酶膜反應(yīng)器制備的蛋清水解物的營養(yǎng)評價

楊萬根，王衛(wèi)東，孫月娥，王 璋，程云輝

(1.徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410114)

酶膜反應(yīng)器制備的蛋清水解物的營養(yǎng)評價

楊萬根1，王衛(wèi)東1，孫月娥1，王 璋2，程云輝3

(1.徐州工程學(xué)院食品工程學(xué)院，江蘇 徐州 221008；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.長沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410114)

對酶膜反應(yīng)器(EMR)制備的蛋清水解物進(jìn)行營養(yǎng)評價。用配備截留分子質(zhì)量10kD超濾膜的EMR制備并經(jīng)大孔吸附樹脂層析得到精制的蛋清水解物。以天然蛋清為對照物，分析水解物的游離氨基酸組成、相對分子質(zhì)量分布及其氨基酸組成，并根據(jù)氨基酸分析結(jié)果進(jìn)行氨基酸評分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：水解物的游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.386%；水解物中2～4個氨基酸殘基組成的肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約占71%；EMR蛋清水解物所含的必需氨基酸占氨基酸總量的44.8%，氨基酸評分值為113.3，比天然蛋清的氨基酸評分值提高105.6%。該水解物易被人體吸收、營養(yǎng)均衡而價值較高，可廣泛應(yīng)用于營養(yǎng)保健食品中。

酶膜反應(yīng)器(EMR)；蛋清水解物；氨基酸評分；相對分子質(zhì)量分布

Abstract：In this study, the egg white hydrolysates which were prepared using an enzymatic membrane reactor (EMR) equipped with a 10 kD molecular weight cut-off ultra-filtration membrane, and refined by macroporous adsorption resin chromatography were analyzed and evaluated for their nutritional composition. Native egg white was used as the control to analyze their free amino acid composition, relative molecular mass distribution and amino acid composition. Besides, their amino acid scores were determined according to the analytical results of amino acid composition. The results indicated that the free amino acid content of the hydrolysates was 0.386%. The peptides composed of 2 to 4 amino acid residues in the hydrolysates were approximately 71%. The essential amino acids in the hydrolysates represented approximately 44.8% of the total amino acids and their amino acid score was 113.3, which was much higher than that of native egg white (55.1). The hydrolysates were characteristic of fast absorption, balanced nutrition and high healthcare value. As a conclusion, they can be extensively applied in functional food products.

Key words：enzymatic membrane reactor (EMR)；egg white hydrolysate；amino acid score；relative molecular mass distribution

動、植物蛋白經(jīng)過酶水解得到的水解物的分子質(zhì)量降低，溶解性、熱穩(wěn)定性等功能性質(zhì)改善，致敏性降低，易于被人體吸收，并且蛋白水解物還具有抗氧化、降血壓和降血脂等生物活性，使得蛋白水解物在各種營養(yǎng)保健食品中有著廣泛的應(yīng)用前景[1-3]。我國的雞蛋產(chǎn)量排名世界第一位，早在2005年我國的雞蛋產(chǎn)量已經(jīng)占到了世界總產(chǎn)量的40%以上[4]。蛋清是一種蛋白質(zhì)含量約為10.6%的水溶液。在國內(nèi)，蛋黃被大量用做糕點、月餅生產(chǎn)的原料，而蛋清常常作為廢棄物被丟棄，既污染了環(huán)境，又造成寶貴蛋白質(zhì)資源的極大浪費(fèi)。以蛋清蛋白為原料開發(fā)蛋白水解物，不僅成本低、附加值高，而且變廢為寶，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值和重要的環(huán)保意義。酶膜反應(yīng)器(EMR)是將膜過濾和酶催化反應(yīng)結(jié)合在一起的系統(tǒng)，可以連續(xù)制備小分子蛋白質(zhì)水解物，具有節(jié)約用酶成本、產(chǎn)品品質(zhì)均一等優(yōu)點，已被應(yīng)用于制備各種來源的蛋白質(zhì)水解物[5-6]。本實驗采用酶膜反應(yīng)器制備蛋清水解物，對水解物進(jìn)行營養(yǎng)評價，以期為該制備方法得到的蛋清水解物的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凍干蛋清粉(自制)：購自當(dāng)?shù)厥袌龅男迈r雞蛋，分離得蛋清，冷凍干燥，研磨成粉，在－18℃保存。

Protease N“Amano”蛋白酶 Amano酶制劑公司；乙腈(色譜純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DA201-C大孔吸附樹脂 江蘇蘇青水處理工程集團(tuán)；分子質(zhì)量校正曲線所用標(biāo)準(zhǔn)品(細(xì)胞色素C，抑肽酶、桿菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸) Sigma公司；其他化學(xué)試劑為化學(xué)純。

1.2 儀器與設(shè)備

超濾系統(tǒng)(包括PelliconTM-2 Mini膜夾具、BiomaxTM10聚醚砜超濾膜膜包(截留面積0.1m2，截留分子質(zhì)量10kD)、Millipore蠕動泵) 美國Millipore公司；501型超級恒溫器 上海實驗儀器廠有限公司；77585-306L落地式凍干機(jī) 美國Labconco公司；JB300-D型強(qiáng)力電動攪拌機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；Agilent 1100安捷倫液相色譜儀 美國安捷倫公司；夾套玻璃反應(yīng)器 無錫湖景玻璃儀器商店。

1.3 方法

1.3.1 水解物的制備

配制2L 1g/100mL蛋清溶液、pH10的蛋清溶液，迅速升溫至85℃并恒溫30min，完成蛋清的預(yù)處理[7]；將處理好的1L蛋清溶液轉(zhuǎn)入EMR反應(yīng)器中，用強(qiáng)力攪拌機(jī)在500r/min速度下攪拌，使蛋清溶液在55℃恒定。其余蛋清溶液作補(bǔ)液，在60℃恒溫水浴鍋中保溫。調(diào)節(jié)反應(yīng)器中的蛋清溶液至pH8，加入1%(以蛋清蛋白計)的Protease N蛋白酶開始水解。在水解初始0.5h內(nèi)，關(guān)閉超濾裝置，使反應(yīng)在反應(yīng)器中進(jìn)行。0.5h后開啟超濾裝置，濾過液流速為10mL/min，收集濃縮液。進(jìn)樣壓力設(shè)定在0.13～0.15MPa；水解過程中添加蛋清補(bǔ)液使反應(yīng)液體積不變，并滴加1mol/L的NaOH溶液使反應(yīng)液pH值恒定；反應(yīng)4 h后，終止反應(yīng)。

1.3.2 水解物的精制

用DA201-C大孔吸附樹脂吸附濃縮液，以去離子水洗脫樹脂，再用85%酒精洗脫樹脂得到水解物溶液，濃縮后冷凍干燥得到精制水解物。

1.3.3 氨基酸組成分析

精確稱取精制水解物，溶于6mol/L鹽酸中，110℃水解24h，蒸干鹽酸，定容得水解液。采用高效液相分析儀測定水解液中的氨基酸組成，實驗重復(fù)兩次，結(jié)果取平均值。高效液相色譜條件：C18柱(4.0 mm×125mm)；柱溫40℃；流速1.0mL/min；檢測波長338nm和262nm(Pro)；流動相A：20mmol/L醋酸鈉液，流動相B：20mmol/L醋酸鈉液、甲醇、乙腈體積比為1:2:2。

1.3.4 游離氨基酸組成分析

精確稱取1g樣品，溶解在10mL 6g/100mL的三氯乙酸溶液中，在室溫下靜置1h，然后轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，定容。用濾紙過濾兩次后，取1mL在1.0×104×g條件下離心10min。上清液經(jīng)在線自動衍生化用Agilent 1100高效液相色譜分析儀測定水解液中氨基酸組成。實驗重復(fù)兩次，結(jié)果取平均值。

1.3.5 分子質(zhì)量分布分析

0.1 g/mL樣品溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后上TSK gel 2000色譜柱，將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入校正曲線方程中進(jìn)行計算，得到樣品的肽分子質(zhì)量及其分布范圍。高效液相色譜儀條件：色譜柱TSK gel 2000(7.8mm×300mm)，柱溫30℃，流速0.5mL/min，檢測波長220nm，流動相：乙腈、水、三氟乙酸體積為45:55:0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基酸組成

表1顯示，水解物中游離氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.386%，其中亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸等游離氨基酸的含量較高。Cheison等[8]在研究EMR酶法制備乳清蛋白水解物時，其水解物的游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)一樣較低，僅為2.64%。EMR酶法制備得到的水解產(chǎn)物中游離氨基酸數(shù)量較少，一方面是因為Protease N蛋白酶是一種內(nèi)切酶，水解產(chǎn)物主要為活性肽[9]；另一重要方面是因為小肽能及時地經(jīng)超濾膜從酶反應(yīng)體系中排出，防止了小肽被蛋白酶進(jìn)一步水解成游離氨基酸。

2.2 分子質(zhì)量分布

如表2所示，峰1、峰2、峰3組分的分子質(zhì)量范圍在953～5909D之間，質(zhì)量分?jǐn)?shù)占10.57%，說明產(chǎn)物主要是由含量接近90%、分子質(zhì)量在1000D以下的肽組成。由于產(chǎn)物的平均氨基酸相對分子質(zhì)量為132.75(由表3中產(chǎn)物的氨基酸組成計算而得)，因此峰4組分是由含4～8個氨基酸殘基的肽組成，峰5組分是由含3～4個氨基酸殘基的肽組成，峰6組分是由含2～3個氨基酸殘基的肽組成，而峰7組分則主要由游離氨基酸組成。Cheison等[8]報道，EMR酶法制備的乳清蛋白水解物中，分子質(zhì)量在1250D以下的肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約80%，在本實驗中，蛋清水解物中1000D以下的肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了86%以上，產(chǎn)物中含2～4個氨基酸殘基的肽的含量在71%左右，因此水解物主要是由小肽組成。有研究證明，小肽的吸收具有速度快、耗能低、載體不易飽和，且各肽之間運(yùn)轉(zhuǎn)無競爭性與抑制性等優(yōu)點[10]。

表1 蛋清水解物的游離氨基酸組成Table 1 Free amino acid composition of the egg white hydrolysates

表2 EMR蛋清水解物的分子質(zhì)量分布及質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 2 Molecular mass distribution of the egg white hydrolysates

2.3 氨基酸組成

以天然蛋清為對照物，EMR蛋清水解物的氨基酸組成的測定結(jié)果如表3所示，兩者除了甘氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸3種氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有較大差別外，其他氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差不大。表4顯示水解物及天然蛋清的必需氨基酸占全部氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是44.8%和44.6%，蛋清水解物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比天然蛋清稍高，但兩者相差不大，說明水解后蛋清中必需氨基酸的數(shù)量增加，但增加的幅度不大。水解物的必需氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過FAO/WHO 模式[11]中必需氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)35%，說明它是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源。

表3 天然蛋清及蛋清水解物的氨基酸組成Table 3 Amino acid compositions of the egg white hydrolysates and native egg white

表4 天然蛋清及蛋清水解物的必需氨基酸組成Table 4 Essential amino acid composition of native egg white and the egg white hydrolysates

2.4 氨基酸評分

以1973年FAO/WHO組織提出的氨基酸模式[11]對產(chǎn)物進(jìn)行必需氨基酸評分，結(jié)果如表5所示。天然蛋清的氨基酸評分值為55.1，而蛋清水解產(chǎn)物的氨基酸評分值為113.3，后者比前者提高了105.6%，此結(jié)果表明EMR酶解方法制備的水解物的氨基酸組成更加平衡。

天然蛋清和蛋清水解物的必需氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相差不大，而它們的氨基酸評分值相差較大，是因為：由于蛋白酶酶切位點的特異性，蛋白酶水解蛋清蛋白時使帶有必需氨基酸(如蛋氨酸和半胱氨酸)的小肽從酶膜反應(yīng)系統(tǒng)中分離出，使水解物中蛋氨酸和半胱氨酸的含量增加，從而導(dǎo)致水解物的氨基酸組成更均衡，氨基酸評分值提高。

表5 天然蛋清和蛋清水解物的氨基酸評分Table 5 Amino acid scores of native egg white and the egg white hydrolysates

陳麗花等[12]在評價中國對蝦蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值時發(fā)現(xiàn)，對蝦肉蛋白質(zhì)的氨基酸評分值為105。張趙英等[13]對大米蛋白和乳清蛋白進(jìn)行氨基酸評分，結(jié)果分別為66和62；將兩者復(fù)配后，復(fù)合米蛋白營養(yǎng)粉的氨基酸評分值提高，但只達(dá)到73。趙江等[14]對乳清濃縮蛋白和大豆分離蛋白進(jìn)行氨基酸評分，它們的氨基酸評分值分別是66.3和48.3，兩者復(fù)配后蛋白的氨基酸評分為71.4。由此可見，EMR酶法制備的蛋清水解物的氨基酸評分值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高過其他蛋白粉或復(fù)配蛋白粉。因此，EMR酶法生產(chǎn)的蛋清水解物具有氨基酸組成平衡、富含小肽的特點，在開發(fā)適合胃腸道吸收障礙病人的營養(yǎng)保健品中有著廣闊的應(yīng)用前景。

3 結(jié) 論

本實驗對EMR酶法制備得到的蛋清水解物進(jìn)行營養(yǎng)評價，發(fā)現(xiàn)該水解物的游離氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.386%，含2～4個氨基酸殘基的肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)占到近71%，水解物主要由小肽組成。通過氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，EMR蛋清水解物所含的必需氨基酸占到氨基酸總量的44.8%，水解物的氨基酸評分值為113.3，比天然蛋清的氨基酸評分值提高了105.6%。該水解物易被人體吸收、氨基酸組成均衡，具有較高的營養(yǎng)價值，可廣泛應(yīng)用于營養(yǎng)保健食品生產(chǎn)中。

[1] 李妍, 遲玉杰. 蛋清蛋白多肽營養(yǎng)飲料的研制[J]. 食品工業(yè), 2003,24(2):27-28.

[2] KONHG Xing zhen, ZHOU Huiming, QIAN Haifeng. Enzymatic preparation and functional properties of wheat gluten hydrolysates[J]. Food Chem, 2007, 101(2):615-620.

[3] HARTMANN R, MEISEL H. Food-derived peptides with biological activity:from research to food applications[J]. Curr Opin Biotech, 2007,18(2):163-169.

[4] 于萍. 中國蛋業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展趨勢研究[J]. 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)問題, 2007(10):66-73.

[5] PRATA-VIDAL M, BOUHALLAB S, HENRY G, et al. An experimental study of caseinomacropeptide hydrolysis by trypsin in a continuous membrane reactor[J]. Biochem Eng J, 2001, 8(3):195-202.

[6] PRIETO A C, GUADIX A, GONZALEZ-TELLO P, et al. A cyclic batch membrane reactor for the hydrolysis of whey protein[J]. J Food Eng,2007, 78(1):257-265.

[7] 楊萬根, 王璋, 許時嬰. 蛋清酶解前的變性條件研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2007, 28(2):123-125.

[8] CHEISON S C, WANG Zhang, XU Shinying. Preparation of whey protein hydrolysates using a single- and two-stage enzymatic membrane reactor and their immunological and antioxidant properties:Characterization by multivariate data analysis[J]. J Agric Food Chem, 2007, 55(10):3896-3904.

[9] CHEISON S C, WANG Zhang, XU Shiying. Multivariate strategy in screening of enzymes to be used for whey protein hydrolysis in an enzymatic membrane reactor[J]. Int Dairy J, 2007, 17(4):393-402.

[10] 朱仁書, 晉佳路, 李炳憲. 小肽的分離方法及其腸道吸收研究進(jìn)展[J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2007(12):891-893.

[11] World Health Organization. Energy and protein requirements:report of a Joint FAO/WHO Ad Hoc Expert Committee (Technical report series No.522)[R]. Geneva:FAO/WHO, 1973:523.

[12] 陳麗花, 肖作兵, 周培根. 中國對蝦蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值評價[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報, 2009, 18(1):88-93.

[13] 張趙英, 王立, 葛娜, 等. 復(fù)合大米蛋白質(zhì)粉的研究開發(fā)[J]. 糧食與飼料工業(yè), 2006(12):22-23.

[14] 趙江, 張澤生, 王浩, 等. 蛋白粉中乳清濃縮蛋白(WPC)和大豆分離蛋白(SPI)的蛋白質(zhì)復(fù)配及其營養(yǎng)價值評價[C]//中國糧油學(xué)會第五屆學(xué)術(shù)年會論文集. 北京, 2008:347-350.

Nutritional Evaluation of Egg White Hydrolysates Prepared Using an Enzymatic Membrane Reactor

YANG Wan-gen1，WANG Wei-dong1，SUN Yue-e1，WANG Zhang2，CHENG Yun-hui3
(1. College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China；3. School of Chemical and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China)

TS253.9

A

1002-6630(2010)17-0364-04

2010-01-15

楊萬根(1974—)，男，講師，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：yangwangen08@163.com