磁分離儀分離磁性細(xì)菌的新方法

劉新星，郭寧，楊英杰，梁萬(wàn)潔，張劍

中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，長(zhǎng)沙 410083

磁分離儀分離磁性細(xì)菌的新方法

劉新星，郭寧，楊英杰，梁萬(wàn)潔，張劍

中南大學(xué)資源加工與生物工程學(xué)院，長(zhǎng)沙 410083

磁性細(xì)菌胞內(nèi)可以產(chǎn)生磁性顆粒，因此具有趨磁性，基于這種特性，利用磁分離的原理，本研究開(kāi)發(fā)了一種磁性細(xì)菌分離儀，提供了一種分離磁性細(xì)菌的新方法。以氧化亞鐵硫桿菌為例，使用磁性細(xì)菌分離儀進(jìn)行分離，可以得到強(qiáng)磁菌和弱磁菌。利用透射電鏡觀察，強(qiáng)磁菌胞內(nèi)磁性顆粒明顯多于弱磁菌；半固體平板磁泳實(shí)驗(yàn)也表明強(qiáng)磁菌趨磁性明顯強(qiáng)于弱磁菌。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明磁性細(xì)菌分離儀可以有效地分離磁性細(xì)菌，這是一種分離磁性細(xì)菌的新方法，將促進(jìn)磁性細(xì)菌分離培養(yǎng)的研究。

磁性細(xì)菌，細(xì)菌磁分離，磁性細(xì)菌分離儀

Abstract:A magnetic separator was used to separate magnetic bacteria based on their magnetotactic characteristics.Acidithiobacillus ferrooxidans, a bacterium that could synthesize intra-cellular nanometer magnetic particles, was investigated as an example.Strong magnetic and weak magnetic cells were separated and collected.On average, the number of the magnetic particles present in the strong magnetic cells is more than that of the weak magnetic cells.Moreover, semisolid-plate magnetophoresis showed that the magnetotaxis of strong magnetic cells was stronger than the weak magnetic cells.These results suggest that the magnetic separator can be used to isolate the magnetic bacteria, which will facilitate the research of magnetic bacteria.

Keywords:magnetic bacteria, magnetic separation of bacteria, magnetic separator

氧化亞鐵硫桿菌是生物冶金[1]中的重要細(xì)菌之一，能以亞鐵、硫元素以及低價(jià)硫化物作為能源，為好氧菌，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單。本課題組在研究磁黃鐵礦選育浸礦細(xì)菌的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)氧化亞鐵硫桿菌胞內(nèi)能夠生成磁性顆粒[2]，因此在磁場(chǎng)作用下有微弱的趨磁性，并且破碎細(xì)胞后提取到了能夠響應(yīng)磁場(chǎng)的磁性顆粒。經(jīng)反復(fù)研究發(fā)現(xiàn)，氧化亞鐵硫桿菌體內(nèi)的磁性顆粒數(shù)量不多，且沒(méi)有成鏈排布，因此其趨磁性比較弱。本研究把所有胞內(nèi)含有天然生成的磁性顆粒，可以在磁場(chǎng)作用下產(chǎn)生趨磁性泳動(dòng)的一類(lèi)細(xì)菌統(tǒng)稱(chēng)為磁性細(xì)菌。使用液體[2]和固體平板磁泳[3]的方法分離磁性細(xì)菌時(shí)，時(shí)間長(zhǎng)，處理量小，分離效果受到限制。為此，本研究開(kāi)發(fā)了一種新的磁性細(xì)菌分離儀，采用磁分離的方法分選磁性細(xì)菌。以氧化亞鐵硫桿菌為樣品進(jìn)行磁分離后，顯微鏡觀察、透射電鏡觀察和半固體平板磁泳結(jié)果都說(shuō)明這是一種有效的磁性細(xì)菌分離方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

氧化亞鐵硫桿菌Acidthiobacillus ferrooxidans，從云南東川某酸性礦坑水中分離得到，現(xiàn)保存于中南大學(xué)生物冶金教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

將菌種培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，10 000 r/min離心收集菌體，用pH 2.0硫酸反復(fù)懸浮、離心，除去鐵釩，滴在載玻片上，用磁鐵在不同方向?qū)ζ涫┘哟艌?chǎng)鏡檢，有的細(xì)胞會(huì)緩慢游向磁鐵S極，有的細(xì)胞只是隨磁鐵來(lái)回振動(dòng)，還有細(xì)胞對(duì)磁場(chǎng)沒(méi)有反應(yīng)。由此判斷該菌種可以由磁分離的方法來(lái)分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

9K液體培養(yǎng)基[6](g/L)：(NH4)2SO43.00，KCl 0.10，K2HPO40.50，MgSO4·7H2O 0.50，Ca(NO3)20.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 44.7，pH 2.0。

ISP半固體培養(yǎng)基由3部分組成，A液：FeSO4·7H2O 33.4 g/L，用無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾；B液(g/L)：(NH4)2SO44.00，KCl 0.20，MgSO4·7H2O 1.00，Ca(NO3)20.02；C液：瓊脂3 g/L，pH 3.0。

1.1.3 儀器與設(shè)備

自行開(kāi)發(fā)的磁性細(xì)菌分離儀，Galen III型顯微鏡，HZQ-C空氣浴振蕩器，PHS-3C酸度計(jì)，HT201高斯計(jì)，TDL-5A離心機(jī)，HL-4恒流泵，VP50真空泵。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)備組成

磁性細(xì)菌分離儀的磁分離系統(tǒng)由電磁鐵部分、分離通道和恒流泵組成。

電磁鐵部分(工程純鐵極頭)的線圈通以直流電流(0～3 A電流)，從而產(chǎn)生磁場(chǎng)。磁性顆粒為偶極粒子，在勻強(qiáng)磁場(chǎng)中受力為零，故必須采用非勻強(qiáng)磁場(chǎng)才能分離。本強(qiáng)磁分離儀分離空間由一對(duì)相對(duì)但不平行的磁極面組成，如圖1所示。雙曲線形狀的磁極面產(chǎn)生的磁場(chǎng)是梯度分布的，因此對(duì)于處在其中的磁性顆粒產(chǎn)生磁力作用。這個(gè)空間中磁性顆粒除了受垂直方向的重力和浮力外，最主要的力是平行方向上的磁力和粘滯阻力。磁力的方向(Fm)指向磁力線密集的一邊，當(dāng)磁力足夠大時(shí)，就可以使通過(guò)的磁性顆粒偏移，達(dá)到磁分離的目的。

圖1 磁極頭截面示意圖Fig.1 The sketch map of magnetic pole.

分離通道是磁分離系統(tǒng)的主要部分，由塑料管制成，置于電磁鐵兩極形成的分離空間之內(nèi)。有一個(gè)入口和兩個(gè)出口，入口連接著恒流泵。通過(guò)的磁性顆粒在磁場(chǎng)的作用下，向一側(cè)偏移。分離通道設(shè)計(jì)成為細(xì)長(zhǎng)管道，通過(guò)磁場(chǎng)的管道長(zhǎng)度與管道寬度之比L/W?1，有利于提高分離效率。

恒流泵可以控制載有磁性顆粒的懸液流量，本實(shí)驗(yàn)采用的流量為372 mL/h。

1.2.2 細(xì)胞懸液樣品制備

所用菌株采自云南東川某酸性礦坑水中，使用9K培養(yǎng)基多次富集。細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，通過(guò)0.22 μm微孔濾膜抽濾，用pH 2.0的稀硫酸沖洗濾膜表面，得到細(xì)胞懸液。將得到的細(xì)胞懸液用10 000 r/min離心收集菌體，再用pH 2.0的稀硫酸懸浮，反復(fù)離心、懸浮，直至收集到的細(xì)胞不含鐵礬沉淀為止。進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，用pH 2.0稀硫酸把菌體稀釋成不同濃度的細(xì)胞懸液。

1.2.3 細(xì)胞磁分離

在實(shí)驗(yàn)之前，整個(gè)通道使用75%乙醇消毒，再使用蒸餾水沖洗干凈，最后使用pH 2.0 H2SO4潤(rùn)洗。然后泵入樣品懸液，打開(kāi)電磁鐵電源，待流體穩(wěn)定之后，分別收集兩個(gè)出口流出的液體即可。含有磁性顆粒的菌體在磁場(chǎng)作用下發(fā)生偏移，從而導(dǎo)致從兩個(gè)出口流出的菌懸液的濃度會(huì)發(fā)生變化，在顯微鏡下分別用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù) 3次，取平均值。

1.2.4 趨磁性觀察[3]

取培養(yǎng)好的細(xì)菌在半固體平板中央接種，于30℃生化培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)，在由永久磁鐵產(chǎn)生的人工磁場(chǎng)中生長(zhǎng)，人工磁場(chǎng)方向平行于地磁場(chǎng)方向，培養(yǎng)數(shù)天后觀察菌斑生長(zhǎng)情況。以不加人工磁場(chǎng)僅在地磁場(chǎng)下培養(yǎng)作為空白對(duì)照。

1.2.5 透射電鏡觀察

將分離后得到的兩種菌懸液離心收集菌體，用磷酸緩沖液(PBS，pH 6.7)清洗，經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋后做超薄切片，置于透射電鏡(JEM1230，電壓80 kV)下觀察菌體內(nèi)磁性顆粒數(shù)量的變化。

2 結(jié)果

2.1 設(shè)備磁場(chǎng)的分布

為了直觀表示磁極磁場(chǎng)的分布，首先使用磁場(chǎng)模擬軟件FEMM4.2(http://femm.foster-miller.net)模擬這種磁極(切面)產(chǎn)生的磁場(chǎng)二維平面分布，如圖2所示。從磁場(chǎng)的模擬圖中可以清楚地看出出口 a處和出口b處兩點(diǎn)之間磁場(chǎng)的梯度分布。出口a處磁場(chǎng)線比出口 b處密集，磁性顆粒受力方向與磁場(chǎng)梯度方向相同，所以應(yīng)該可以從出口 a處收集得到含磁性顆粒相對(duì)多的細(xì)菌，稱(chēng)為強(qiáng)磁菌，從出口 b處收集得到含磁性顆粒相對(duì)少的細(xì)菌，稱(chēng)為弱磁菌。

使用高斯計(jì)測(cè)量磁分離儀的磁場(chǎng)實(shí)際分布情況，分離空間的磁場(chǎng)符合軟件模擬的分布。當(dāng)線圈的電流為3 A時(shí)，出口a處的磁場(chǎng)強(qiáng)度可達(dá)1460 mT，出口b處的磁場(chǎng)強(qiáng)度為1000 mT，水平方向的磁場(chǎng)梯度為18.4 T/m。本磁分離儀可以產(chǎn)生的磁場(chǎng)要遠(yuǎn)強(qiáng)于普通靜磁塊的磁場(chǎng)。強(qiáng)的高梯度磁場(chǎng)對(duì)于分離趨磁性很弱的磁性細(xì)菌是非常有利的。

2.2 細(xì)胞的磁分離

對(duì)照實(shí)驗(yàn) M1是將細(xì)胞懸液在不加磁場(chǎng)的情況下通過(guò)分離通道。實(shí)驗(yàn)M2、M3和M4則加了分離磁場(chǎng)(電磁鐵通以3 A電流)。實(shí)驗(yàn)M2是將細(xì)胞懸液進(jìn)行初次磁分離，在出口a和b處分別收集到強(qiáng)磁菌和弱磁菌；實(shí)驗(yàn) M3是將得到的強(qiáng)磁菌進(jìn)行再次磁分離；實(shí)驗(yàn) M4是將得到的弱磁菌進(jìn)行再次磁分離。所有實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞懸液的流量都控制為372 mL/h(恒流泵電壓為 1.2 V)。使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS13.0對(duì)磁分離后細(xì)胞懸液的濃度變化進(jìn)行均值比較和方差分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖2 磁分離儀磁極磁場(chǎng)分布圖Fig.2 Two-dimensional simulation of the magnetic field generated by the poles.a: location of outlet a; b: location of outlet b.

表1 磁分離細(xì)胞懸液濃度變化及方差分析結(jié)果(n=3)Table 1 Result of the magnetic separation and the variance analysis(n=3)

由結(jié)果可以看出，不加磁場(chǎng)的實(shí)驗(yàn) M1中，P＞0.05，兩個(gè)出口得到的細(xì)胞懸液濃度沒(méi)有顯著差異。施加了外磁場(chǎng)之后，實(shí)驗(yàn) M2中，P＜0.05，分離結(jié)果有顯著差異，且出口 a得到的細(xì)胞懸液濃度明顯大于出口 b處得到的細(xì)胞懸液，這說(shuō)明含有磁性顆粒的細(xì)胞在磁場(chǎng)作用下發(fā)生了偏移。為了進(jìn)一步證明這一點(diǎn)，把得到的強(qiáng)磁菌液和弱磁菌液分別進(jìn)行第 2次磁分離。結(jié)果，強(qiáng)磁菌液的分離效果與第1次分離結(jié)果類(lèi)似(M3)，P＜0.05，分離結(jié)果有顯著差異；而弱磁菌液分離后細(xì)胞濃度沒(méi)有發(fā)生明顯變化(M4)，P＞0.05，分離結(jié)果沒(méi)有顯著差異，這是因?yàn)榻?jīng)過(guò)第 1次分離后，其中含有磁性顆粒的細(xì)胞以及細(xì)胞中的磁性顆粒數(shù)都減少了，這一點(diǎn)也可由透射電鏡結(jié)果所驗(yàn)證。

2.3 透射電鏡觀察

10 000 r/min下高速離心，分別收集強(qiáng)磁菌液和弱磁菌液菌體，用磷酸緩沖液(pH 6.7)清洗，經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋后制作超薄切片，使用透射電鏡觀察，結(jié)果見(jiàn)圖3。圖中黑色電子致密體是磁性顆粒，在本課題組前期的工作中，使用能譜分析顯示，該磁性顆粒主要由Fe和O兩種元素組成[3]。

從圖中可以看出，經(jīng)磁分離儀分離后，強(qiáng)磁菌和弱磁菌磁性顆粒含量有一定差別。在電鏡下選取輪廓完整的細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)胞內(nèi)與細(xì)胞背景區(qū)別明顯、且直徑在20～90 nm范圍內(nèi)的黑色電子致密體數(shù)量，結(jié)果見(jiàn)表 2。統(tǒng)計(jì)每個(gè)含有磁性顆粒的細(xì)胞內(nèi)的磁性顆粒數(shù)量，進(jìn)行頻數(shù)分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 強(qiáng)磁菌和弱磁菌的透射電鏡照片(A：強(qiáng)磁菌，在出口a處收集；B：弱磁菌，在出口b處收集)Fig.3 Transmission electron micrograph of thin sectioned cells.(A)Strong magnetic cells collected at outlet a.(B)Weak magnetic cells collected at outlet b.

表2 氧化亞鐵硫桿菌胞內(nèi)磁性顆粒數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 Statistical results of magnetic particles in the A.f cells

從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，強(qiáng)磁菌胞內(nèi)磁性顆粒數(shù)量明顯多于弱磁菌。強(qiáng)磁菌平均每個(gè)細(xì)胞含有4顆磁性顆粒，84.21%的細(xì)胞含有磁性顆粒，多數(shù)細(xì)胞含有2～5顆，最多可達(dá)18顆；弱磁菌平均每個(gè)細(xì)胞含有2顆磁性顆粒，65.79%的細(xì)胞含有磁性顆粒，多數(shù)細(xì)胞只含有1顆，最多只有9顆。經(jīng)磁分離儀分離后，含磁性顆粒的細(xì)胞的比例發(fā)生了明顯變化，這說(shuō)明磁分離儀可以分離出含磁性顆粒多的細(xì)胞。

2.4 趨磁性觀察

半固體平板磁泳結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出，強(qiáng)磁菌在強(qiáng)外磁場(chǎng)的作用下，明顯向磁鐵一側(cè)運(yùn)動(dòng)，相比之下，在相同的外磁場(chǎng)中，弱磁菌的趨磁運(yùn)動(dòng)沒(méi)有強(qiáng)磁菌明顯。而不加外磁場(chǎng)的情況下，細(xì)菌僅在地磁場(chǎng)作用下沒(méi)有明顯的趨磁運(yùn)動(dòng)。這是因?yàn)檠趸瘉嗚F硫桿菌中磁性顆粒數(shù)量較少，且分散在菌體內(nèi)部，沒(méi)有成鏈排列，地磁場(chǎng)對(duì)它的作用不能抵消菌體本身的熱運(yùn)動(dòng)。但是當(dāng)胞內(nèi)磁性顆粒數(shù)量足夠多時(shí)，當(dāng)外加磁場(chǎng)達(dá)到一定強(qiáng)度后，氧化亞鐵硫桿菌仍然會(huì)產(chǎn)生趨磁運(yùn)動(dòng)。半固體平板磁泳的結(jié)果也同樣說(shuō)明采用磁分離儀分離強(qiáng)趨磁性的細(xì)菌是可行的。

圖4 每個(gè)含有磁性顆粒的細(xì)胞內(nèi)的磁性顆粒數(shù)量頻數(shù)分析圖Fig.4 Frequencies statistics of magnetic particles numbers in the cells containing the magnetic particles.(A)Strong magnetic cells.(B)Weak magnetic cells.

圖5 半固體平板磁泳照片F(xiàn)ig.5 Photograph of semisolid-plate magnetophoresis.(A)Strong magnetic cells in the artificial magnetic field.(B)Weak magnetic cells in the artificial magnetic field.(C)Cells in the geomagnetic magnetic field.

3 討論

納米級(jí)磁性顆粒在生物技術(shù)、信息存儲(chǔ)[5]、傳感技術(shù)[6]、醫(yī)療衛(wèi)生[7]、廢水處理[8]和環(huán)境磁學(xué)[9]等方面都有廣泛的應(yīng)用前景。因此，磁性細(xì)菌的相關(guān)研究有著非常重要的理論和實(shí)際價(jià)值。迄今為止，人們?cè)诤芏辔锓N中發(fā)現(xiàn)了由生物礦化作用產(chǎn)生的鐵磁性物質(zhì)，主要都是磁鐵礦顆粒。氧化亞鐵硫桿菌胞內(nèi)生成的磁性顆粒同樣是生物礦化作用[10-11]的結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)室在研究中發(fā)現(xiàn)在嗜鐵鉤端螺旋菌胞內(nèi)也可能生成相似的磁性顆粒，類(lèi)似的生物礦化作用很可能存在于多種浸礦細(xì)菌中，將是未來(lái)研究的重點(diǎn)方向之一。但是類(lèi)似的磁性細(xì)菌趨磁性都非常微弱，其分離成為制約研究的瓶頸，急需開(kāi)發(fā)有效的分離方法。

目前，生物物質(zhì)的磁分離方法有很多種，如簡(jiǎn)單磁泳分離[6]、微芯片磁泳分離[12]和磁性分流薄層分級(jí)[13]等。但是對(duì)于類(lèi)似氧化亞鐵硫桿菌這樣弱趨磁性的細(xì)菌，上述磁分離方法都不甚理想。針對(duì)氧化亞鐵硫桿菌，本課題組在前期工作中采用了液體磁泳和固體平板磁泳方法，取得了比較好的效果。但是這兩種磁泳方法仍然不能滿(mǎn)足實(shí)際培養(yǎng)的需要。液體磁泳和固體平板磁泳使用的都是靜磁塊，靜磁塊的磁場(chǎng)強(qiáng)度有限，且磁場(chǎng)分布沒(méi)有經(jīng)過(guò)特殊設(shè)計(jì)，不能最大效率地分離弱趨磁性的氧化亞鐵硫桿菌，因此，磁泳所需的時(shí)間很長(zhǎng)，而且每次分離后都需要活化擴(kuò)培，不能連續(xù)培養(yǎng)。為了分離包括弱趨磁性細(xì)菌在內(nèi)的各種磁性細(xì)菌，本實(shí)驗(yàn)利用磁選的原理，開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)了一臺(tái)強(qiáng)磁分離儀。利用特殊形狀的磁極頭，產(chǎn)生最利于磁分離的梯度分布的磁場(chǎng)，且可達(dá)到的磁場(chǎng)強(qiáng)度也遠(yuǎn)強(qiáng)于普通靜磁塊。同時(shí)，本強(qiáng)磁分離儀也可用于從大量細(xì)胞懸液中提取磁性顆粒的下游過(guò)程中，有效地減少所需處理的細(xì)胞懸液量。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)，可以得到以下結(jié)論：1)經(jīng)過(guò)特殊設(shè)計(jì)的磁極頭可以產(chǎn)生利于磁分離的梯度分布強(qiáng)磁場(chǎng)。2)本強(qiáng)磁分離儀可以有效地分離磁性細(xì)菌：經(jīng)過(guò)強(qiáng)磁分離儀分離得到的強(qiáng)磁菌平均每個(gè)細(xì)胞含有4顆磁性顆粒，84.21%的細(xì)胞含有磁性顆粒，多數(shù)細(xì)胞含有2～5顆，最多可達(dá)18顆，而弱磁菌平均每個(gè)細(xì)胞含有2顆磁性顆粒，65.79%的細(xì)胞含有磁性顆粒，多數(shù)細(xì)胞只含有1顆，最多只有9顆；在人工磁場(chǎng)中，強(qiáng)磁菌的趨磁性明顯強(qiáng)于弱磁菌，而在地磁場(chǎng)中沒(méi)有明顯的趨向運(yùn)動(dòng)。

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Separation of magnetic bacteria by using a magnetic separator

Xinxing Liu, Ning Guo, Yingjie Yang, Wanjie Liang, and Jian Zhang
School of Minerals Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha 410083, China

Received:September 7, 2009;Accepted:November 16, 2009

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2004CB619201), National Natural Science Foundation of China(No.50774102).

Corresponding author:Yingjie Yang.Tel: +86-731-6635099; E-mail: yjyangcsu@126.com國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2004CB619201)，國(guó)家自然科學(xué)基金(No.50774102)資助。