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    骨肽注射液細菌內(nèi)毒素定量檢查法探討

    2010-10-18 05:26:58山西省長治市藥品檢驗所046000舒玉萍王美云
    首都食品與醫(yī)藥 2010年6期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)毒素附表試劑

    山西省長治市藥品檢驗所(046000)舒玉萍 王美云

    骨肽注射液收載于《國家藥品標準》(化學(xué)藥品地方標準上升國家標準第十六冊),標準規(guī)定其熱原檢查法為家兔法。但由于家兔法操作繁瑣,靈敏度低,不能檢測內(nèi)毒素的含量,而定量法鱟試驗可進行靈敏而準確的內(nèi)毒素定量檢測。按照《中國藥典》2005年版附錄收載的方法,采用動態(tài)濁度法建立骨肽注射液細菌內(nèi)毒素檢查方法。

    1 材料和儀器

    細菌內(nèi)毒素工作標準品(批號為150601-200859,效價為120EU·支-1,中國藥品生物制品檢定所);鱟試劑(批號為0708310,規(guī)格為1.25ml,湛江安度斯生物有限公司);細菌內(nèi)毒素檢查用水(批號為050401,規(guī)格為5ml,湛江海洋生物制品廠);骨肽注射液(批號為090501,吉林省輝南輝發(fā)制藥股份有限公司;批號為090130、090745,蚌埠宏生生化制藥廠;規(guī)格均為2ml:10mg)。BET-32M型細菌內(nèi)毒素測定儀(天津大學(xué)無線電廠),XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);反應(yīng)器皿均經(jīng)250℃2h干熱滅菌。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 細菌內(nèi)毒素限值的確立[1]按公式L=K·M-1計算,K為按規(guī)定的給藥途徑,即人用每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量,靜脈注射藥品為5EU·(kg·h)-1,M為人用每公斤體重每小時最大給藥劑量。骨肽注射液在臨床上成人一次最大給藥劑量為20ml[2],人均體重按60kg計算,因此計算出L=15EU·ml-1;最大的有效稀釋倍數(shù)MVD=cL·λ-1(動態(tài)濁度法鱟試驗:λ為標準曲線最低點濃度,λ=0.03125EU/ml,c=1ml·ml-1,MVD=480)。

    2.2 實驗方法

    2.2.1 標準曲線的制作及可靠性 細菌內(nèi)毒素檢查用水將細菌內(nèi)毒素工作標準品溶解,在漩渦混合器上混合15min后,再用細菌內(nèi)毒素檢查用水進行稀釋,使內(nèi)毒素終濃度分別為2.00、0.50、0.125、0.03125 EU·ml-1,每一步稀釋都在漩渦混合器上混合30s。各取0.3ml分別加入到預(yù)先加有0.1ml鱟試劑的反應(yīng)管中,混合均勻,插入BET-32M型細菌內(nèi)毒素測定儀進行檢測。每一濃度平行作3管,同時作陰性對照2管。實驗數(shù)據(jù)按最小二乘法進行統(tǒng)計運算,其標準曲線為LgT=2.9437-0.1300LgC,r=-0.998。其中,相關(guān)系數(shù)|r|=0.998>0.980,平行管的CV<10%,陰性對照在檢測線之外,故標準曲線有效。檢測結(jié)果見附表1。

    2.2.2 干擾試驗 骨肽注射液最大的有效稀釋倍數(shù)為480。將090501批樣品制備成10、20、40、80倍的濃度系列,每個濃度分別取0.2ml樣品加0.1ml鱟試劑作為樣品檢查(S);另外制備上述5個濃度含內(nèi)毒素0.5 EU·ml-1的系列,每個濃度分別取0.2ml加0.1ml鱟試劑作為樣品陽性對照(PPC)。將溶液分為兩組,每一濃度平行作2管,同時作陰性對照2管和陽性對照(0.5EU·ml-1)2管,插入BET-32M型細菌內(nèi)毒素測定儀進行檢測。干擾預(yù)試驗結(jié)果見附表2。結(jié)果顯示,骨肽注射液10、20倍稀釋液對鱟試劑凝集反應(yīng)具有增強作用,經(jīng)40倍、80倍稀釋的回收率均在50%~200%,經(jīng)40倍稀釋的回收率最接近100%且稀釋級低于80倍,因此可選擇樣品40倍稀釋的濃度作為日常檢查用。

    附表1 標準曲線的可靠性

    附表2 骨肽注射液干擾預(yù)試驗

    附表3 骨肽注射液干擾試驗

    為驗證骨肽注射液40倍稀釋濃度的有效性,進行了3個批號的骨肽注射液正式干擾試驗,以樣品40倍稀釋的濃度分別取0.2ml樣品加0.1ml鱟試劑作為樣品檢查(S),另制備含內(nèi)毒素0.5EU·ml-1的40倍稀釋樣品,分別取0.2ml加0.1ml鱟試劑作為樣品陽性對照組(PPC),將溶液分為兩組,每一濃度平行作2管,同時作陰性對照和陽性對照(0.5EU·ml-1)各2管,插入BET-32M型細菌內(nèi)毒素測定儀進行檢測,干擾試驗結(jié)果見附表3。結(jié)果表明,3個批號的骨肽注射液40倍稀釋濃度添加內(nèi)毒素的干擾試驗回收率均在50%~200%,對鱟試驗無干擾作用。

    2.2.3 對比試驗 通過對三個批號的骨肽注射液進行檢查,并且與熱原檢查結(jié)果對比,均符合規(guī)定,表明定量檢查和熱原檢查結(jié)果相吻合。

    3 討論

    反應(yīng)時間是動態(tài)濁度法進行定量測定的重要參數(shù),標志著鱟試劑反應(yīng)的快慢和樣品中細菌內(nèi)毒素的含量多少,該實驗用OD限值法。動態(tài)濁度法干擾試驗,是以樣品中添加內(nèi)毒素用平均回收率來判斷,回收率應(yīng)在50%~200%,表明樣品溶液對鱟試劑反應(yīng)無干擾影響。

    本實驗選擇的標準曲線是4倍稀釋法,濃度范圍是2EU/ml~0.03125EU/ml,實驗一般選擇標準曲線中間濃度或曲線上的濃度,本實驗以0.5EU/ml作為樣品陽性管外加內(nèi)毒素值。

    在設(shè)置的系列樣品溶液中,有兩個濃度在50%~200%,選擇最接近100%的回收率且低稀釋級作為最佳檢測濃度。動態(tài)濁度定量法檢測具有方便、快捷、定量、可以動態(tài)觀察反應(yīng)過程、干擾因素少等優(yōu)點,適合應(yīng)用和推廣。

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