基于表位預測的花生過敏原Arah6免疫交叉反應性研究

朱 盼，陳紅兵,*，胡純秋，李 欣，羅春萍,3

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學環(huán)境與化學工程學院，江西 南昌 330047 )

基于表位預測的花生過敏原Arah6免疫交叉反應性研究

朱 盼1,2，陳紅兵1,2,*，胡純秋1,2，李 欣1,2，羅春萍1,2,3

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學環(huán)境與化學工程學院，江西 南昌 330047 )

為了探討花生過敏原Arah6與其他同源蛋白之間的交叉反應，通過各種生物信息數(shù)據庫(Genbank，DiscoTope)以及網絡工具及軟件(BLAST，NPS@和Protean，Clustal x，PyMOL)，開展基于表位預測的Arah6交叉免疫反應性研究。結果表明：肽段AA10～15、45～48、53～60、116～118區(qū)域可能是Arah6的線性表位優(yōu)勢區(qū)域；Arah6的構象型表位優(yōu)勢區(qū)有4個，它們存在的區(qū)域為AA1～13、35～51、53～59、89～105；基于線性表位預測的15種蛋白質與Arah6可能具有交叉反應性，其中4種(Arai6，conglutin，Arad6和conglutin 8)發(fā)生交叉反應的概率為100%；基于構象型表位預測的17種蛋白質與Arah6可能具有交叉反應性，其中4種(Ara i 6，conglutin，Arad6和conglutin 8)發(fā)生交叉反應的概率為100%。本結果對進一步了解Arah6的過敏性以及指導開展食品中Arah6的免疫學檢測具有重要作用。

Arah6；花生過敏；表位；交叉反應；預測

Abstract：In order to explain cross-reactivity between peanut allergen Arah6 and other homologous proteins, various kinds of bioinformationcal databases, including Genbank and DiscoTope, and net tools/software, including BLAST, NPS@, Protean,Clustal x and PyMOL, were used for the epitope analysis between these proteins. It was indicated that the linear epitopes on Arah6 existed with high probability in the regions of AA10－15, 45－48, 53－60 and 116－118, and the conformational epitopes in the regions of AA1－13, 35－51, 53－59 and 89－105. According to the prediction of linear epitopes, there were fifteen proteins might cross-react with Arah6, and the possibility of cross-reactivity of four of them (Ara i 6, conglutin, Ara d 6 and conglutin 8) was 100%. However, according to the prediction of conformational epitopes, the number of proteins could cross-react with Arah6 with high probability was 17, and the possibility of cross-reactivity of four of them (Ara i 6, conglutin,Ara d 6 and conglutin 8) was 100%. These investigations will be beneficial for understanding peanut Arah6 allergy and help to develop an approach for the immunologic detection of Arah6 in foods in the future.

Key words：Arah6；peanut allergy；epitopes；cross-reactivity；prediction

花生廣泛存在于各類食品中，花生過敏是一類較普遍的食物過敏反應[1]，食品中極少量的花生過敏原便會產生嚴重的變態(tài)反應，有時可引起過敏性休克并危及生命，嚴重影響了部分過敏人群的生活質量[2]。目前國際免疫聯(lián)合會命名小組委員會認可的花生過敏原有11種[3]，其中，Arah6是一種主要的過敏原，屬于2S白蛋白家族，與花生中另一主要過敏原Arah 2的氨基酸序列有59%的同源性[4]。另外，抗原表位是免疫交叉反應的物質基礎[5]，可分為線性表位和構象型表位。線性表位由肽鏈上連續(xù)的5～7個氨基酸組成[6]，主要識別過敏原中特定的氨基酸序列。目前公認，在氨基酸數(shù)目超過80的蛋白質中，若序列同源性大于30%或有6個連續(xù)相同的氨基酸序列，則認為蛋白之間可能存在交叉反應[7]。構象型表位則是由蛋白中不連續(xù)氨基酸序列通過折疊等方式形成特定的三維空間結構而發(fā)生作用，占抗原表位中的90%[8-9]。通過蛋白質序列同源性和軟件分析，利用已知蛋白三維結構模擬未知蛋白三維結構[8]，經對比分析，可以預測具有相同/相似構象結構蛋白的交叉反應性。

迄今為止，蛋白質的結構包括表位的預測使用了很多生物信息庫和軟件。如，GenBank數(shù)據庫是世界上著名的生物信息數(shù)據庫，是由美國國立生物技術信息中心(NCBI)維護的一級核酸序列數(shù)據庫[10]，其中的BLAST工具主要用于序列對比和同源性分析。蛋白質結構數(shù)據庫(PDB)是目前最主要的蛋白質分子結構數(shù)據庫之一，其包含了大量的抗原抗體復合物晶體結構及相關信息[6]。而SWISS- MODEL是一個有注解的基于同源建模的蛋白質結構服務器[11]，可提供蛋白質三維建模服務，任秀艷等[12]用此軟件成功完成了HrpNEa蛋白的結構和功能的預測。另外，DNAStar軟件是一種用于DNA和蛋白質分析的生物軟件，其中Protean主要用于蛋白質結構分析，黎明等[13]采用此軟件成功預測了豬傳染性胃腸炎病毒的二級結構和B細胞抗原表位。ABCpred則采用人工神經網絡來預測線性表位，預測敏感性約為67%，特異性約為64%[6,14]，而且李明才等[15]采用此方案對與預測所得到的人白細胞介素-33蛋白的B細胞抗原表位結果進行最終驗證。值得關注的是，DiscoTope是通過蛋白質三級結構數(shù)據來預測構象表位的一種新功能軟件[16]，紀濱等[17]采用此軟件成功預測了H5N1亞型禽流感HA蛋白抗原的非線性B細胞表位，并通過了實驗鑒定。

本研究利用生物信息學技術，將花生過敏原Arah6進行氨基酸序列分析，預測其二級結構、線性表位、構象型表位，從而預測交叉反應，對進一步了解Arah6的過敏性以及指導開展食品中Arah6的免疫學檢測具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 花生過敏原Arah6DNA序列來源

通過GenBank檢索花生過敏原Arah6的基因序列，該基因在GenBank的登錄號為AAD56337。應用DNAStar軟件推導出該基因的氨基酸序列。

1.2 Arah6氨基酸序列同源性分析

利用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析Arah6氨基酸序列，預測同源性蛋白。

1.3 基于Arah6線性表位的免疫交叉反應預測方案

1.3.1 Arah6蛋白的線性表位預測

利用NPS@網絡服務器(http://npsa-phil.ibcp.fr/ cgibin/npsa_automat.pl? page=/NPSA/npsa_server.html)和DNAStar生物分析軟件(Gamier-Robson方法)中的protean軟件對Arah6蛋白質二級結構進行預測。Protean軟件采用Kyte-Doolittle等方案預測Arah6的親水性(hydrophilicity)[18]，Emini法預測表面可及性(accessibility)[19]，Jameson-Wolf法預測抗原性(antigenicity)[20]，Karplus-Schulz法預測蛋白柔韌性(flexibility)[21]，綜合各因素，預測Arah6可能的線性表位區(qū)。

1.3.2 基于線性表位的免疫交叉反應預測

根據已知的Arah6表位區(qū)，在同源蛋白中，利用軟件Clustalx進行多序列對比分析，查找相同/相似表位區(qū)域，預測可能與目的蛋白發(fā)生交叉反應的蛋白質。

1.4 基于Arah6構象型表位的免疫交叉反應預測方案

1.4.1 Arah6三維結構模擬預測構象型表位

利用網絡數(shù)據庫SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/) 模擬Arah6的PDB構象圖，并在網絡數(shù)據庫DiscoTope[22](http://www.cbs.dtu.dk/services/DiscoTope)中預測其空間構象型表位。

1.4.2 基于構象型表位的交叉反應預測

結合各蛋白的序列，利用網絡數(shù)據庫S W I S SMODEL模擬其PDB構象圖，并在DiscoTope中預測構象型表位，與目的蛋白對比，預測免疫交叉反應。在預測中，通過網絡數(shù)據庫DisoTope是實現(xiàn)蛋白質三維結構預測構象型表位的一種新方法[6]，本工作中選定特異性表位默認閾值－7.7，此時預測的特異性為75%，敏感性為47%。

2 結果與分析

2.1 花生過敏原Arah6的氨基酸序列

根據GenBank中登錄號位AAD56337(Arah6)的DNA序列推導出的氨基酸序列如下：AHASAMRRERGR QGDSSSCERQVDGVNLKPCEQHIMQRIMGEQEQYDSYNFGS TRSSDQQQRCCDELNEMENTQRCMCEALQQIMENQCD GLQDRQMVQHFKRELMNLPQQCNFGAPQRCDLDVSGGRC。

2.2 Arah6氨基酸序列同源性分析

利用GenBank網絡數(shù)據庫對Arah6進行BLAST分析，具體結果見表1。

表1 Arah6的同源序列BALST分析結果Table 1 Homology sequences comparison of Arah6 using BALST

通過BLAST分析得知：能與Arah6發(fā)生交叉反應的蛋白主要來自于不同花生種屬以及大豆、羽扇豆、大麥、黑麥、蓖麻等，共34種，見表1。表中1～3號蛋白與目的蛋白的相似度高達90%以上，且4～17號蛋白的相似度均在40%以上，它們均來自于花生，而花生是羽扇豆制品中的主要組成成分，這就大大增加了花生過敏的嚴重性和普遍性。

2.3 基于Arah6線性表位的免疫交叉反應預測結果

2.3.1 Arah6蛋白二級結構和特性分析及其線性表位的預測結果

2.3.1.1 蛋白二級結構和特性分析

用NPS@網絡服務器對該基因的二級結構進行預測，結果如圖1所示，對應相關數(shù)據見表2。

圖1 NPS@預測Arah6二級結構Fig.1 Prediction analysis for secondary structure of Arah6 using NPS@

表2 NPS@預測Arah6二級結構結果Table 2 Location of four secondary structural classes of Arah6 predicted using NPS@

利用Protean軟件對該蛋白的二級結構及蛋白特性再次進行預測，結果如圖2所示，對應相關數(shù)據見表3。

圖2 Protean法預測的Arah6二級結構參數(shù)及蛋白特性Fig.2 Prediction analysis for secondary structure, antigenicity, hydrophilicity,surface prodability and flexibility of Arah6 using Protean appraoch

表3 Protean法預測的Arah6二級結構及相關預測指數(shù)的區(qū)域定位Table 3 Predicted location of four secondary structural classes and regions corresponding to 4 specific indexes of Arah6 using Protean approach

2.3.1.2 預測的Arah6線性表位

通過比較，用網絡服務器NPS@預測得到的結果與Protean軟件預測得到的結果基本相似，具有一定的可行性。當肽段位于β-轉角和無規(guī)則卷曲區(qū)域[23-24]，且親水性＞0，抗原指數(shù)＞0，表面可及性＞1時，即預測為優(yōu)勢B細胞抗原表位[25]；且線性表位至少應由3～5個氨基酸組成。綜合各參數(shù)可推導出Arah6的線性抗原表位優(yōu)勢區(qū)域為AA10～15，45～48，53～60，116～118(圖3深色方框區(qū)域)。

2.3.2 基于線性表位對比的交叉反應預測

利用Clustal X對BLAST分析的結果進行多序列對比分析。結果顯示：與Arah6具有完全相同的線性表位的蛋白質有4種，分別為Ara i 6、落花生conglutin、Ara d 6、conglutin 8(圖3，其余圖略)，它們與目的過敏原蛋白質發(fā)生交叉反應的概率為100%；蔓花生conglutin和2S protein 1擁有2個與目的蛋白完全相同的線性表位；另外，擁有1個完全相同的線性表位的蛋白有9種，分別為表1中序號為7～15的蛋白質，它們多為不同花生亞種、羽扇豆科和大豆中的部分蛋白質，它們在很大程度上與目的蛋白可能發(fā)生交叉反應。

圖3 線性表位(方框標示區(qū)域)對比分析Fig.3 Comparisons of linear epitopes between different proteins

2.4 基于Arah6構象型表位的免疫交叉反應預測結果

2.4.1 預測的Arah6構象型表位區(qū)

利用DiscoTope網絡數(shù)據庫預測得Arah6的構象型表位區(qū)有6個，用PyMOL軟件繪制出來，如圖4(彩色區(qū)域)所示，這6個表位區(qū)域在氨基酸序列中的位置分別為 AA1～13(紅色)、16～17(綠色)、35～51(藍色)、53～59(黃色)、86(紫色)、89～105(青色)。由于 AA16～17、86區(qū)域所含的氨基酸數(shù)目太少，無法構成構象型表位，故應剔除。綜合考慮，Arah6的構象型表位區(qū)只有4個。

圖4 Arah6的空間構象(灰色區(qū)域)和構象性表位區(qū)域(深色區(qū)域)Fig.4 Conformational epitopes on Arah6

2.4.2 基于構象型表位對比預測交叉反應

相同方法分別預測各蛋白質的空間構象型表位所在區(qū)域，并用PyMOL繪圖，與目的蛋白進行對比分析。具有相同或相似的構象，即可發(fā)生交叉反應。

圖5 不同蛋白相同/相似構象型表位對比圖Fig.5 Conformational epitope comparison among different proteins

結果顯示：與Arah6(圖5R)具有相同的構象型表位(青色區(qū)域)的蛋白只有4種，分別為Ara i 6、落花生 conglutin、Ara d 6、conglutin 8(圖 5A～D)，它們與目的過敏原蛋白質發(fā)生交叉免疫反應的概率為100%；與目的蛋白具有相似構象型表位區(qū)域的蛋白有13種，分別為表1中序號分別為5～15(圖5E～O)、17(圖5P)和21(圖5Q)的蛋白，它們在一定程度上也可能與Arah6發(fā)生交叉反應。

3 討 論

近年來，隨著生物信息學的迅速發(fā)展，已有許多分子生物學軟件用于蛋白質的分析，線性表位和構象型表位的預測則是其中主要部分。關于線性表位的預測，目前被認可有效的方法主要包括二級結構方案、親水性方案、可及性方案、可塑性方案、抗原性方案[23,26-27]，但一般采用多種參數(shù)綜合分析的方法。研究表明，在進行抗原線性表位預測時，運用生物信息軟件和互聯(lián)網服務器，采用多種方案綜合分析可提高實驗的成功率，增強實驗的目的性[26,28]。本研究采用Protean軟件和NPS@服務器預測了Arah6的線性表位，并用ABCpred對結果進行了驗證，此法預測所得的B細胞線性表位區(qū)準確率達到73.9%。

由于已知晶體結構的抗原-抗體復合物數(shù)量較少、抗原-抗體結合機理研究不夠清楚以及預測算法設計的困難性等方面原因，構象型表位預測的研究一直比較緩慢，遠遠落后于線性表位預測的研究[29]。但生物信息學軟件DiscTope是目前新開發(fā)出的一種用于預測B細胞構象型表位的Web軟件，它在95%特異度條件下，可正確識別構象型表位中的15.5%的殘基，而普通線性表位預測方法在同等特異度條件下，只能識別約11%的殘基[22]。本研究中采用DiscTope軟件對目的蛋白進行了預測，得到了它的構象型表位分布優(yōu)勢區(qū)域。并通過繪圖軟件PyMOL對各相關蛋白的相關區(qū)域進行對比分析，結果表明擁有相同/相似的構象型表位優(yōu)勢區(qū)域即可與Arah6發(fā)生交叉反應。盡管如此，該結論最好通過抗體篩選噬菌體肽庫等工作來進行實驗驗證[22]。

本研究基于生物信息學和網絡數(shù)據庫，分別從序列同源性分析、線性表位預測對比分析、構象型表位預測對比分析三個不同層次上對Arah6的交叉反應進行了預測。結果顯示：Ara i 6、落花生conglutin、Ara d 6和落花生conglutin 8在序列同源性、線性表位和構象型表位上都與Arah6有很高的相似性，它們與目的蛋白發(fā)生交叉反應的概率為100%；構象型表位相似且線性表位相同的蛋白質，如Ara d 2.01、Arah 2.01、seed storage protein SSP2、白羽扇豆conglutin delta seed storage protein等，它們在理論上也能與目的蛋白發(fā)生交叉反應。另外，線性表位相同而構象型表位不同的蛋白也可能與目的蛋白發(fā)生交叉反應，如羽扇豆科conglutin delta、大豆napin-type 2S albumin 1、大豆2S albumin pre-propeptide等。

總之，本實驗利用生物信息學方法，結合網絡數(shù)據庫，對花生蛋白質過敏原Arah6的交叉反應性進行了預測，從理論上闡述了Arah6與其他同源蛋白的免疫交叉反應性。

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Immunologic Cross-reactivity of Peanut Allergen Arah6 on the Basis of Epitope Prediction

ZHU Pan1,2，CHEN Hong-bing1,2,*，HU Chun-qiu1,2，LI Xin1,2，LUO Chun-ping1,2,3
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. School of Environmental and Chemical Engineering,Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Q517

A

1002-6630(2010)17-0318-05

2010-06-10

南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室目標導向項目(SKLF-MB-200807)；江西省主要學科學術和技術帶頭人培養(yǎng)項目([2004]234號)；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃項目(NCET-08-07-04)

朱盼(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為食品質量與安全。E-mail：xingmeng903@163.com

*通信作者：陳紅兵(1967—)，男，教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：chbgjy@hotmail.com