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    飼用α-半乳糖苷酶穩(wěn)定性及酶學(xué)特性的研究

    2010-10-19 15:08:04中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院王春林陸文清
    中國飼料 2010年6期
    關(guān)鍵詞:腸液緩沖溶液胃液

    中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 王春林 陸文清

    α-半乳糖苷酶是消除飼料原料中α-半乳糖苷聚糖類抗?fàn)I養(yǎng)因子的飼用外源酶類 (張麗英,2000;Leske和 Coon,1999)。但酶在加工應(yīng)用過程中先經(jīng)受原料混合加工、高溫制粒、運(yùn)輸和儲存等環(huán)節(jié)后,才在動物胃腸道溶解發(fā)生作用,所以酶制劑的穩(wěn)定性倍受關(guān)注。α-半乳糖苷酶理化性質(zhì)的研究對其在飼料中的應(yīng)用具有指導(dǎo)意義。本試驗(yàn)對α-半乳糖苷酶粗制品的耐酸、耐溫和耐儲存性能進(jìn)行了測定,體外研究了動物消化液對酶活力的影響,探討了粗酶-底物作用的動力學(xué)特征。

    1 材料與方法

    1.1 酶樣與酶活測定 酶樣取自青霉菌(Penicillium sp.MAFIC-6)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的α-半乳糖苷酶粗酶制劑,測試樣品為原酶干粉或原酶稀釋液。酶活分析方法參照Wang等(2004)。

    1.2 pH對酶活力及穩(wěn)定性的影響 用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液 (pH 3.6 ~ 5.6,0.05 mol/L)、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液 (pH 5.7 ~8.0,0.10 mol/L)、Tris-鹽酸緩沖溶液 (pH 6.8 ~9.2,0.10 mol/L)和 Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液(pH 9.2~10.7,0.10 mol/L)配制pH為2.5~12.5的緩沖體系,測定相同酶液在不同pH條件下的酶活力,確定最適pH。為觀察酶的pH穩(wěn)定性,用pH 2.5~12.5反應(yīng)液在40℃分別孵育酶液1、2 h和12 h,再按常規(guī)方法測定殘余酶活力。

    1.3 溫度對酶活力及穩(wěn)定性的影響 將酶液置于30~100℃溫度下反應(yīng)測定不同溫度下的酶活力,確定酶作用的最適溫度。為了解酶在濕熱下的穩(wěn)定性,將相同的稀釋酶液分別在30~100℃下處理30 min和60 min,冷卻后按常規(guī)方法測定殘余酶活力。為了解酶在干熱下的穩(wěn)定性,用金屬鋁盒稱取干酶粉2.0 g左右,置于30~100℃溫度處理30 min和60 min,冷卻后測定殘余酶活力。結(jié)果表示為相對酶活力。

    1.4 金屬離子對酶活力的影響 分別配制10×10-3mol/L的金屬離子(見表1)溶液,用酶液混合稀釋使離子在體系中的終濃度為1×10-3mol/L或1×10-4mol/L,于 40 ℃保溫 30 min,然后按常規(guī)方法測定α-半乳糖苷酶活力。結(jié)果表示為相對于未經(jīng)金屬離子處理的酶活力的百分比例。

    1.5 豬消化液對酶活力的影響 選取6頭體重(20±0.5)kg健康的達(dá)蘭豬,屠宰后分別從胃幽門部和小腸空腸部位取內(nèi)容物,迅速用8層紗布過濾,4℃下4000 r/min離心20 min,取上清液裝棕色瓶-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。分別用醋酸緩沖溶液(pH 5.5)、胃液(pH 4.0 ~ 4.3)和小腸液(pH 6.1 ~6.3)混合原酶液(V/V 為 9∶1),放置 12 h 和 24 h。其中部分樣品用胃液處理12 h后繼續(xù)用腸液處理12 h。最終在統(tǒng)一條件下測定混合液殘余酶活力。以醋酸緩沖液的酶活力為對照,其他酶活與之相比的百分?jǐn)?shù)為相對酶活力。

    1.6 酶的耐儲藏試驗(yàn) 選取起始酶活不同的兩個中試干燥酶樣品 (水分 <8%)。在常溫15~30℃和相對濕度 <50%條件下密封保存9個月,分別在3、6月和9月時取樣測定α-半乳糖苷酶活力,每個樣取6個平行。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 pH對酶活的影響 酶的活性受所在環(huán)境pH的影響。pH改變能影響酶分子活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離。在非最適pH時,活性基團(tuán)的解離狀態(tài)發(fā)生改變,酶底物的結(jié)合力降低,因而酶促反應(yīng)速度降低。此外,環(huán)境過酸、過堿能使酶蛋白本身變性失活。酶作為一種活性蛋白質(zhì),酶-底物體系的酸堿度影響到酶分子結(jié)構(gòu)域、酶與底物的離子化程度及其間的親和力,一定的解離狀態(tài)最適合其催化反應(yīng),極端pH條件對酶可引起不可逆的破壞,使酶失活(沈同和王鏡巖,1991)。圖1表明,α-半乳糖苷酶最適pH為4.5。酶在不同pH反應(yīng)體系中分別保溫1、2 h和12 h后,剩余酶活力呈現(xiàn)了相似的變化趨勢。以pH 4.5的相對酶活力為100%,當(dāng)pH超過6.5時,3個時間的酶活力均保持在67%左右,隨后酶活迅速下降,到7.5時酶活保持依次為22.46%、20.51%和20.50%,到pH 8.5時,酶活均下降到10.5%以下。在pH 3.5以下時,3個時間點(diǎn)的酶活依次為16.82%、80.18%和53.04%,說明該酶具有較強(qiáng)的耐酸性能。由此可見,該酶的穩(wěn)定pH在3.5~6.5。

    圖1 pH對酶活力及穩(wěn)定性影響

    2.2 溫度對酶活穩(wěn)定性的影響 酶是一種生物活性催化劑,具有一般催化劑的性質(zhì),即其催化效率在一定范圍隨溫度升高而增加,但酶蛋白又會隨溫度升高逐漸變性而喪失催化活性。酶作用最適溫度是這兩種效應(yīng)的綜合體現(xiàn)。圖2表明,酶的最適溫度在50~60℃。以30℃的相對酶活力為100%,在反應(yīng)液中,酶在60℃保持30 min和60 min時的相對酶活力仍保持在90.67%和85.95%,但到70℃時,酶活迅速消失。圖3表明,酶在干熱條件下穩(wěn)定性比濕熱高,超過80℃處理30 min或60 min,酶活仍保持在80%以上,顯然熱處理時間越長,酶活損失越快。因此,認(rèn)為酶在70℃以下時是穩(wěn)定的。

    圖2 濕熱對酶活力及穩(wěn)定性的影響

    圖3 干熱對酶穩(wěn)定性的影響

    2.3 金屬離子對酶活力的影響 結(jié)果如表2所示。在離子濃度較高(1×10-3mol/L)時,各種金屬離子均不同程度地抑制了酶活;在低離子濃度(1×10-4mol/L) 時,Co2+和 Mn2+對酶活力有輕微的促進(jìn)作用,Zn2+、Sn2+和Ca2+幾乎無影響。兩種濃度的Ag+和Hg2+均強(qiáng)烈抑制了酶活。

    表2 金屬離子對酶活力的影響 %

    2.4 豬消化液對酶活的影響 表3結(jié)果表明,酶經(jīng)過胃液、腸液和二者連續(xù)的處理后,酶活力較對照組均顯著下降(P<0.05),但酶活力在胃液中最高,12 h達(dá)90.74%,24 h達(dá)86.87%,可能是胃液的pH最接近該酶最適pH范圍的緣故。在小腸液或胃液+小腸液中酶活下降較快,但經(jīng)過12 h處理仍保持在70%以上。隨著時間延長各處理酶活均顯著降低(P<0.05)。由此證明α-半乳糖苷酶在動物胃腸道內(nèi)仍能較穩(wěn)定地發(fā)揮活性。

    表3 豬消化液對α-半乳糖苷酶活力及穩(wěn)定性的影響

    2.5 儲存時間對酶活的影響 固態(tài)發(fā)酵的原酶樣,經(jīng)過3、6個月和9個月的常規(guī)儲存后測定α-半乳糖苷酶活力,結(jié)果表明(見表4),在0~4℃冷藏9個月酶活力不受影響。在常溫15~30℃保存時,3月之內(nèi)酶活不受影響,但隨后活力損失顯著(P<0.05),但到6個月時仍保留有原始活力的90.30%,到9個月時有80.58%,可見酶活在儲存條件下比較穩(wěn)定,能夠適應(yīng)生產(chǎn)實(shí)際中儲存的需要。

    表4 儲存時間對酶活的影響

    3 小結(jié)

    通過對α-半乳糖苷酶粗酶制劑的理化性質(zhì)研究表明,該酶的適宜pH在酸性范圍 (3.5~6.5),適宜的溫度在70℃以下,能夠耐受豬胃腸液12 h,貨架期長。

    [1]沈同,王鏡巖.生物化學(xué)(上冊)[M].北京:高等教育出版社(第二版),1991.232~328.

    [2]張麗英.大豆寡糖對斷奶仔豬抗?fàn)I養(yǎng)作用及機(jī)理的研究:[博士學(xué)位論文][D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué),2000.

    [3]Leske,K L,Coon C N.Hydrogen gas production of broiler chicks in response to soybean meal and α -galactoside free,ethanol-extracted soybean meal[J].Poult Sci,1999,78:1313 ~ 1316.

    [4]Wang,C L,Li D F,Lu W Q,et al.Influence of cultivating conditions on the α-galactosidase biosynthesis from a novel strain of Penicillium sp.in SSF[J].Lett App Microb,2004,39:369 ~ 375.

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