發(fā)酵法制備沙光魚多肽及其抗氧化活性

房耀維，余 勃，王淑軍，徐煒楓，劉 姝，呂明生，焦豫良

(1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)檢中心，江蘇 南京 210036)

發(fā)酵法制備沙光魚多肽及其抗氧化活性

房耀維1，余 勃2，王淑軍1，徐煒楓3，劉 姝1，呂明生1，焦豫良1

(1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 連云港 222005；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)檢中心，江蘇 南京 210036)

將米曲霉接種到pH5.0的沙光魚勻漿液中進行發(fā)酵培養(yǎng)，利用米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶水解沙光魚蛋白。研究發(fā)酵過程中蛋白酶的產(chǎn)生及沙光魚蛋白的水解動態(tài)；對發(fā)酵液進行超濾，測定不同截留分子質(zhì)量的發(fā)酵液清除自由基的活性及抗氧化活性。結(jié)果表明：隨著發(fā)酵時間的延長，沙光魚蛋白的水解度和多肽得率不斷增加，多肽的平均鏈長度降低。發(fā)酵48h后，多肽鏈平均長度為14，水解度為26.6%，多肽得率最高達到8.98%，抗氧化能力較強。不同截留分子質(zhì)量的多肽液中，平均肽鏈長度為14個氨基酸殘基的多肽超濾液體外抗氧化能力較強。

沙光魚；米曲霉；多肽；抗氧化活性；發(fā)酵

Production of Polypeptides Derived fromAcanthogobius hastaMuscle by Fermentation and Assessment of Their Antioxidant Activity

FANG Yao-wei1，YU Bo2，WANG Shu-jun1，XU Wei-feng3，LIU Shu1，LU Ming-sheng1，JIAO Yu-liang1

(1. Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, School of Marine Science and Technology, Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005, China；2. Sino-Germen Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. Jiangsu Agro-Product Quality Test Center, Nanjing 210036, China)

Abstract：Aspergillus oryzaeAS3.951 was inoculated intoAcanthogobius hastamuscle homogenate (pH 5.0) and incubated in order to produce proteases to hydrolyze fish proteins. Investigations on protease production kinetics during fermentation and the hydrolysis kinetics ofAcanthogobius hastamuscle proteins were made. The fermentation broth was ultrafiltrated through membranes with molecular weight cut-off (MWCO) and its fractions were measured for their free radical scavenging and antioxidant activities. The results revealed that as fermentation time was prolonged, the degree of hydrolysis ofAcanthogobius hastamuscle proteins and peptide yield gradually increased and the average chain length of ploypeptides decreased. After 48-hour fermentation, the average chain length of polypeptides, degree of hydrolysis, polypeptide yield obtained were 14, 26.6%and 8.98% and the resultant product exhibited a notable antioxidant effect. Among its ultrafiltration fractions, the polypeptides with an average chain length of 14 amino acid residues had the strongest antioxidant effect.

Key words：Acanthogobius hasta；Aspergillus oryzae；polypeptide；antioxidant activity；fermentation

沙光魚(Acanthogobius hasta)又名長身鯊，屬蝦虎魚科，矛尾刺蝦虎魚種，為海水及咸淡水產(chǎn)大型蝦虎魚。分布于太平洋西北部、中國、日本和韓國[1-2]。我國連云港地區(qū)適中的氣候和獨特的地理環(huán)境為沙光魚提供了特有的生長環(huán)境，使得連云港沙光魚肉質(zhì)細(xì)微、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，成為連云港的特產(chǎn)之一，具有很高的開發(fā)利用價值。近年來許多研究表明，蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生易于吸收、溶解性好、乳化性好，并具有多種生理活性的多肽，改善了蛋白質(zhì)的功能特性，提高了蛋白質(zhì)的營養(yǎng)及利用價值[3-4]。全球魚類資源豐富，具有豐富的蛋白。將魚蛋白水解，可以產(chǎn)生具有包括降血壓、抗菌、清除體內(nèi)自由基、抗氧化、降低膽固醇等多種生理活性的活性多肽[5-6]。特別是魚類多肽所具有的清除自由基，防止氧化對生物體細(xì)胞和組織造成破壞的功能，受到廣泛的關(guān)注，成為人們開發(fā)的熱點[7]。

傳統(tǒng)的魚類蛋白水解都是用魚類本身的蛋白酶自然情況下對蛋白進行水解，如制備液體魚蛋白(f i s h silage)。自然水解完成需要的時間較長，而且蛋白的水解過程很難控制，蛋白的水解率降低，只能保持在20%到70%之間[8-9]。利用成品蛋白酶對魚類蛋白進行水解，水解過程可以控制，水解時間短，容易獲得濃度和純度較高、溶解性好、穩(wěn)定的多肽溶液[10]。但是，運用蛋白酶對魚類蛋白進行水解，蛋白酶制劑的成本較高。目前，運用蛋白酶水解魚類蛋白的研究大多只限于實驗室研究。如果利用安全的微生物菌株產(chǎn)生的蛋白酶代替商品酶制劑對魚類蛋白進行發(fā)酵，可以大大降低多肽的生產(chǎn)成本，利于魚類多肽的工業(yè)化生產(chǎn)。

本實驗以連云港特產(chǎn)魚類——沙光魚為原料，以米曲霉為發(fā)酵菌株，經(jīng)發(fā)酵制備沙光魚多肽。并對沙光魚多肽進行初步純化，對不同分子質(zhì)量范圍內(nèi)多肽的抗氧化性進行評價，為抗氧化沙光魚多肽的制備和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

沙光魚(Acanthogobius hasta)，于10月份在連云港新浦區(qū)水產(chǎn)品批發(fā)市場選擇活潑、健康無病害、體長(26±2)cm，體質(zhì)量(150±30)g沙光魚。

1.2 儀器與設(shè)備

超濾設(shè)備及超濾膜 美國Millipore公司；Synergy 2型全自動多功能酶標(biāo)儀 美國Bio Tek公司；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機 美國Eppendorf公司；DS-1高速組織搗碎機 上海標(biāo)本模型廠。

1.3 菌種與培養(yǎng)基

米曲霉(Aspergillus oryzae，AS3.951) 中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

種子培養(yǎng)基(馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基，PDA)：馬鈴薯200g(切片水煮30min，過濾取汁)、蔗糖20.0g、蒸餾水1000mL，pH值自然。固體培養(yǎng)基另加1.5～2g/100mL的瓊脂。

1.4 方法

1.4.1 種子液的制備

將菌種在PDA斜面培養(yǎng)基上活化，從活化后的菌種保藏斜面上挑取孢子接種至PDA液體培養(yǎng)基，28℃、120r/min培養(yǎng)至菌體濃度達到106CFU/mL。

1.4.2 沙光魚勻漿液的制備

將選好的活魚宰殺，取出魚皮、內(nèi)臟和魚骨，用生理鹽水清洗干凈后，用吸水紙將殘留在肌肉表面的生理鹽水吸干，切成魚塊，用高速組織搗碎機勻漿。勻漿液稀釋到蛋白質(zhì)量濃度5g/100mL后進行巴氏滅菌(60℃，30min)，備用。

1.4.3 勻漿液發(fā)酵

按體積分?jǐn)?shù)5%接種量將發(fā)酵菌株種子液接種于沙光魚勻漿液中，28℃、120r/min培養(yǎng)，分別在不同發(fā)酵時間取樣。將發(fā)酵液于4℃、12000×g離心30min，上清液過0.45μm微孔濾膜，濾液分成兩份，一份冷凍干燥，冷凍保藏備用；另一份用來測定蛋白酶活性。

1.4.4 超濾分離

根據(jù)劉姝等[11]所報道的方法，收集發(fā)酵液，用去離子水配成質(zhì)量濃度為10mg/mL的樣液，分別通過截留分子質(zhì)量為1、5、10kD的超濾膜進行超濾，收集不同截留分子量的濾液，分別編號為肽Ⅰ(Mw≤1kD)、肽Ⅱ(1kD≤Mw≤5kD)、肽Ⅲ(5kD≤Mw≤10kD)。

1.4.5 測定方法

蛋白質(zhì)測定：微量凱氏定氮法；蛋白酶活性：Folin酚法[12]，酶活力定義為每1個單位(U)蛋白酶活力定義為在測定條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量(μg/(mL·min))；多肽測定：雙縮脲法。清除能力測定采用NBT法；清除·OH能力測定采用D-2-脫氧核糖法；抗氧化能力測定采用亞油酸自氧化法；發(fā)酵液水解度測定及平均肽鏈長度測定均按文獻[12]方法進行。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中米曲霉產(chǎn)酶及沙光魚蛋白水解動態(tài)

圖1 不同發(fā)酵時間發(fā)酵液中多肽得率和蛋白酶活力Fig.1 Changes of polypeptide yield and protease activity inAcanthogobius hastamuscle homogenate during fermentation

取不同時間沙光魚發(fā)酵液，對其中蛋白酶活力和多肽得率進行測定，結(jié)果如圖1所示。在發(fā)酵前16h，米曲霉所產(chǎn)蛋白酶活力較低，40 h時達最大值，達到86.63U/mL，40h后發(fā)酵液中蛋白酶活力逐漸下降。米曲霉接種到沙光魚勻漿液后，要經(jīng)歷經(jīng)延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期，衰亡期幾個時期。在延遲期，米曲霉生長較慢，對數(shù)生長期微生物生長迅速，但是產(chǎn)酶量較低，接近40h時，米曲霉進入穩(wěn)定期，生物量最大，且產(chǎn)酶能力最佳，酶產(chǎn)量達到最大值；穩(wěn)定期后，微生物開始衰亡，生物量降低，產(chǎn)酶能力下降。發(fā)酵液中，多肽得率和米曲霉的產(chǎn)酶有密切的關(guān)系。發(fā)酵前期，蛋白酶產(chǎn)量低，多肽得率未見顯著變化，隨著產(chǎn)酶量的增加，多肽含量顯著增加；發(fā)酵后期，雖然蛋白酶活性降低，但多肽得率未見顯著變化。這是由于到了發(fā)酵后期，多肽對蛋白酶活性產(chǎn)生抑制作用，蛋白水解效率降低，但是，水解體系的多肽沒有提取，因此含量沒有顯著變化。考慮蛋白水解度和節(jié)約成本兩個因素，發(fā)酵的最佳時間為48h，此時多肽得率為8.98%。如果進行大規(guī)模生產(chǎn)，要對多肽進行提取，將有利于蛋白的進一步水解。另外，米曲霉適合于固體發(fā)酵。目前，通過固體發(fā)酵，可以獲得約1000U/g的產(chǎn)量，遠(yuǎn)大于本研究所用液體發(fā)酵所獲得的最大產(chǎn)酶量86.63U/mL[13]。但是，如果利用固體發(fā)酵制備多肽，多肽的提取技術(shù)還需進一步完善。因此，要想實現(xiàn)沙光魚發(fā)酵液的工業(yè)化生產(chǎn)，要進一步對固體發(fā)酵制備活性多肽的工藝進行研究。

2.2 發(fā)酵液的抗氧化活性

表1 不同發(fā)酵時間多肽的水解度及抗氧化活性(±s,n=3)Table 1 Free radical scavenging and antioxidant activities of fermentedAcanthogobius hastamuscle homogenate with different degrees of hydrolysis (±s,n=3)

表1 不同發(fā)酵時間多肽的水解度及抗氧化活性(±s,n=3)Table 1 Free radical scavenging and antioxidant activities of fermentedAcanthogobius hastamuscle homogenate with different degrees of hydrolysis (±s,n=3)

發(fā)酵時間/h 水解度/% 平均肽鏈 清除率/% 相對抗長度 O2· ·OH 氧化值16 9.5±0.6 45 2.6±0.1 19.2±1.0 0.5±0.132 17.3±0.3 22 40.3±2.6 69.6±2.1 1.7±0.348 26.6±0.8 14 55.7±2.1 81.9±3.3 2.2±0.564 32.8±0.4 8 49.8±2.3 72.3±2.7 1.9±0.4 VE 49.2±2.2 76.2±2.5 1.9±0.3

將不同發(fā)酵時間制備所得發(fā)酵液凍干，配成10mg/mL的多肽液，以等濃度的VE作對照，分別測定其平均肽鏈長度、自由基清除能力和抗氧化能力。結(jié)果如表1所示，隨著時間的延長，蛋白的水解度增加，肽鏈平均長度降低。在發(fā)酵48h時，平均肽鏈長度為14，水解度為26.6%，抗氧化能力最強。該結(jié)果同鳙魚魚鰾蛋白水解的過程相似。房耀維等[12]認(rèn)為肽段過長，具有抗氧化性的一些氨基酸未能斷裂，顯示不出抗氧化性，而肽鏈過短，具有抗氧化活性的結(jié)構(gòu)被水解，從而抗氧化性降低。

2.3 多肽大小對抗氧化活性的影響

收集發(fā)酵48h時的發(fā)酵液，應(yīng)用不同截留分子質(zhì)量的超濾膜進行超濾，收集不同截留分子質(zhì)量的濾液，冷凍干燥，配制成10mg/mL的多肽液，分別測定平均肽鏈長度、自由基清除能力和抗氧化能力。結(jié)果如表2所示，當(dāng)1kD≤MW≤5kD，平均肽鏈長度為14時的多肽液抗氧化能力最強；MW≤1kD，肽鏈平均長度為4的多肽液的抗氧化能力次之；5kD≤MW≤10kD，肽鏈平均長度為31的多肽液抗氧化能力最小。本結(jié)果同[14]報道的結(jié)果相類似，該研究認(rèn)為，有活性的多肽的長度往往由3～20個氨基酸組成，并且氨基酸的種類和數(shù)量極大地影響多肽的活性。當(dāng)MW≤1kD時，肽鏈平均長度為4，但是多肽液的抗氧化能力小于肽鏈平均長度為14的多肽液。這可能是由于MW≤1kD的多肽液中含有的小于3個氨基酸的肽鏈較多，影響了多肽液的抗氧化活性。當(dāng)多肽液中肽鏈的平均長度為14時，多肽鏈的長度多集中在活性最強的范圍內(nèi)，因此，抗氧化活性最強。當(dāng)5kD≤MW≤10kD時，此時肽鏈平均長度為31，抗氧化能力大大降低。

表2 不同超濾片段多肽的平均鏈長及抗氧化活性(±s,n=3)Table 2 Free radical scavenging and antioxidant activities of ultrafiltration fractions of entirely fermentedAcanthogobius hastamuscle homogenate (±s,n=3)

表2 不同超濾片段多肽的平均鏈長及抗氧化活性(±s,n=3)Table 2 Free radical scavenging and antioxidant activities of ultrafiltration fractions of entirely fermentedAcanthogobius hastamuscle homogenate (±s,n=3)

截留分子 平均肽鏈 清除率/% 相對抗質(zhì)量 長度 O2· ·O H 氧化值MW≤1kD 4 43.2±1.1 59.9±2.0 1.5±0.21kD≤MW≤5kD 14 62.8±2.6 89.6±2.6 2.7±0.25kD≤MW≤10kD 31 45.9±1.8 54.3±2.3 1.6±0.3 VE 49.2±2.2 76.2±2.5 1.9±0.3

3 結(jié) 論

以沙光魚為原料，采用接種米曲霉進行液體搖瓶發(fā)酵代替用商品酶直接水解制備具有抗氧化活性的多肽是可行的。在發(fā)酵前16h，米曲霉所產(chǎn)蛋白酶較低，40h時達最大值，達到86.63U/mL。考慮蛋白水解度和節(jié)約成本兩個因素，發(fā)酵的最佳時間為48h，此時的多肽得率達到8.98%?？紤]到米曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶量較高，進一步可以通過米曲霉固態(tài)發(fā)酵制備沙光魚抗氧化活性多肽。

隨著發(fā)酵時間的延長，沙光魚蛋白的水解度增加，肽鏈平均長度降低。在發(fā)酵48h時，平均肽鏈長度為14，水解度為26.6%，抗氧化能力最強，O2－·清除率、·OH清除率和相對抗氧化值分別為55.7、81.9和2.2。當(dāng)1kD≤MW≤5kD，平均肽鏈長度為14時的多肽液抗氧化能力最強；MW≤1kD，肽鏈平均長度為4的多肽液的抗氧化能力次之；5kD≤MW≤10kD，肽鏈平均長度為31的多肽液抗氧化能力最小。

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TQ936.16；R151.3

A

1002-6630(2010)17-0298-04

2010-06-24

江蘇省高校自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項目(08KJB550001)

房耀維(1978—)，男，副教授，博士，研究方向為海洋微生物與生物技術(shù)。E-mail：nnfyw@yahoo.com.cn