外界因素對(duì)重組Enterocin A抗菌活性的影響

趙愛珍，徐興然，韓文瑜

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715；2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130062)

外界因素對(duì)重組Enterocin A抗菌活性的影響

趙愛珍1，徐興然1，韓文瑜2

(1.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶 400715；2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130062)

探討蛋白酶、還原劑、溫度、pH值4個(gè)外界因素對(duì)Enterocin A抗菌活性的影響。對(duì)重組Enterocin A進(jìn)行不同處理后，采用瓊脂孔擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、瓊脂點(diǎn)種實(shí)驗(yàn)或者平板菌落計(jì)數(shù)法檢測樣品的抗李斯特菌活性。結(jié)果表明：重組Enterocin A的蛋白酶消化產(chǎn)物的抗菌活性喪失，其β-巰基乙醇還原產(chǎn)物的抗菌活性也喪失；重組Enterocin A表現(xiàn)較高的熱穩(wěn)定性，100℃處理10min后仍可以檢測到抗菌活性；該重組細(xì)菌素在pH2.0～8.0條件下均保持抗菌活性。

重組Enterocin A；抗李斯特菌活性；外界因素

Abstract：With and without sole exposures to proteases (trypsin and protease K), reductant (2-mercaptoethanol), temperature and pH, recombinant Enterocin A was tested for its anti-ListeriaLIN 3 activity by agar diffusion, agar spot or plate count methods in order to figure out the effects of these external factors on this biological activity. Due to protease hydrolysis, recombinant Enterocin A thoroughly lost its anti-ListeriaLIN 3 activity. The presence ofβ-mercaptoethanol also resulted in a near-complete loss of its anti-ListeriaLIN 3 activity. Recombinant Enterocin A presented high thermal stability. In spite of heating for 10 min at 100 ℃, its anti-ListeriaLIN 3 activity could still be detected. Recombinant Enterocin A could maintain anti-ListeriaLIN 3 activity in the pH range from 2.0 to 8.0.

Key words：recombinant Enterocin A；anti-ListeriaLIN 3 activity；external factors

Enterocin A是屎腸球菌產(chǎn)生的細(xì)菌素之一，表現(xiàn)抗單核細(xì)胞增生李斯特菌等多種李斯特菌及一些乳酸菌的活性，具有作為食品添加劑的內(nèi)在條件[1-3]。除抗菌活性，穩(wěn)定性也是細(xì)菌素作為食品添加劑所需要的條件之一。天然細(xì)菌素產(chǎn)生量少且獲得過程比較復(fù)雜，不利于對(duì)其進(jìn)行廣泛而深入的研究。利用細(xì)菌素的多肽特性，研究人員已通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得了一些具有生物學(xué)活性的重組細(xì)菌素[4-5]。本課題組也成功利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)融合表達(dá)Enterocin A，而且所獲得的重組Enterocin A具有抗李斯特菌活性[6]。該重組Enterocin A不僅比較容易獲得，而且結(jié)構(gòu)與抗菌活性均接近天然Enterocin A。本研究擬探討蛋白酶、還原劑、溫度、pH值4個(gè)外界因素對(duì)該重組Enterocin A抗菌活性的影響，為Enterocin A在食品中的合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、菌種與培養(yǎng)基

重組Enterocin A純化樣品(pH6.5) 本課題組制備[6]；胰蛋白酶、蛋白酶K、β-巰基乙醇(β-ME) 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

無害李斯特菌LIN3(指示菌) 本實(shí)驗(yàn)室保存。

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)按照常規(guī)方法配制。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-6數(shù)控恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；CF16RX型高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司。

1.3 樣品處理

1.3.1 蛋白酶消化

用1mol/L NaOH溶液將重組Enterocin A樣品由pH6.5調(diào)整為pH7.0，分別加入胰蛋白酶、蛋白酶K至終質(zhì)量濃度為0.5mg/mL，37℃水浴2～4h，同時(shí)以未經(jīng)酶處理的樣品作為對(duì)照。

1.3.2 β-巰基乙醇處理

將重組Enterocin A樣品分為兩份，每份1mL：一份加入β-巰基乙醇至終濃度為50mmol/L，另一份不加β-巰基乙醇，37℃水浴10min。LB培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照進(jìn)行同樣的處理。4份樣品分別加入1mL無害李斯特氏菌LIN3懸浮液(約600CFU/mL)，25℃培養(yǎng)1h后，6000r/min、4℃離心10min，將菌體重新懸浮于PBS緩沖液(pH7.0)中。每份樣品設(shè)定3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 熱處理

將重組Enterocin A樣品在不同的溫度(60、80℃和100℃)分別水浴10、30min和60min，立即將熱處理樣品冰浴，同時(shí)以未處理的樣品作為對(duì)照。

1.3.4 pH值調(diào)整

用1mol/L NaOH溶液或者1mol/L HCl溶液調(diào)整重組Enterocin A樣品的pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，同時(shí)以相同pH值的PBS緩沖液作為對(duì)照。

1.4 抗菌活性檢測

通過瓊脂孔擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)[7]檢測蛋白酶消化樣品的抗李斯特菌活性；通過瓊脂點(diǎn)種實(shí)驗(yàn)[8]測定重組Enterocin A的細(xì)菌素活性、熱處理樣品或者不同pH值樣品的抗菌活性；通過平板菌落計(jì)數(shù)法測定培養(yǎng)物中的活菌數(shù)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組Enterocin A的活性定量

圖1 重組Enterocin A的活性測定Fig.1 Anti-ListeriaLIN 3 activity of serial binary dilutions of recombinant Enterocin A

以無害李斯特氏菌LIN3作為指示菌，重組Enterocin A純化樣品的細(xì)菌素活性測定結(jié)果見圖1。1個(gè)細(xì)菌素單位(BU)定義為點(diǎn)種10μL稀釋樣品后能夠形成直徑至少為2mm的明顯抗菌圈的最高稀釋度的倒數(shù)，樣品的細(xì)菌素活性=(1/稀釋度)×100，單位為BU/mL。由圖1可知，稀釋度為1/24的樣品能夠形成明顯抗菌圈，則重組Enterocin A樣品的細(xì)菌素活性為1600BU/mL。

2.2 蛋白酶對(duì)重組Enterocin A抗菌活性的影響

圖2 蛋白酶對(duì)重組Enterocin A抗菌活性的影響Fig.2 Effects of proteases on anti-ListeriaLIN 3 activity of recombinant Enterocin A

經(jīng)胰蛋白酶、蛋白酶K處理2h后，重組Enterocin A的抗菌活性喪失，而未處理樣品的抗菌活性保持不變(圖2)。多肽特性決定了細(xì)菌素的蛋白酶敏感性，天然Enterocin A表現(xiàn)對(duì)多種蛋白酶例如α-胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K敏感[10]。由圖2可知，重組Enterocin A對(duì)胰蛋白酶、蛋白酶K敏感。

2.3 β-巰基乙醇對(duì)重組Enterocin A抗菌活性的影響

表1 β-巰基乙醇對(duì)重組Enterocin A抗菌活性的影響Table 1 Effect ofβ-ME on anti-ListeriaLIN 3 activity of recombinant Enterocin A

由表1可知，在對(duì)照組中，含有LB或者LB＋β-ME的培養(yǎng)物中指示菌活菌數(shù)不變或者稍微升高，表明實(shí)驗(yàn)濃度的β-巰基乙醇對(duì)指示菌不表現(xiàn)抑制作用。在實(shí)驗(yàn)組中，含有重組Enterocin A的培養(yǎng)物中的活菌數(shù)明顯降低；而含有重組Enterocin A＋β-ME的培養(yǎng)物中的活菌數(shù)減少不明顯。該重組Enterocin A為N-端帶有融合標(biāo)簽His-tag的融合多肽，N-端的34個(gè)融合氨基酸中沒有半胱氨酸，C-端Enterocin A部分含有的兩個(gè)半胱氨酸會(huì)形成兩個(gè)二硫鍵。二硫鍵為大多數(shù)細(xì)菌素所有，對(duì)抗菌活性起重要作用[11-12]。還原劑DTT、β-巰基乙醇等具有還原二硫鍵為半胱氨酸的能力。DTT處理的Pediocin PA-1和Enterocin A的抗菌活性明顯降低[12]。Ray等[13]的研究結(jié)果顯示還原劑DTT或者β-巰基乙醇處理的融合蛋白MBP-pediocin AcH的抗菌活性明顯降低。本研究結(jié)果表明β-巰基乙醇能夠還原重組Enterocin A中的二硫鍵，使其抗菌活性喪失。

2.4 溫度對(duì)重組Enterocin A抗菌活性的影響

圖3 溫度對(duì)重組Enterocin A抗菌活性的影響Fig.3 Effect of temperature on anti-ListeriaLIN 3 activity of recombinant Enterocin A

重組Enterocin A具有較高的熱穩(wěn)定性。由圖3可知，在相同的溫度條件下，隨著處理時(shí)間的延長，重組細(xì)菌素的抗菌活性呈下降趨勢；相同的處理時(shí)間，隨著溫度的升高，其抗菌活性明顯降低。結(jié)果還表明，4℃貯存7d對(duì)重組Enterocin A的活性幾乎沒有影響。由于分子質(zhì)量小、二硫鍵等因素，熱穩(wěn)定性為一些細(xì)菌素的共同特點(diǎn)。細(xì)菌素Pediocin pK23-2經(jīng)過121℃處理15min，其抗菌活性保持不變[14]。但是熱穩(wěn)定性受pH值等其他因素的影響。細(xì)菌素Piscicolin 126樣品為pH2.0或pH3.0時(shí)，100℃處理120min不會(huì)影響其抗菌活性，而調(diào)整至pH4.0或pH5.0時(shí)，100℃處理15min即可導(dǎo)致50%的活性喪失[15]。

2.5 pH值對(duì)重組Enterocin A抗菌活性的影響

圖4為pH2.0～9.0時(shí)的重組Enterocin A的抗菌結(jié)果。表明pH2.0～9.0的PBS緩沖液均不表現(xiàn)抗李斯特菌活性。依據(jù)陽性判定標(biāo)準(zhǔn)[8]，該重組細(xì)菌素在pH2.0～8.0時(shí)均具有抗李斯特菌活性，在pH9.0時(shí)不表現(xiàn)抗菌活性。大多數(shù)細(xì)菌素通常在酸性環(huán)境中很穩(wěn)定。Rodrí guez等[16]發(fā)現(xiàn)在pH4.0～6.0時(shí)，細(xì)菌素Pediocin PA-1于15℃貯存21d后仍非常穩(wěn)定，但是調(diào)整溶液至pH7.0時(shí)，50%的細(xì)菌素活性喪失。

圖4 pH值對(duì)重組Enterocin A抗菌活性的影響Fig.4 Effect of pH on anti-ListeriaLIN 3 activity of recombinant Enterocin A

3 結(jié) 論

重組Enterocin A表現(xiàn)蛋白酶敏感性，胰蛋白酶、蛋白酶K均可使其抗李斯特菌活性喪失。β-巰基乙醇能夠還原重組細(xì)菌素中的二硫鍵，使其抗菌活性喪失，間接證明了二硫鍵為Enterocin A的內(nèi)在活性因素。重組Enterocin A在pH6.5時(shí)具有較高的熱穩(wěn)定性，60℃處理60min、80℃處理30min、100℃處理10min后仍保持抗菌活性。因此，在進(jìn)行Enterocin A分子設(shè)計(jì)時(shí)，可以考慮在其N-端增加適合長度的氨基酸序列，使其既具有一定程度的蛋白酶耐受水平，又可以保持較高的熱穩(wěn)定性。在選用的8種pH值條件下，重組Enterocin A在pH2.0～8.0時(shí)均表現(xiàn)抗菌活性，在pH9.0時(shí)不表現(xiàn)抗菌活性，這表明該重組細(xì)菌素在低pH值下具有穩(wěn)定性。

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Effects of External Factors on Anti-ListeriaLIN 3 Activity of Recombinant Enterocin A

ZHAO Ai-zhen1，XU Xing-ran1，HAN Wen-yu2
(1. College of Pharmaceutical Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062, China)

TS201.3

A

1002-6630(2010)17-0327-04

2010-06-04

趙愛珍(1972—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槿樗峋?xì)菌素的抗菌活性。E-mail：zaoaizhen@yahoo.com.cn