Kit和KitL在卵泡發(fā)育過程中的作用

左 通，成佳興

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

在哺乳動物中，卵巢是重要的雌性生殖器官，主要由各級卵泡和黃體構(gòu)成。在卵泡發(fā)育過程中，卵泡由原始卵泡發(fā)育成為初級卵泡、次級卵泡、三級卵泡和成熟卵泡。卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)機制目前仍不明確，因此進一步地闡述卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)機制對基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用都很重要，有助于因異常卵泡募集和發(fā)育而引起的不育癥的治療、避孕藥物的研發(fā)、輔助生殖技術(shù)等方面。酪氨酸激酶受體Kit和其配體KitL分別在卵母細胞和顆粒細胞中表達，并在卵泡發(fā)育中發(fā)揮重要作用[1]。本文就Kit和KitL在卵泡發(fā)育中的作用及其作用機制做一綜述。

1 Kit和KitL的概況

Kit是976個氨基酸的蛋白，屬于跨膜酪氨酸激酶受體家族III型，其成熟蛋白的分子量為125～160kDa。Kit的配體 KitL（KIT LIGAND，stem cell factor，SCF）是248個氨基酸的單體，其中189個氨基酸在胞外域，23個氨基酸在跨膜部分，36個氨基酸在胞質(zhì)區(qū)。KitL存在兩種不同的形式，可溶性KitL（KitL1）和膜結(jié)合KitL（KitL2）[2]。Kit和KitL在造血干細胞和肥大細胞的維持和生存上起作用。Kit和KitL還在配子形成、黑素形成、血細胞形成過程中起重要作用[3]。Kit和KitL分別由steel和white spotting基因編碼，這兩個位點突變的小鼠可以證明，Kit和KitL在PGCs的生存、遷移、增殖，以及卵泡的發(fā)育中起作用[4]。KitL通過與Kit結(jié)合，激活了調(diào)節(jié)細胞凋亡的信號通路，并激活了PI3K通路，PI3K通路在卵母細胞生長中起重要的調(diào)節(jié)作用。

2 Kit-KitL在PGCs遷移和增殖過程中的表達和作用

在小鼠胚胎中，在PGCs遷移方向的體細胞上檢測到KitL蛋白，且KitL的表達水平隨著接近生殖嵴而逐漸增加，PGCs一旦定位在生殖嵴上（胚胎期12.5 d），KitL mRNA的表達也會隨著遷移的停止而被限制在性腺中[5]。因此，KitL可能是指導(dǎo)PGCs定向遷移到生殖嵴的分子之一。在Kit基因突變的小鼠胚胎中，發(fā)現(xiàn)PGCs推遲遷移，并遠離正常的遷移路徑，異常地停滯和凝集在后腸中[6]。這些結(jié)果表明了KitL/Kit相互作用可能有利于指引PGCs遷移的方向。

Kit和KitL在PGCs增殖中起重要作用。在編碼Kit基因和KitL基因雙突變的小鼠中，PGCs的數(shù)量減少。最近研究表明，KitL在PGCs增殖中的作用可能依賴于KitL1/KitL2復(fù)合物的平衡。在體外培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，當KitL2缺乏時，KitL1與成纖維生長因子（FGF）相互作用來促進PGCs的增殖。相反，當KitL2存在時，KitL1抑制FGF誘導(dǎo)的PGCs的增殖。此外，Zama等人用在steel位點等位基因突變的方法證明:KitL對遷移前后的PGCs增殖起不同的作用。該研究結(jié)果表明：在遷移前，PGCs在后腸的增殖過程中部分需要KitL，而PGCs一旦從后腸中遷移出后，PGCs的增殖則完全需要KitL[6]。

3 Kit-KitL在卵泡發(fā)育中的作用

在小鼠卵巢中，Kit在膜細胞和卵母細胞中表達，而KitL在顆粒細胞中表達。Kit在卵子發(fā)生時期的卵原細胞有絲分裂過程中大量表達，并且在卵母細胞發(fā)育的所有時期都表達。KitL mRNA在早期有腔卵泡的顆粒細胞中表達很高，在后期有腔卵泡的顆粒細胞中表達下降。卵母細胞與顆粒細胞之間存在著重要的相互作用。卵母細胞在生長、增殖、成熟和受精的全過程中始終與顆粒細胞通過間隙連接保持著聯(lián)系，這種聯(lián)系對卵母細胞和顆粒細胞的生長和增生都很重要。因此，Kit和KitL這一對受體-配體的相互作用，在卵母細胞和顆粒細胞的相互作用中也有著重要的意義。

3.1 Kit-KitL在原始卵泡的激活和卵泡生長過程中的作用

有關(guān)原始卵泡激活的機制還不清楚，目前認為原始卵泡的激活是自發(fā)的。Parrott和Skinner認為KitL對體外培養(yǎng)的大鼠卵巢的原始卵泡的自發(fā)激活是重要的，然而小鼠卵巢的體外培養(yǎng)表明原始卵泡的自發(fā)激活只能部分地被KitL的抗體抑制。在近年的研究中，采用基因敲入的方法使KitY719F突變，純合KitY719F突變體雌性小鼠完成了原始卵泡激活并且是可育的，但發(fā)現(xiàn)原始卵泡衰竭加快，異常形態(tài)的初級/次級卵泡積累。這些結(jié)果表明，Kit在維持原始卵泡儲量和初級向次級卵泡的過渡中起作用，但在原始卵泡激活中不是必要的[7]。

現(xiàn)已證明KitL可促進卵母細胞生長。Klinger和DeFelici從交配后15.5～16.5d的小鼠胚胎中收集直徑約10μm的裸露的卵母細胞，并在不同條件下培養(yǎng)。在KitL的存在下培養(yǎng)4d，卵母細胞生長到19μm，幾乎是空白對照組的2倍。添加起中和作用的Kit的抗體ACK-2后，卵母細胞生長受阻，表明KitL能促進卵母細胞的早期生長，誘導(dǎo)早期卵泡的發(fā)育。但4 d后卵母細胞不再繼續(xù)生長，而將這些卵母細胞培養(yǎng)在顆粒細胞中3 d后，卵母細胞的直徑增加到42 μm。發(fā)現(xiàn)添加KitL的卵母細胞生長比不添加KitL的顯著，添加ACK-2后，這種差異減弱，但沒有完全阻止卵母細胞生長，即KitL并不能單獨促進卵母細胞后期的生長發(fā)育。該結(jié)果表明KitL在卵母細胞發(fā)育的不同時期起不同的作用[8]。

有證據(jù)證明Kitl2在卵母細胞生長中起關(guān)鍵作用。Thomas FH等人用KitL1或KitL2構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染到缺乏KitL的成纖維細胞中。從12天的小鼠中分離出生長的卵母細胞，并將其培養(yǎng)在被轉(zhuǎn)染的成纖維細胞中2天。發(fā)現(xiàn)卵母細胞僅在產(chǎn)生KitL2的成纖維細胞的存在下生長，并且抑制KitL2的表達使卵母細胞生長受損。此外，KitL2使Kit表達上調(diào)并抑制了自發(fā)的GVBD。這些結(jié)果表明與KitL1相比，KitL2是調(diào)節(jié)卵母細胞生長和發(fā)育的主要亞型[9]。

3.2 Kit-KitL在卵母細胞成熟中的作用

Ismail等人將Kit反義核苷酸注射到處于減數(shù)分裂停滯的大鼠卵母細胞中，結(jié)果卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂的能力增加。在體外培養(yǎng)的卵母細胞中添加KitL后，卵母細胞減數(shù)分裂會瞬時停止[4]。表明了Kit/KitL在卵母細胞生長中可能起維持減數(shù)分裂停滯的作用。

YE Y等人用DNA微點陣法分析了小鼠卵巢中的轉(zhuǎn)錄子，鑒定出KitL受LH/HCG峰的刺激，并在卵母細胞成熟中起促進作用。將卵泡，卵丘-卵母細胞復(fù)合體（COC）進行體外培養(yǎng)：HCG處理4 h后，發(fā)現(xiàn)KitL蛋白主要在排卵前卵泡和小有腔卵泡的顆粒細胞中表達，表明了顆粒細胞中的KitL受HCG的刺激；卵泡的體外培養(yǎng)證明了KitL的處理以劑量依賴的方式促進了第一極體的排出，且cyclinB1合成增加，其中cyclinB1對GVBD后的減數(shù)分裂進程是重要的。該實驗結(jié)果表明KitL通過促進第一極體的排出，在排卵前的卵母細胞的成熟中起作用[10]。

4 Kit-KitL在卵泡發(fā)育過程中的作用機制

KitL結(jié)合到Kit上，Kit胞質(zhì)區(qū)尾部的激酶區(qū)激活，并導(dǎo)致一系列胞內(nèi)蛋白磷酸化，信號進一步傳導(dǎo)使RAS，RAF，MAPK等因子激活，從而調(diào)節(jié)細胞凋亡的信號通路[2]。KitL的刺激也導(dǎo)致了PI3K的激活，PI3K在細胞增殖和生存中起重要作用。另外，一些生長因子，例如Activin和FGF7，也通過Kit/KitL通路介導(dǎo)。其中Activin在卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)中起自分泌和旁分泌的作用，并且是FSH合成和分泌的重要的調(diào)節(jié)者。在原始卵泡形成時期，Activin對生殖細胞的增殖和生存通過Kit/KitL通路介導(dǎo)[11]。Kit的抑制劑減弱了FGF7刺激卵母細胞生長的作用，表明FGF7可能通過Kit/KitL通路調(diào)節(jié)卵母細胞的生長[12]。總之，與Kit/KitL有關(guān)的這些信號通路，在卵泡發(fā)育過程中都起著重要的作用。

4.1 卵母細胞中的Kit-PI3K通路

PI3K是脂酶的一個家族，它可磷酸化磷脂類肌醇的3’-OH。PI3K是由催化亞基p110和調(diào)節(jié)亞基p85構(gòu)成的異二聚體。PI3K通路是一個經(jīng)典的信號通路，包含多種信號分子，建立了調(diào)節(jié)細胞增殖、生存、遷移和代謝的胞內(nèi)多級信號通路。

最新實驗證明了PI3K通路的組件包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Akt）和Foxo3a（叉頭轉(zhuǎn)錄因子，forkhead box O3a）、糖元合成酶激酶 3（Glycogen Synthase Kinase 3，GSK3）、P27[13]（圖1）。PI3K通路可在體細胞和癌細胞中被Kit激活。Kit在細胞質(zhì)區(qū)域內(nèi)募集PI3K到細胞膜上，并激活PI3K。PI3K被Kit激活后，磷酸化PIP2產(chǎn)生PIP3，然后PIP3從胞質(zhì)募集包含脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白，例如丙酮酸脫氫酶激酶-同工酶 1（3-Phosphoinositide-Dependent Kinase-1，PDK-1）和 AKT（圖 1）。Akt隨后被 PDK-1在蘇氨酸308位點磷酸化而激活。激活的Akt包含多種底物，其中包括cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein ，CREB），BAD和p27，它們可調(diào)節(jié)細胞生存和細胞周期的進入（圖1）。Akt可磷酸化Foxo3a并使其在質(zhì)膜上定位，而未磷酸化的Foxo3a會重新定位在細胞核上，作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)凋亡和細胞周期停滯。Akt可在蘇氨酸187位點直接磷酸化p27，并誘發(fā)p27從細胞核穿梭到細胞質(zhì)，從而解除了p27抑制細胞周期和細胞生長的作用。Akt磷酸化GSK-3使其失活而促進糖元合成。Akt還可通過直接磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 （mammalian target of rapamycin，mTOR），mTOR通過激活p70核糖體 S6蛋白激酶（p70 ribosomal S6 kinase，p70S6k）和抑制4E結(jié)合蛋白1（4E-EP1）從而在細胞生長中起作用[14]；其中p70S6k是核糖體70s亞基S6蛋白激酶，4E-EP1是真核起始因子，它們可直接調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯（圖1）?？傊せ畹腒it-PI3K通路不僅促進細胞周期和細胞生長，還促進糖元合成和蛋白質(zhì)翻譯，直接促進卵母細胞生長，增強卵母細胞分泌的能力。

4.2 Kit-KitL-PI3K通路在卵母細胞生長的作用

圖1 Kit誘發(fā)激活的PI3K通路[15]

用KitL處理體外培養(yǎng)的卵母細胞，不僅使Akt激活和磷酸化，并導(dǎo)致Foxo3a以及GSK3α和GSK3β的磷酸化。特異的PI3K抑制劑LY294002使Akt和Foxo3a以及GSK3α和GSK3β的磷酸化受抑制。這表明了Kit誘導(dǎo)的PI3K通路是通過KitL-Kit-PI3K-Akt-Foxo3a和KitL-Kit-PI3K-AKT-GSK3途徑傳導(dǎo)的[15]。由于在原始卵泡和初級卵泡中的生長的卵母細胞中，PI3K通路中的信號不斷地發(fā)生激活放大，因此Kit下游的PI3K通路對卵母細胞生長是重要的。

4.3 Kit-KitL-PI3K通路在卵母細胞凋亡中的作用

在近來的研究中，體外培養(yǎng)新生大鼠卵巢中的卵母細胞和初級卵泡，并檢測了卵母細胞凋亡中Foxo3a的促凋亡作用以及潛在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在初級卵泡的卵母細胞中，KitL通過PI3K/AKT啟動了從Kit到Bcl-2家族成員的抗凋亡通路。在卵母細胞培養(yǎng)中，KitL不影響Foxo3a蛋白質(zhì)的總水平，但迅速提高了Foxo3a的磷酸化水平。磷酸化的Foxo3a增加抑制了卵母細胞凋亡。PI3K/Akt的抑制劑LY294002解除了Foxo3a的磷酸化和KitL的抗凋亡作用。這些結(jié)果表明Foxo3a與新生的大鼠卵巢中的卵母細胞凋亡有關(guān)，且KitL-PI3K-Akt-Foxo3a介導(dǎo)了卵母細胞凋亡的信號通路[16]。

5 結(jié)語

Kit和KitL在PGCs的生存、遷移、增殖，以及卵子發(fā)生和早期卵泡發(fā)育過程中起重要作用。Kit下游的PI3K通路對原始卵泡積累，初級向次級卵泡的過渡，卵母細胞生長和凋亡是重要的。

Kit在卵母細胞中表達停止的原因和KitL在早期卵泡中卵母細胞生存上的作用機制還不清楚。深入研究Kit和KitL在卵泡發(fā)育中的調(diào)控機制，對探討卵母細胞與顆粒細胞之間對話的分子基礎(chǔ)和闡述卵泡發(fā)育障礙性疾病的發(fā)病機制有重要意義。

[1] Karla J，Hutt，Eileen A，et al.KIT/KITLigand in Mammalian Oogenesis and Folliculogenesis:Roles in Rabbit and Murine Ovarian Follicle Activation and Oocyte Growth[J].BiologyOf Reproduction，2006，75:421-433.

[2] FionaHThomas，BarbaraCVanderhyden .Oocyte- granulosacell interactions during mouse follicular development:regulation ofkit ligand expression and its role in oocyte growth[J].ReproductiveBiologyand Endocrinology，2006，4:19- 26.

[3] Ray P，Krishnamoorthy N，Ray A. Emerging functions ofc- kit and its ligand stem cell factor in dendritic cells:regulators ofTcell differentiation[J].CellCycle，2008，7（18）:2826- 32.

[4] K J Hutt，E A McLaughlin，M K Holland.Kit ligand and c-Kit have diverse roles during mammalian oogenesis and folliculogenesis[J].Molecular Human Reproduction，2006，12（2）:61-69.

[5] Marc-Antoine Driancourt et al.Roles of KIT and KIT LIGAND in ovarian function[J].Reviews of Reproduction，2000，5:143-152.

[6] ZamaAM，Hudson FP，BedellMA. Analysis ofHypomorphicKitlSl Mutants Suggests Different Requirements for KITL inProliferation andMigration ofMousePrimordialGermCells[J].Biol Reprod，2005，73:639- 647.

[7] John GB. Kit Signaling via PI3K promotes ovarian folliclematuration but is dispensable for primordial follicle activation[J].DevBiol.，2009，331（2）:292- 9.

[8] F G Klinger，MD Felici.In Vitro Development of Growing Oocytes from FetalMouse Oocytes:Stage-Specific Regulation by Stem Cell Factor and Granulosa Cells[J].Dev Biol.，2002，244:85-95.

[9] Thomas F H.Kit ligand 2 promotes murine oocyte growth in vitro[J].BiolReprod.，2008，78（1）:167-75.

[10] Ye Y. Kit ligand promotes first polar body extrusion ofmousepreovulatory oocytes [J].Reprod Biol Endocrinol，2009，7:26- 35.

[11] Coutts SM. Activin signals via SMAD2/3 between germ andsomatic cells in the human fetal ovaryand regulates kit ligandexpression[J].DevBiol ，2008，314（1）:189- 99.

[12] ChoJ H.Fibroblastgrowth factor 7 stimulates in vitrogrowth ofoocytes originatingfrombovine earlyantral follicles[J].Mol ReprodDev，2008，75（12）:1736-43.

[13] Kui Liu. Stem cell factor （SCF）- Kit mediatedphosphatidylinositol 3 （PI3）kinase signaling duringmammalian oocyte growth and earlyfollicular development[J].Frontiers inBioscience，2006，11:126- 135.

[14] Lian J. The mammalian target of rapamycin pathway and itsrole inmolecular nutrition regulation [J].MolNutr Food Res.，2008，52（4）:393- 9.

[15] Liu L. Phosphorylation and inactivation ofglycogen synthasekinase- 3 by soluble kit ligand in mouse oocytes during earlyfollicular development [J].J Mol Endocrinol. ，2007，38（1- 2）:137- 46.

[16] Liu H. FOXO3a is involved in the apoptosis ofnaked oocytesand oocytes of primordial follicles fromneonatal rat ovaries[J].Biochem Biophys Res Commun，2009，381（4）:722- 7.