xiàn)象，活動(dòng)正常。由表4、5可知，各實(shí)驗(yàn)組大鼠與對(duì)照組大鼠的體質(zhì)量、進(jìn)食量、食物利用率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

2.3.2 血常規(guī)及生化指標(biāo)

表6 灰樹(shù)花β-葡聚糖對(duì)30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)大鼠血細(xì)胞的影響Table 6 Effect of 30-day feeding ofβ-glucan from fermented mycelia ofGrifola frondosaon blood cells in Wistar rats

從表6、7可知，與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組大鼠血紅蛋白、紅細(xì)胞總數(shù)、白細(xì)胞總數(shù)及其分類、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌苷、膽固醇、甘油三酯、血糖、總蛋白、白蛋白等指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

表7 灰樹(shù)花β-葡聚糖對(duì)30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诖笫笱荷笜?biāo)的影響Table 7 Effect of 30-day feeding ofβ-glucan from fermented mycelia ofGrifola frondosaon serum biochemical indexes in Wistar rats

2.3.3 組織學(xué)檢查

大體觀察各實(shí)驗(yàn)組大鼠未發(fā)現(xiàn)異常，解剖時(shí)亦未發(fā)現(xiàn)膀胱、肝總管結(jié)石，臟器系數(shù)未見(jiàn)異常(表8)。其他臟器如脾、腎、腸、睪丸、卵巢等均未見(jiàn)明顯異常。與對(duì)照組相比未出現(xiàn)有意義的病理改變。

表8 灰樹(shù)花β-葡聚糖對(duì)30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)大鼠臟器質(zhì)量/體質(zhì)量的影響(n=10)Table 8 Effect of 30-day feeding ofβ-glucan from fermented mycelia ofGrifola frondosaon organ/weight ratio in Wistar rats (n=10)

3 討 論

本研究中，小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，受試物灰樹(shù)花菌株GF-932發(fā)酵的菌絲體β-葡聚糖LD50大于20g/kg bw。按照WHO化學(xué)物質(zhì)的急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[7]，灰樹(shù)花菌株GF-932發(fā)酵的菌絲體β-葡聚糖屬于實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)。在大鼠30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均未出現(xiàn)拒食現(xiàn)象，活動(dòng)正常；各實(shí)驗(yàn)組大鼠與對(duì)照組大鼠的體質(zhì)量、進(jìn)食量、食物利用率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；與對(duì)照組比較，各實(shí)驗(yàn)組大鼠血紅蛋白、紅細(xì)胞總數(shù)、白細(xì)胞總數(shù)及其分類、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌苷、膽固醇、甘油三酯、血糖、總蛋白、白蛋白等指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；組織學(xué)檢查表明，與對(duì)照組相比未出現(xiàn)有意義的病理改變。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)不良影響。

ICH推薦的遺傳毒性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)組合是：一項(xiàng)細(xì)菌基因突變實(shí)驗(yàn)；一項(xiàng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體損傷細(xì)胞遺傳學(xué)評(píng)價(jià)或小鼠淋巴瘤TK檢測(cè)體外實(shí)驗(yàn)；一項(xiàng)嚙齒類動(dòng)物造血細(xì)胞染色體損傷實(shí)驗(yàn)；這3個(gè)組合符合國(guó)際有關(guān)的遺傳毒性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)組合[9]。按照ICH推薦的遺傳毒性實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)組合，本研究分別通過(guò)微生物回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)(Ames實(shí)驗(yàn))、小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)、小鼠精原細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)、小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)以考察灰樹(shù)花菌株GF-932菌絲體β-葡聚糖的致突變性和生殖毒性。結(jié)果表明：灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖無(wú)致小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核作用；無(wú)致小鼠精原細(xì)胞染色體畸變作用；無(wú)致小鼠精子畸形作用和對(duì)鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株的回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。即灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖無(wú)致突變作用和無(wú)遺傳毒性作用。

食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)分為4個(gè)階段，其中第一階段實(shí)驗(yàn)是急性毒性實(shí)驗(yàn)；第二階段實(shí)驗(yàn)是遺傳毒性實(shí)驗(yàn)、30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和傳統(tǒng)致畸實(shí)驗(yàn)；第三階段實(shí)驗(yàn)是90d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和繁殖實(shí)驗(yàn)；第四階段是慢性毒性實(shí)驗(yàn)。以普通食品和藥食同源物質(zhì)為原料生產(chǎn)的保健食品必須進(jìn)行第一和第二階段的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)[7]。本研究中的灰樹(shù)花是有長(zhǎng)期食用歷史的食用菌，其發(fā)酵菌絲體提取的β-葡聚糖按食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)要求，需進(jìn)行第一和第二階段的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。因此，灰樹(shù)花菌株GF-932發(fā)酵菌絲體β-葡聚糖在致突變性、生殖毒性、遺傳毒性、小鼠急性毒性和大鼠30d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)等方面的研究結(jié)果可以對(duì)灰樹(shù)花菌株GF-932菌絲體β-葡聚糖進(jìn)行食品安全性的初步評(píng)價(jià)。即灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖屬實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)。

本研究中灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖與報(bào)道的香菇多糖[10]和靈芝孢子粉[11]都屬于實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)。作為一種具有生物活性的真菌多糖來(lái)說(shuō)，灰樹(shù)花菌絲體β-葡聚糖在食品添加劑、保健食品方面具有較高開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。

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Toxicological Evaluation ofβ-Glucan from Fermented Mycelia ofGrifola frondosa

WANG Bao-qin1，XU Ze-ping2，YANG Chuan-lun2
(1. Key Laboratory for Food Safety of Binzhou, Department of Life Science, Binzhou University, Binzhou 256600, China；2. Shandong Renhe Biological Co. Ltd., Binzhou 256500, China)

TS255.1

A

1002-6630(2010)17-0368-05

2010-02-01

國(guó)家重點(diǎn)新產(chǎn)品計(jì)劃項(xiàng)目(2007GRC60031)；濱州市應(yīng)用技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(200705)；濱州學(xué)院校內(nèi)重大招標(biāo)課題

王寶琴(1970—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)。E-mail：wangbaoqin1999@126.com