• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    發(fā)酵法制備沙光魚多肽及其抗氧化活性

    2010-10-19 05:26:40房耀維王淑軍徐煒楓呂明生焦豫良
    食品科學(xué) 2010年17期

    房耀維,余 勃,王淑軍,徐煒楓,劉 姝,呂明生,焦豫良

    (1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院,江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 連云港 222005;2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,江西 南昌 330047;3.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)檢中心,江蘇 南京 210036)

    發(fā)酵法制備沙光魚多肽及其抗氧化活性

    房耀維1,余 勃2,王淑軍1,徐煒楓3,劉 姝1,呂明生1,焦豫良1

    (1.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院,江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 連云港 222005;2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院,江西 南昌 330047;3.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)檢中心,江蘇 南京 210036)

    將米曲霉接種到pH5.0的沙光魚勻漿液中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),利用米曲霉產(chǎn)生的蛋白酶水解沙光魚蛋白。研究發(fā)酵過程中蛋白酶的產(chǎn)生及沙光魚蛋白的水解動態(tài);對發(fā)酵液進(jìn)行超濾,測定不同截留分子質(zhì)量的發(fā)酵液清除自由基的活性及抗氧化活性。結(jié)果表明:隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,沙光魚蛋白的水解度和多肽得率不斷增加,多肽的平均鏈長度降低。發(fā)酵48h后,多肽鏈平均長度為14,水解度為26.6%,多肽得率最高達(dá)到8.98%,抗氧化能力較強(qiáng)。不同截留分子質(zhì)量的多肽液中,平均肽鏈長度為14個(gè)氨基酸殘基的多肽超濾液體外抗氧化能力較強(qiáng)。

    沙光魚;米曲霉;多肽;抗氧化活性;發(fā)酵

    Production of Polypeptides Derived fromAcanthogobius hastaMuscle by Fermentation and Assessment of Their Antioxidant Activity

    FANG Yao-wei1,YU Bo2,WANG Shu-jun1,XU Wei-feng3,LIU Shu1,LU Ming-sheng1,JIAO Yu-liang1

    (1. Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, School of Marine Science and Technology, Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005, China;2. Sino-Germen Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China;3. Jiangsu Agro-Product Quality Test Center, Nanjing 210036, China)

    Abstract:Aspergillus oryzaeAS3.951 was inoculated intoAcanthogobius hastamuscle homogenate (pH 5.0) and incubated in order to produce proteases to hydrolyze fish proteins. Investigations on protease production kinetics during fermentation and the hydrolysis kinetics ofAcanthogobius hastamuscle proteins were made. The fermentation broth was ultrafiltrated through membranes with molecular weight cut-off (MWCO) and its fractions were measured for their free radical scavenging and antioxidant activities. The results revealed that as fermentation time was prolonged, the degree of hydrolysis ofAcanthogobius hastamuscle proteins and peptide yield gradually increased and the average chain length of ploypeptides decreased. After 48-hour fermentation, the average chain length of polypeptides, degree of hydrolysis, polypeptide yield obtained were 14, 26.6%and 8.98% and the resultant product exhibited a notable antioxidant effect. Among its ultrafiltration fractions, the polypeptides with an average chain length of 14 amino acid residues had the strongest antioxidant effect.

    Key words:Acanthogobius hasta;Aspergillus oryzae;polypeptide;antioxidant activity;fermentation

    沙光魚(Acanthogobius hasta)又名長身鯊,屬蝦虎魚科,矛尾刺蝦虎魚種,為海水及咸淡水產(chǎn)大型蝦虎魚。分布于太平洋西北部、中國、日本和韓國[1-2]。我國連云港地區(qū)適中的氣候和獨(dú)特的地理環(huán)境為沙光魚提供了特有的生長環(huán)境,使得連云港沙光魚肉質(zhì)細(xì)微、味道鮮美、營養(yǎng)豐富,成為連云港的特產(chǎn)之一,具有很高的開發(fā)利用價(jià)值。近年來許多研究表明,蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生易于吸收、溶解性好、乳化性好,并具有多種生理活性的多肽,改善了蛋白質(zhì)的功能特性,提高了蛋白質(zhì)的營養(yǎng)及利用價(jià)值[3-4]。全球魚類資源豐富,具有豐富的蛋白。將魚蛋白水解,可以產(chǎn)生具有包括降血壓、抗菌、清除體內(nèi)自由基、抗氧化、降低膽固醇等多種生理活性的活性多肽[5-6]。特別是魚類多肽所具有的清除自由基,防止氧化對生物體細(xì)胞和組織造成破壞的功能,受到廣泛的關(guān)注,成為人們開發(fā)的熱點(diǎn)[7]。

    傳統(tǒng)的魚類蛋白水解都是用魚類本身的蛋白酶自然情況下對蛋白進(jìn)行水解,如制備液體魚蛋白(f i s h silage)。自然水解完成需要的時(shí)間較長,而且蛋白的水解過程很難控制,蛋白的水解率降低,只能保持在20%到70%之間[8-9]。利用成品蛋白酶對魚類蛋白進(jìn)行水解,水解過程可以控制,水解時(shí)間短,容易獲得濃度和純度較高、溶解性好、穩(wěn)定的多肽溶液[10]。但是,運(yùn)用蛋白酶對魚類蛋白進(jìn)行水解,蛋白酶制劑的成本較高。目前,運(yùn)用蛋白酶水解魚類蛋白的研究大多只限于實(shí)驗(yàn)室研究。如果利用安全的微生物菌株產(chǎn)生的蛋白酶代替商品酶制劑對魚類蛋白進(jìn)行發(fā)酵,可以大大降低多肽的生產(chǎn)成本,利于魚類多肽的工業(yè)化生產(chǎn)。

    本實(shí)驗(yàn)以連云港特產(chǎn)魚類——沙光魚為原料,以米曲霉為發(fā)酵菌株,經(jīng)發(fā)酵制備沙光魚多肽。并對沙光魚多肽進(jìn)行初步純化,對不同分子質(zhì)量范圍內(nèi)多肽的抗氧化性進(jìn)行評價(jià),為抗氧化沙光魚多肽的制備和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    沙光魚(Acanthogobius hasta),于10月份在連云港新浦區(qū)水產(chǎn)品批發(fā)市場選擇活潑、健康無病害、體長(26±2)cm,體質(zhì)量(150±30)g沙光魚。

    1.2 儀器與設(shè)備

    超濾設(shè)備及超濾膜 美國Millipore公司;Synergy 2型全自動多功能酶標(biāo)儀 美國Bio Tek公司;Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī) 美國Eppendorf公司;DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠。

    1.3 菌種與培養(yǎng)基

    米曲霉(Aspergillus oryzae,AS3.951) 中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。

    種子培養(yǎng)基(馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基,PDA):馬鈴薯200g(切片水煮30min,過濾取汁)、蔗糖20.0g、蒸餾水1000mL,pH值自然。固體培養(yǎng)基另加1.5~2g/100mL的瓊脂。

    1.4 方法

    1.4.1 種子液的制備

    將菌種在PDA斜面培養(yǎng)基上活化,從活化后的菌種保藏斜面上挑取孢子接種至PDA液體培養(yǎng)基,28℃、120r/min培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到106CFU/mL。

    1.4.2 沙光魚勻漿液的制備

    將選好的活魚宰殺,取出魚皮、內(nèi)臟和魚骨,用生理鹽水清洗干凈后,用吸水紙將殘留在肌肉表面的生理鹽水吸干,切成魚塊,用高速組織搗碎機(jī)勻漿。勻漿液稀釋到蛋白質(zhì)量濃度5g/100mL后進(jìn)行巴氏滅菌(60℃,30min),備用。

    1.4.3 勻漿液發(fā)酵

    按體積分?jǐn)?shù)5%接種量將發(fā)酵菌株種子液接種于沙光魚勻漿液中,28℃、120r/min培養(yǎng),分別在不同發(fā)酵時(shí)間取樣。將發(fā)酵液于4℃、12000×g離心30min,上清液過0.45μm微孔濾膜,濾液分成兩份,一份冷凍干燥,冷凍保藏備用;另一份用來測定蛋白酶活性。

    1.4.4 超濾分離

    根據(jù)劉姝等[11]所報(bào)道的方法,收集發(fā)酵液,用去離子水配成質(zhì)量濃度為10mg/mL的樣液,分別通過截留分子質(zhì)量為1、5、10kD的超濾膜進(jìn)行超濾,收集不同截留分子量的濾液,分別編號為肽Ⅰ(Mw≤1kD)、肽Ⅱ(1kD≤Mw≤5kD)、肽Ⅲ(5kD≤Mw≤10kD)。

    1.4.5 測定方法

    蛋白質(zhì)測定:微量凱氏定氮法;蛋白酶活性:Folin酚法[12],酶活力定義為每1個(gè)單位(U)蛋白酶活力定義為在測定條件下,每分鐘催化產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量(μg/(mL·min));多肽測定:雙縮脲法。清除能力測定采用NBT法;清除·OH能力測定采用D-2-脫氧核糖法;抗氧化能力測定采用亞油酸自氧化法;發(fā)酵液水解度測定及平均肽鏈長度測定均按文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行。

    1.4.6 數(shù)據(jù)處理

    采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 發(fā)酵過程中米曲霉產(chǎn)酶及沙光魚蛋白水解動態(tài)

    圖1 不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液中多肽得率和蛋白酶活力Fig.1 Changes of polypeptide yield and protease activity inAcanthogobius hastamuscle homogenate during fermentation

    取不同時(shí)間沙光魚發(fā)酵液,對其中蛋白酶活力和多肽得率進(jìn)行測定,結(jié)果如圖1所示。在發(fā)酵前16h,米曲霉所產(chǎn)蛋白酶活力較低,40 h時(shí)達(dá)最大值,達(dá)到86.63U/mL,40h后發(fā)酵液中蛋白酶活力逐漸下降。米曲霉接種到沙光魚勻漿液后,要經(jīng)歷經(jīng)延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期,衰亡期幾個(gè)時(shí)期。在延遲期,米曲霉生長較慢,對數(shù)生長期微生物生長迅速,但是產(chǎn)酶量較低,接近40h時(shí),米曲霉進(jìn)入穩(wěn)定期,生物量最大,且產(chǎn)酶能力最佳,酶產(chǎn)量達(dá)到最大值;穩(wěn)定期后,微生物開始衰亡,生物量降低,產(chǎn)酶能力下降。發(fā)酵液中,多肽得率和米曲霉的產(chǎn)酶有密切的關(guān)系。發(fā)酵前期,蛋白酶產(chǎn)量低,多肽得率未見顯著變化,隨著產(chǎn)酶量的增加,多肽含量顯著增加;發(fā)酵后期,雖然蛋白酶活性降低,但多肽得率未見顯著變化。這是由于到了發(fā)酵后期,多肽對蛋白酶活性產(chǎn)生抑制作用,蛋白水解效率降低,但是,水解體系的多肽沒有提取,因此含量沒有顯著變化??紤]蛋白水解度和節(jié)約成本兩個(gè)因素,發(fā)酵的最佳時(shí)間為48h,此時(shí)多肽得率為8.98%。如果進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn),要對多肽進(jìn)行提取,將有利于蛋白的進(jìn)一步水解。另外,米曲霉適合于固體發(fā)酵。目前,通過固體發(fā)酵,可以獲得約1000U/g的產(chǎn)量,遠(yuǎn)大于本研究所用液體發(fā)酵所獲得的最大產(chǎn)酶量86.63U/mL[13]。但是,如果利用固體發(fā)酵制備多肽,多肽的提取技術(shù)還需進(jìn)一步完善。因此,要想實(shí)現(xiàn)沙光魚發(fā)酵液的工業(yè)化生產(chǎn),要進(jìn)一步對固體發(fā)酵制備活性多肽的工藝進(jìn)行研究。

    2.2 發(fā)酵液的抗氧化活性

    表1 不同發(fā)酵時(shí)間多肽的水解度及抗氧化活性(±s,n=3)Table 1 Free radical scavenging and antioxidant activities of fermentedAcanthogobius hastamuscle homogenate with different degrees of hydrolysis (±s,n=3)

    表1 不同發(fā)酵時(shí)間多肽的水解度及抗氧化活性(±s,n=3)Table 1 Free radical scavenging and antioxidant activities of fermentedAcanthogobius hastamuscle homogenate with different degrees of hydrolysis (±s,n=3)

    發(fā)酵時(shí)間/h 水解度/% 平均肽鏈 清除率/% 相對抗長度 O2· ·OH 氧化值16 9.5±0.6 45 2.6±0.1 19.2±1.0 0.5±0.132 17.3±0.3 22 40.3±2.6 69.6±2.1 1.7±0.348 26.6±0.8 14 55.7±2.1 81.9±3.3 2.2±0.564 32.8±0.4 8 49.8±2.3 72.3±2.7 1.9±0.4 VE 49.2±2.2 76.2±2.5 1.9±0.3

    將不同發(fā)酵時(shí)間制備所得發(fā)酵液凍干,配成10mg/mL的多肽液,以等濃度的VE作對照,分別測定其平均肽鏈長度、自由基清除能力和抗氧化能力。結(jié)果如表1所示,隨著時(shí)間的延長,蛋白的水解度增加,肽鏈平均長度降低。在發(fā)酵48h時(shí),平均肽鏈長度為14,水解度為26.6%,抗氧化能力最強(qiáng)。該結(jié)果同鳙魚魚鰾蛋白水解的過程相似。房耀維等[12]認(rèn)為肽段過長,具有抗氧化性的一些氨基酸未能斷裂,顯示不出抗氧化性,而肽鏈過短,具有抗氧化活性的結(jié)構(gòu)被水解,從而抗氧化性降低。

    2.3 多肽大小對抗氧化活性的影響

    收集發(fā)酵48h時(shí)的發(fā)酵液,應(yīng)用不同截留分子質(zhì)量的超濾膜進(jìn)行超濾,收集不同截留分子質(zhì)量的濾液,冷凍干燥,配制成10mg/mL的多肽液,分別測定平均肽鏈長度、自由基清除能力和抗氧化能力。結(jié)果如表2所示,當(dāng)1kD≤MW≤5kD,平均肽鏈長度為14時(shí)的多肽液抗氧化能力最強(qiáng);MW≤1kD,肽鏈平均長度為4的多肽液的抗氧化能力次之;5kD≤MW≤10kD,肽鏈平均長度為31的多肽液抗氧化能力最小。本結(jié)果同[14]報(bào)道的結(jié)果相類似,該研究認(rèn)為,有活性的多肽的長度往往由3~20個(gè)氨基酸組成,并且氨基酸的種類和數(shù)量極大地影響多肽的活性。當(dāng)MW≤1kD時(shí),肽鏈平均長度為4,但是多肽液的抗氧化能力小于肽鏈平均長度為14的多肽液。這可能是由于MW≤1kD的多肽液中含有的小于3個(gè)氨基酸的肽鏈較多,影響了多肽液的抗氧化活性。當(dāng)多肽液中肽鏈的平均長度為14時(shí),多肽鏈的長度多集中在活性最強(qiáng)的范圍內(nèi),因此,抗氧化活性最強(qiáng)。當(dāng)5kD≤MW≤10kD時(shí),此時(shí)肽鏈平均長度為31,抗氧化能力大大降低。

    表2 不同超濾片段多肽的平均鏈長及抗氧化活性(±s,n=3)Table 2 Free radical scavenging and antioxidant activities of ultrafiltration fractions of entirely fermentedAcanthogobius hastamuscle homogenate (±s,n=3)

    表2 不同超濾片段多肽的平均鏈長及抗氧化活性(±s,n=3)Table 2 Free radical scavenging and antioxidant activities of ultrafiltration fractions of entirely fermentedAcanthogobius hastamuscle homogenate (±s,n=3)

    截留分子 平均肽鏈 清除率/% 相對抗質(zhì)量 長度 O2· ·O H 氧化值MW≤1kD 4 43.2±1.1 59.9±2.0 1.5±0.21kD≤MW≤5kD 14 62.8±2.6 89.6±2.6 2.7±0.25kD≤MW≤10kD 31 45.9±1.8 54.3±2.3 1.6±0.3 VE 49.2±2.2 76.2±2.5 1.9±0.3

    3 結(jié) 論

    以沙光魚為原料,采用接種米曲霉進(jìn)行液體搖瓶發(fā)酵代替用商品酶直接水解制備具有抗氧化活性的多肽是可行的。在發(fā)酵前16h,米曲霉所產(chǎn)蛋白酶較低,40h時(shí)達(dá)最大值,達(dá)到86.63U/mL??紤]蛋白水解度和節(jié)約成本兩個(gè)因素,發(fā)酵的最佳時(shí)間為48h,此時(shí)的多肽得率達(dá)到8.98%??紤]到米曲霉固體發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶量較高,進(jìn)一步可以通過米曲霉固態(tài)發(fā)酵制備沙光魚抗氧化活性多肽。

    隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,沙光魚蛋白的水解度增加,肽鏈平均長度降低。在發(fā)酵48h時(shí),平均肽鏈長度為14,水解度為26.6%,抗氧化能力最強(qiáng),O2-·清除率、·OH清除率和相對抗氧化值分別為55.7、81.9和2.2。當(dāng)1kD≤MW≤5kD,平均肽鏈長度為14時(shí)的多肽液抗氧化能力最強(qiáng);MW≤1kD,肽鏈平均長度為4的多肽液的抗氧化能力次之;5kD≤MW≤10kD,肽鏈平均長度為31的多肽液抗氧化能力最小。

    [1] ISLAM S M, HIBINO M, TANAKA M. Distribution and diets of larval and juvenile fishes:Influence of salinity gradient and turbidity maximum in a temperate estuary in upper Ariake Bay, Japan[J]. Estuarine, Coastal and Shelf Science, 2006, 68(1/2):62-74.

    [2] KUNO Y, TAKITA T. The growth, maturation and feeding habits of the gobiid fishAcanthogobius hastadistribution in Ariake Sound, Kyushu,Japan[J]. Fisheries Science, 1997, 63:242-248.

    [3] SIEMENSMA A D, WEIJER W J, BAK H J. The importamce of peptide lengths in hypoallergenic imfant formulae[J]. Trends in Food Science and Technology, 1993, 4(1):16-21.

    [4] KRISTINSSON H G, RASCO B A. Biochemical and functional properties of Atlantic salmon (Salmo salar) muscle proteins hydrolyzed with various alkaline proteases[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2000, 48(3):657-666.

    [5] 韓冰, 石彥國, 張根生, 等. Alcalase蛋白酶制備鯉魚魚鱗膠原多肽[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(24):51-55.

    [6] KRISTINSSON H G, RASCO B A. Fish protein hydrolysates:production, biochemical, and functional properties[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 2000, 40(1):43-81.

    [7] JE J Y, QIAN Zhongji, BYUN H G, et al. Purification and characterization of an antioxidant peptide obtained from tuna backbone protein by enzymatic hydrolysis[J]. Process Biochemistry, 2007, 42(5):840-846.

    [8] BHASKAR N, MAHENDRAKAR N S. Protein hydrolysate from visceral waste proteins of Catla (Catla catla):Optimization of hydrolysis conditions for a commercial neutral protease[J]. Bioresource Technology,2008, 99(10):4105-4111.

    [9] ESPE M, RAA J, NJAA L R. Nutritional value of stored fish silage as protein source of young rats[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1989, 49(3):259-270.

    [10] GUERARD F, GUIMAS L, BINET A. Production of tuna waste hydrolysates by a commercial neutral protease preparation[J]. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 2002, 19/20(2):489-498.

    [11] 劉姝, 余勃. 發(fā)酵法制備魚鰾多肽及其抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(21):332-334.

    [12] 房耀維, 劉姝, 徐煒楓, 等. 一株有機(jī)溶劑穩(wěn)定性蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選與鑒定[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(7):197-201.

    [13] 傅力, 章運(yùn), 艾乃吐拉, 等. 醬油生產(chǎn)中高產(chǎn)蛋白酶菌株米曲霉UF366發(fā)酵條件的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(9):427-430.

    [14] PIHLANTO-LEPPBioactive peptides derived from bovine whey proteins:opioid and ace-inhibitory peptides[J]. Trends in Food Science and Technology, 2000, 11(9/10):347-356.

    TQ936.16;R151.3

    A

    1002-6630(2010)17-0298-04

    2010-06-24

    江蘇省高校自然科學(xué)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(08KJB550001)

    房耀維(1978—),男,副教授,博士,研究方向?yàn)楹Q笪⑸锱c生物技術(shù)。E-mail:nnfyw@yahoo.com.cn

    亚洲中文av在线| 毛片一级片免费看久久久久| 性色avwww在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 妹子高潮喷水视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 人妻一区二区av| 日韩电影二区| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久99精品国语久久久| 高清av免费在线| 最近中文字幕高清免费大全6| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 日韩成人伦理影院| av.在线天堂| 日本与韩国留学比较| av免费在线看不卡| 91精品国产国语对白视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 蜜桃国产av成人99| 国产成人午夜福利电影在线观看| 在线看a的网站| 波多野结衣一区麻豆| 各种免费的搞黄视频| 欧美国产精品一级二级三级| 99久国产av精品国产电影| 久久久精品区二区三区| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 搡女人真爽免费视频火全软件| 日韩制服骚丝袜av| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 一区二区三区四区激情视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 高清不卡的av网站| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 成年美女黄网站色视频大全免费| 精品国产一区二区久久| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲图色成人| 国产色爽女视频免费观看| 宅男免费午夜| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 七月丁香在线播放| 国产片内射在线| 好男人视频免费观看在线| 少妇熟女欧美另类| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲经典国产精华液单| 一区在线观看完整版| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 男男h啪啪无遮挡| 久久久久国产精品人妻一区二区| 男人添女人高潮全过程视频| 满18在线观看网站| 最近最新中文字幕免费大全7| 黑人欧美特级aaaaaa片| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美97在线视频| 国产精品.久久久| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 高清av免费在线| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲精品国产av蜜桃| 免费人成在线观看视频色| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲精品自拍成人| 男女高潮啪啪啪动态图| 在现免费观看毛片| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 日韩,欧美,国产一区二区三区| 成人毛片60女人毛片免费| 人人妻人人澡人人看| av天堂久久9| 国产亚洲精品久久久com| 国产精品久久久久久久久免| 在线天堂中文资源库| 男的添女的下面高潮视频| 精品一区二区免费观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美成人午夜精品| 亚洲人成网站在线观看播放| 成人毛片60女人毛片免费| www.色视频.com| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 夫妻性生交免费视频一级片| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲,一卡二卡三卡| 午夜91福利影院| 国产精品一二三区在线看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 男女边吃奶边做爰视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 内地一区二区视频在线| 女性生殖器流出的白浆| 久久久久精品久久久久真实原创| av国产精品久久久久影院| 日韩一区二区三区影片| 亚洲国产精品国产精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 搡女人真爽免费视频火全软件| 综合色丁香网| 亚洲av综合色区一区| 人妻 亚洲 视频| 99视频精品全部免费 在线| 日韩中字成人| 国产成人免费无遮挡视频| 久久99热6这里只有精品| 国产色婷婷99| 国产精品久久久久久久电影| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美日本中文国产一区发布| 成人手机av| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲欧美清纯卡通| 久久久a久久爽久久v久久| 久久女婷五月综合色啪小说| 成人国语在线视频| 日韩一区二区三区影片| 欧美日韩综合久久久久久| 国产精品人妻久久久影院| 黄色视频在线播放观看不卡| www.av在线官网国产| 久久这里只有精品19| 国产免费一区二区三区四区乱码| 国产一区有黄有色的免费视频| videosex国产| 视频区图区小说| 青青草视频在线视频观看| 一级黄片播放器| 国产淫语在线视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 青春草亚洲视频在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产xxxxx性猛交| 国产熟女欧美一区二区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| av国产久精品久网站免费入址| 熟妇人妻不卡中文字幕| 最近中文字幕2019免费版| 视频区图区小说| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产精品人妻久久久久久| 伊人亚洲综合成人网| 国产男女内射视频| 秋霞在线观看毛片| 午夜视频国产福利| 免费高清在线观看视频在线观看| 午夜免费鲁丝| 纯流量卡能插随身wifi吗| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲精品,欧美精品| √禁漫天堂资源中文www| 曰老女人黄片| 亚洲丝袜综合中文字幕| 免费高清在线观看视频在线观看| av在线播放精品| 美女视频免费永久观看网站| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 日韩中字成人| 成人无遮挡网站| 秋霞伦理黄片| www.色视频.com| 国产成人aa在线观看| 91精品三级在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 9热在线视频观看99| 国产探花极品一区二区| 国产男人的电影天堂91| 欧美日韩亚洲高清精品| 免费观看在线日韩| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产日韩欧美在线精品| 大香蕉久久成人网| 综合色丁香网| 久久精品国产a三级三级三级| 久久久久久久久久久免费av| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 美国免费a级毛片| 乱码一卡2卡4卡精品| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 99热全是精品| 久久亚洲国产成人精品v| 久久99精品国语久久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 少妇高潮的动态图| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 一本久久精品| 少妇的逼水好多| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 欧美少妇被猛烈插入视频| 99热全是精品| 女人久久www免费人成看片| 国产一区二区在线观看av| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲图色成人| av网站免费在线观看视频| 欧美国产精品一级二级三级| 欧美3d第一页| 五月开心婷婷网| 日韩制服骚丝袜av| 国产精品一区www在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 亚洲av福利一区| 在线 av 中文字幕| 国产又色又爽无遮挡免| 国产熟女午夜一区二区三区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲国产欧美在线一区| 亚洲国产色片| 亚洲,欧美,日韩| 少妇被粗大猛烈的视频| 成人无遮挡网站| 亚洲第一av免费看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲 欧美一区二区三区| 中文字幕亚洲精品专区| 精品国产露脸久久av麻豆| 黑人高潮一二区| 美女国产高潮福利片在线看| 久久精品国产亚洲av涩爱| av福利片在线| 热re99久久国产66热| 亚洲av在线观看美女高潮| 香蕉丝袜av| 国产精品免费大片| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产精品久久久久久久电影| 91久久精品国产一区二区三区| a级毛色黄片| 欧美人与善性xxx| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲综合精品二区| 亚洲精品一二三| 成人黄色视频免费在线看| 中文字幕av电影在线播放| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产成人精品无人区| 有码 亚洲区| 少妇熟女欧美另类| 插逼视频在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品久久久久久精品古装| 波野结衣二区三区在线| 一边亲一边摸免费视频| 久久久精品区二区三区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 女人精品久久久久毛片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产在线视频一区二区| 极品人妻少妇av视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产精品嫩草影院av在线观看| 成年动漫av网址| 亚洲精品自拍成人| av卡一久久| 91成人精品电影| av网站免费在线观看视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 黄色毛片三级朝国网站| 国产淫语在线视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 精品久久久精品久久久| 秋霞伦理黄片| 久久精品国产自在天天线| 久久国内精品自在自线图片| 久久久久久久久久成人| 七月丁香在线播放| 欧美3d第一页| 久久久久国产网址| 亚洲国产欧美在线一区| 妹子高潮喷水视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产激情久久老熟女| 精品国产一区二区三区四区第35| 一区在线观看完整版| 久久人人爽人人片av| 国产成人精品无人区| 99久久综合免费| 高清视频免费观看一区二区| 在线观看三级黄色| 天天影视国产精品| 中国三级夫妇交换| 99久久人妻综合| 哪个播放器可以免费观看大片| 一级黄片播放器| 男女下面插进去视频免费观看 | 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲综合精品二区| 九九在线视频观看精品| 久久韩国三级中文字幕| 十八禁网站网址无遮挡| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 蜜桃在线观看..| 国产成人精品婷婷| tube8黄色片| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产成人欧美| 免费观看a级毛片全部| 久久人人爽人人片av| av网站免费在线观看视频| 国内精品宾馆在线| 大陆偷拍与自拍| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产伦理片在线播放av一区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| av视频免费观看在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 日本欧美视频一区| 亚洲精品色激情综合| 极品少妇高潮喷水抽搐| 成人国产av品久久久| 一本久久精品| 99国产综合亚洲精品| 免费观看无遮挡的男女| 大香蕉久久网| 精品少妇久久久久久888优播| 久久av网站| 伦理电影免费视频| 蜜桃在线观看..| 久久久精品94久久精品| 热99久久久久精品小说推荐| 91久久精品国产一区二区三区| 久久这里有精品视频免费| 久久久国产一区二区| 亚洲第一av免费看| 亚洲内射少妇av| 国产又爽黄色视频| 一级片'在线观看视频| 欧美精品高潮呻吟av久久| 日本wwww免费看| 午夜91福利影院| 亚洲人成77777在线视频| 国精品久久久久久国模美| 精品少妇黑人巨大在线播放| 高清不卡的av网站| 波野结衣二区三区在线| 日韩欧美精品免费久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久久久网色| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 午夜激情av网站| 人成视频在线观看免费观看| 黄色视频在线播放观看不卡| freevideosex欧美| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 日韩一本色道免费dvd| 丝袜脚勾引网站| 天天操日日干夜夜撸| 国产精品熟女久久久久浪| 国产成人精品久久久久久| 我要看黄色一级片免费的| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 在现免费观看毛片| 一级片免费观看大全| 九色亚洲精品在线播放| 超色免费av| 日韩一区二区三区影片| 亚洲熟女精品中文字幕| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲图色成人| 日韩三级伦理在线观看| 免费人成在线观看视频色| 九色成人免费人妻av| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲精品色激情综合| 在线观看一区二区三区激情| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品人妻久久久久久| 成人漫画全彩无遮挡| 伦精品一区二区三区| 国产成人av激情在线播放| 91精品三级在线观看| 国精品久久久久久国模美| 看十八女毛片水多多多| 午夜福利影视在线免费观看| 成人毛片60女人毛片免费| 欧美日韩av久久| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久人人爽人人片av| 久久99蜜桃精品久久| 国产一级毛片在线| 亚洲欧洲国产日韩| 日本91视频免费播放| 一本色道久久久久久精品综合| 国产免费又黄又爽又色| 一级毛片电影观看| 亚洲久久久国产精品| 国产视频首页在线观看| 免费看光身美女| 国产免费视频播放在线视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 春色校园在线视频观看| 一级片免费观看大全| 三级国产精品片| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 18禁动态无遮挡网站| 日韩精品有码人妻一区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 高清av免费在线| 另类亚洲欧美激情| 免费观看性生交大片5| 成人免费观看视频高清| 亚洲综合精品二区| 精品人妻偷拍中文字幕| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 香蕉国产在线看| 欧美成人精品欧美一级黄| 久久这里只有精品19| 国产一区有黄有色的免费视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲av免费高清在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 午夜激情av网站| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产一级毛片在线| 99热网站在线观看| 精品视频人人做人人爽| 欧美xxⅹ黑人| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 久久99精品国语久久久| 自线自在国产av| 亚洲av男天堂| 成人午夜精彩视频在线观看| 青青草视频在线视频观看| 女人久久www免费人成看片| av电影中文网址| 人成视频在线观看免费观看| 欧美3d第一页| 蜜桃国产av成人99| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲少妇的诱惑av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲人成网站在线观看播放| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲人成77777在线视频| 99久久精品国产国产毛片| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 七月丁香在线播放| 考比视频在线观看| 丝袜在线中文字幕| 美女主播在线视频| tube8黄色片| 男女国产视频网站| 国产一区二区三区综合在线观看 | 国产精品 国内视频| 99热这里只有是精品在线观看| 99热国产这里只有精品6| 免费黄频网站在线观看国产| 国国产精品蜜臀av免费| 欧美日本中文国产一区发布| 我要看黄色一级片免费的| 视频在线观看一区二区三区| 国产一级毛片在线| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 午夜福利视频精品| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 99热6这里只有精品| 欧美bdsm另类| 夜夜爽夜夜爽视频| 青青草视频在线视频观看| 国产男女超爽视频在线观看| 久久久久精品性色| 日本午夜av视频| 精品亚洲成a人片在线观看| 欧美国产精品一级二级三级| 国产一区二区激情短视频 | 亚洲第一av免费看| 久久综合国产亚洲精品| 黑丝袜美女国产一区| 成年人午夜在线观看视频| 日本与韩国留学比较| 伊人久久国产一区二区| 一级a做视频免费观看| 国产一区二区三区综合在线观看 | 久久99精品国语久久久| 国产乱人偷精品视频| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 日本与韩国留学比较| 国产在线一区二区三区精| 亚洲欧洲日产国产| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 91aial.com中文字幕在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 91久久精品国产一区二区三区| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美人与性动交α欧美软件 | 99久久人妻综合| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品.久久久| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 蜜桃国产av成人99| 亚洲精品乱久久久久久| 久久久久久久久久成人| av不卡在线播放| 超色免费av| 亚洲少妇的诱惑av| 青春草亚洲视频在线观看| 黑丝袜美女国产一区| 一级黄片播放器| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 少妇的逼水好多| 大片免费播放器 马上看| 久久免费观看电影| 久久精品国产亚洲av天美| 免费av中文字幕在线| 大香蕉久久网| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲欧洲国产日韩| 另类亚洲欧美激情| 日韩欧美精品免费久久| 大香蕉久久成人网| 少妇精品久久久久久久| 国产精品女同一区二区软件| 插逼视频在线观看| 欧美3d第一页| 国产男人的电影天堂91| www.av在线官网国产| a 毛片基地| 亚洲欧洲国产日韩| 国产成人午夜福利电影在线观看| 99九九在线精品视频| 亚洲av国产av综合av卡| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 91久久精品国产一区二区三区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲精品第二区| 亚洲国产av新网站| 国产不卡av网站在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| av在线观看视频网站免费| 精品亚洲成国产av| 国产精品女同一区二区软件| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 一级a做视频免费观看| 亚洲成色77777| 欧美成人午夜精品| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 男人爽女人下面视频在线观看| 最新中文字幕久久久久| 午夜免费男女啪啪视频观看| 丰满少妇做爰视频| 久久99蜜桃精品久久| 国产成人精品一,二区| 免费观看性生交大片5| 美女大奶头黄色视频| 丝瓜视频免费看黄片| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美 日韩 精品 国产| 有码 亚洲区| 久久国产精品大桥未久av| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 黄色一级大片看看| 一二三四在线观看免费中文在 | 中文字幕制服av| 丰满乱子伦码专区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 婷婷成人精品国产| 香蕉精品网在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲久久久国产精品| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲,欧美精品.| 国产老妇伦熟女老妇高清| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 97超碰精品成人国产| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲美女视频黄频| 人妻一区二区av| 国产精品久久久久久精品电影小说| 国产一区二区在线观看av| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| av女优亚洲男人天堂| 国产成人91sexporn| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲人与动物交配视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 日本黄色日本黄色录像| 在线免费观看不下载黄p国产| 七月丁香在线播放| 久久久久国产网址| 国产日韩欧美视频二区| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产高清不卡午夜福利|