磁分離儀分離磁性細菌的新方法

劉新星，郭寧，楊英杰，梁萬潔，張劍

中南大學資源加工與生物工程學院，長沙 410083

磁分離儀分離磁性細菌的新方法

劉新星，郭寧，楊英杰，梁萬潔，張劍

中南大學資源加工與生物工程學院，長沙 410083

磁性細菌胞內(nèi)可以產(chǎn)生磁性顆粒，因此具有趨磁性，基于這種特性，利用磁分離的原理，本研究開發(fā)了一種磁性細菌分離儀，提供了一種分離磁性細菌的新方法。以氧化亞鐵硫桿菌為例，使用磁性細菌分離儀進行分離，可以得到強磁菌和弱磁菌。利用透射電鏡觀察，強磁菌胞內(nèi)磁性顆粒明顯多于弱磁菌；半固體平板磁泳實驗也表明強磁菌趨磁性明顯強于弱磁菌。各項實驗結果表明磁性細菌分離儀可以有效地分離磁性細菌，這是一種分離磁性細菌的新方法，將促進磁性細菌分離培養(yǎng)的研究。

磁性細菌，細菌磁分離，磁性細菌分離儀

Abstract:A magnetic separator was used to separate magnetic bacteria based on their magnetotactic characteristics.Acidithiobacillus ferrooxidans, a bacterium that could synthesize intra-cellular nanometer magnetic particles, was investigated as an example.Strong magnetic and weak magnetic cells were separated and collected.On average, the number of the magnetic particles present in the strong magnetic cells is more than that of the weak magnetic cells.Moreover, semisolid-plate magnetophoresis showed that the magnetotaxis of strong magnetic cells was stronger than the weak magnetic cells.These results suggest that the magnetic separator can be used to isolate the magnetic bacteria, which will facilitate the research of magnetic bacteria.

Keywords:magnetic bacteria, magnetic separation of bacteria, magnetic separator

氧化亞鐵硫桿菌是生物冶金[1]中的重要細菌之一，能以亞鐵、硫元素以及低價硫化物作為能源，為好氧菌，培養(yǎng)條件簡單。本課題組在研究磁黃鐵礦選育浸礦細菌的過程中發(fā)現(xiàn)氧化亞鐵硫桿菌胞內(nèi)能夠生成磁性顆粒[2]，因此在磁場作用下有微弱的趨磁性，并且破碎細胞后提取到了能夠響應磁場的磁性顆粒。經(jīng)反復研究發(fā)現(xiàn)，氧化亞鐵硫桿菌體內(nèi)的磁性顆粒數(shù)量不多，且沒有成鏈排布，因此其趨磁性比較弱。本研究把所有胞內(nèi)含有天然生成的磁性顆粒，可以在磁場作用下產(chǎn)生趨磁性泳動的一類細菌統(tǒng)稱為磁性細菌。使用液體[2]和固體平板磁泳[3]的方法分離磁性細菌時，時間長，處理量小，分離效果受到限制。為此，本研究開發(fā)了一種新的磁性細菌分離儀，采用磁分離的方法分選磁性細菌。以氧化亞鐵硫桿菌為樣品進行磁分離后，顯微鏡觀察、透射電鏡觀察和半固體平板磁泳結果都說明這是一種有效的磁性細菌分離方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

氧化亞鐵硫桿菌Acidthiobacillus ferrooxidans，從云南東川某酸性礦坑水中分離得到，現(xiàn)保存于中南大學生物冶金教育部重點實驗室。

將菌種培養(yǎng)至對數(shù)期，10 000 r/min離心收集菌體，用pH 2.0硫酸反復懸浮、離心，除去鐵釩，滴在載玻片上，用磁鐵在不同方向?qū)ζ涫┘哟艌鲧R檢，有的細胞會緩慢游向磁鐵S極，有的細胞只是隨磁鐵來回振動，還有細胞對磁場沒有反應。由此判斷該菌種可以由磁分離的方法來分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

9K液體培養(yǎng)基[6](g/L)：(NH4)2SO43.00，KCl 0.10，K2HPO40.50，MgSO4·7H2O 0.50，Ca(NO3)20.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 44.7，pH 2.0。

ISP半固體培養(yǎng)基由3部分組成，A液：FeSO4·7H2O 33.4 g/L，用無菌微孔濾膜過濾；B液(g/L)：(NH4)2SO44.00，KCl 0.20，MgSO4·7H2O 1.00，Ca(NO3)20.02；C液：瓊脂3 g/L，pH 3.0。

1.1.3 儀器與設備

自行開發(fā)的磁性細菌分離儀，Galen III型顯微鏡，HZQ-C空氣浴振蕩器，PHS-3C酸度計，HT201高斯計，TDL-5A離心機，HL-4恒流泵，VP50真空泵。

1.2 方法

1.2.1 設備組成

磁性細菌分離儀的磁分離系統(tǒng)由電磁鐵部分、分離通道和恒流泵組成。

電磁鐵部分(工程純鐵極頭)的線圈通以直流電流(0～3 A電流)，從而產(chǎn)生磁場。磁性顆粒為偶極粒子，在勻強磁場中受力為零，故必須采用非勻強磁場才能分離。本強磁分離儀分離空間由一對相對但不平行的磁極面組成，如圖1所示。雙曲線形狀的磁極面產(chǎn)生的磁場是梯度分布的，因此對于處在其中的磁性顆粒產(chǎn)生磁力作用。這個空間中磁性顆粒除了受垂直方向的重力和浮力外，最主要的力是平行方向上的磁力和粘滯阻力。磁力的方向(Fm)指向磁力線密集的一邊，當磁力足夠大時，就可以使通過的磁性顆粒偏移，達到磁分離的目的。

圖1 磁極頭截面示意圖Fig.1 The sketch map of magnetic pole.

分離通道是磁分離系統(tǒng)的主要部分，由塑料管制成，置于電磁鐵兩極形成的分離空間之內(nèi)。有一個入口和兩個出口，入口連接著恒流泵。通過的磁性顆粒在磁場的作用下，向一側(cè)偏移。分離通道設計成為細長管道，通過磁場的管道長度與管道寬度之比L/W?1，有利于提高分離效率。

恒流泵可以控制載有磁性顆粒的懸液流量，本實驗采用的流量為372 mL/h。

1.2.2 細胞懸液樣品制備

所用菌株采自云南東川某酸性礦坑水中，使用9K培養(yǎng)基多次富集。細胞培養(yǎng)至對數(shù)期，通過0.22 μm微孔濾膜抽濾，用pH 2.0的稀硫酸沖洗濾膜表面，得到細胞懸液。將得到的細胞懸液用10 000 r/min離心收集菌體，再用pH 2.0的稀硫酸懸浮，反復離心、懸浮，直至收集到的細胞不含鐵礬沉淀為止。進行分離實驗的時候，用pH 2.0稀硫酸把菌體稀釋成不同濃度的細胞懸液。

1.2.3 細胞磁分離

在實驗之前，整個通道使用75%乙醇消毒，再使用蒸餾水沖洗干凈，最后使用pH 2.0 H2SO4潤洗。然后泵入樣品懸液，打開電磁鐵電源，待流體穩(wěn)定之后，分別收集兩個出口流出的液體即可。含有磁性顆粒的菌體在磁場作用下發(fā)生偏移，從而導致從兩個出口流出的菌懸液的濃度會發(fā)生變化，在顯微鏡下分別用計數(shù)板計數(shù)，每個樣品重復計數(shù) 3次，取平均值。

1.2.4 趨磁性觀察[3]

取培養(yǎng)好的細菌在半固體平板中央接種，于30℃生化培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)，在由永久磁鐵產(chǎn)生的人工磁場中生長，人工磁場方向平行于地磁場方向，培養(yǎng)數(shù)天后觀察菌斑生長情況。以不加人工磁場僅在地磁場下培養(yǎng)作為空白對照。

1.2.5 透射電鏡觀察

將分離后得到的兩種菌懸液離心收集菌體，用磷酸緩沖液(PBS，pH 6.7)清洗，經(jīng)過適當稀釋后做超薄切片，置于透射電鏡(JEM1230，電壓80 kV)下觀察菌體內(nèi)磁性顆粒數(shù)量的變化。

2 結果

2.1 設備磁場的分布

為了直觀表示磁極磁場的分布，首先使用磁場模擬軟件FEMM4.2(http://femm.foster-miller.net)模擬這種磁極(切面)產(chǎn)生的磁場二維平面分布，如圖2所示。從磁場的模擬圖中可以清楚地看出出口 a處和出口b處兩點之間磁場的梯度分布。出口a處磁場線比出口 b處密集，磁性顆粒受力方向與磁場梯度方向相同，所以應該可以從出口 a處收集得到含磁性顆粒相對多的細菌，稱為強磁菌，從出口 b處收集得到含磁性顆粒相對少的細菌，稱為弱磁菌。

使用高斯計測量磁分離儀的磁場實際分布情況，分離空間的磁場符合軟件模擬的分布。當線圈的電流為3 A時，出口a處的磁場強度可達1460 mT，出口b處的磁場強度為1000 mT，水平方向的磁場梯度為18.4 T/m。本磁分離儀可以產(chǎn)生的磁場要遠強于普通靜磁塊的磁場。強的高梯度磁場對于分離趨磁性很弱的磁性細菌是非常有利的。

2.2 細胞的磁分離

對照實驗 M1是將細胞懸液在不加磁場的情況下通過分離通道。實驗M2、M3和M4則加了分離磁場(電磁鐵通以3 A電流)。實驗M2是將細胞懸液進行初次磁分離，在出口a和b處分別收集到強磁菌和弱磁菌；實驗 M3是將得到的強磁菌進行再次磁分離；實驗 M4是將得到的弱磁菌進行再次磁分離。所有實驗中細胞懸液的流量都控制為372 mL/h(恒流泵電壓為 1.2 V)。使用統(tǒng)計學分析軟件SPSS13.0對磁分離后細胞懸液的濃度變化進行均值比較和方差分析，結果見表1。

圖2 磁分離儀磁極磁場分布圖Fig.2 Two-dimensional simulation of the magnetic field generated by the poles.a: location of outlet a; b: location of outlet b.

表1 磁分離細胞懸液濃度變化及方差分析結果(n=3)Table 1 Result of the magnetic separation and the variance analysis(n=3)

由結果可以看出，不加磁場的實驗 M1中，P＞0.05，兩個出口得到的細胞懸液濃度沒有顯著差異。施加了外磁場之后，實驗 M2中，P＜0.05，分離結果有顯著差異，且出口 a得到的細胞懸液濃度明顯大于出口 b處得到的細胞懸液，這說明含有磁性顆粒的細胞在磁場作用下發(fā)生了偏移。為了進一步證明這一點，把得到的強磁菌液和弱磁菌液分別進行第 2次磁分離。結果，強磁菌液的分離效果與第1次分離結果類似(M3)，P＜0.05，分離結果有顯著差異；而弱磁菌液分離后細胞濃度沒有發(fā)生明顯變化(M4)，P＞0.05，分離結果沒有顯著差異，這是因為經(jīng)過第 1次分離后，其中含有磁性顆粒的細胞以及細胞中的磁性顆粒數(shù)都減少了，這一點也可由透射電鏡結果所驗證。

2.3 透射電鏡觀察

10 000 r/min下高速離心，分別收集強磁菌液和弱磁菌液菌體，用磷酸緩沖液(pH 6.7)清洗，經(jīng)過適當稀釋后制作超薄切片，使用透射電鏡觀察，結果見圖3。圖中黑色電子致密體是磁性顆粒，在本課題組前期的工作中，使用能譜分析顯示，該磁性顆粒主要由Fe和O兩種元素組成[3]。

從圖中可以看出，經(jīng)磁分離儀分離后，強磁菌和弱磁菌磁性顆粒含量有一定差別。在電鏡下選取輪廓完整的細胞，統(tǒng)計胞內(nèi)與細胞背景區(qū)別明顯、且直徑在20～90 nm范圍內(nèi)的黑色電子致密體數(shù)量，結果見表 2。統(tǒng)計每個含有磁性顆粒的細胞內(nèi)的磁性顆粒數(shù)量，進行頻數(shù)分析，結果見圖4。

圖3 強磁菌和弱磁菌的透射電鏡照片(A：強磁菌，在出口a處收集；B：弱磁菌，在出口b處收集)Fig.3 Transmission electron micrograph of thin sectioned cells.(A)Strong magnetic cells collected at outlet a.(B)Weak magnetic cells collected at outlet b.

表2 氧化亞鐵硫桿菌胞內(nèi)磁性顆粒數(shù)量統(tǒng)計結果Table 2 Statistical results of magnetic particles in the A.f cells

從統(tǒng)計結果可以看出，強磁菌胞內(nèi)磁性顆粒數(shù)量明顯多于弱磁菌。強磁菌平均每個細胞含有4顆磁性顆粒，84.21%的細胞含有磁性顆粒，多數(shù)細胞含有2～5顆，最多可達18顆；弱磁菌平均每個細胞含有2顆磁性顆粒，65.79%的細胞含有磁性顆粒，多數(shù)細胞只含有1顆，最多只有9顆。經(jīng)磁分離儀分離后，含磁性顆粒的細胞的比例發(fā)生了明顯變化，這說明磁分離儀可以分離出含磁性顆粒多的細胞。

2.4 趨磁性觀察

半固體平板磁泳結果如圖5所示。從圖中可以看出，強磁菌在強外磁場的作用下，明顯向磁鐵一側(cè)運動，相比之下，在相同的外磁場中，弱磁菌的趨磁運動沒有強磁菌明顯。而不加外磁場的情況下，細菌僅在地磁場作用下沒有明顯的趨磁運動。這是因為氧化亞鐵硫桿菌中磁性顆粒數(shù)量較少，且分散在菌體內(nèi)部，沒有成鏈排列，地磁場對它的作用不能抵消菌體本身的熱運動。但是當胞內(nèi)磁性顆粒數(shù)量足夠多時，當外加磁場達到一定強度后，氧化亞鐵硫桿菌仍然會產(chǎn)生趨磁運動。半固體平板磁泳的結果也同樣說明采用磁分離儀分離強趨磁性的細菌是可行的。

圖4 每個含有磁性顆粒的細胞內(nèi)的磁性顆粒數(shù)量頻數(shù)分析圖Fig.4 Frequencies statistics of magnetic particles numbers in the cells containing the magnetic particles.(A)Strong magnetic cells.(B)Weak magnetic cells.

圖5 半固體平板磁泳照片F(xiàn)ig.5 Photograph of semisolid-plate magnetophoresis.(A)Strong magnetic cells in the artificial magnetic field.(B)Weak magnetic cells in the artificial magnetic field.(C)Cells in the geomagnetic magnetic field.

3 討論

納米級磁性顆粒在生物技術、信息存儲[5]、傳感技術[6]、醫(yī)療衛(wèi)生[7]、廢水處理[8]和環(huán)境磁學[9]等方面都有廣泛的應用前景。因此，磁性細菌的相關研究有著非常重要的理論和實際價值。迄今為止，人們在很多物種中發(fā)現(xiàn)了由生物礦化作用產(chǎn)生的鐵磁性物質(zhì)，主要都是磁鐵礦顆粒。氧化亞鐵硫桿菌胞內(nèi)生成的磁性顆粒同樣是生物礦化作用[10-11]的結果，本實驗室在研究中發(fā)現(xiàn)在嗜鐵鉤端螺旋菌胞內(nèi)也可能生成相似的磁性顆粒，類似的生物礦化作用很可能存在于多種浸礦細菌中，將是未來研究的重點方向之一。但是類似的磁性細菌趨磁性都非常微弱，其分離成為制約研究的瓶頸，急需開發(fā)有效的分離方法。

目前，生物物質(zhì)的磁分離方法有很多種，如簡單磁泳分離[6]、微芯片磁泳分離[12]和磁性分流薄層分級[13]等。但是對于類似氧化亞鐵硫桿菌這樣弱趨磁性的細菌，上述磁分離方法都不甚理想。針對氧化亞鐵硫桿菌，本課題組在前期工作中采用了液體磁泳和固體平板磁泳方法，取得了比較好的效果。但是這兩種磁泳方法仍然不能滿足實際培養(yǎng)的需要。液體磁泳和固體平板磁泳使用的都是靜磁塊，靜磁塊的磁場強度有限，且磁場分布沒有經(jīng)過特殊設計，不能最大效率地分離弱趨磁性的氧化亞鐵硫桿菌，因此，磁泳所需的時間很長，而且每次分離后都需要活化擴培，不能連續(xù)培養(yǎng)。為了分離包括弱趨磁性細菌在內(nèi)的各種磁性細菌，本實驗利用磁選的原理，開發(fā)設計了一臺強磁分離儀。利用特殊形狀的磁極頭，產(chǎn)生最利于磁分離的梯度分布的磁場，且可達到的磁場強度也遠強于普通靜磁塊。同時，本強磁分離儀也可用于從大量細胞懸液中提取磁性顆粒的下游過程中，有效地減少所需處理的細胞懸液量。

通過實驗，可以得到以下結論：1)經(jīng)過特殊設計的磁極頭可以產(chǎn)生利于磁分離的梯度分布強磁場。2)本強磁分離儀可以有效地分離磁性細菌：經(jīng)過強磁分離儀分離得到的強磁菌平均每個細胞含有4顆磁性顆粒，84.21%的細胞含有磁性顆粒，多數(shù)細胞含有2～5顆，最多可達18顆，而弱磁菌平均每個細胞含有2顆磁性顆粒，65.79%的細胞含有磁性顆粒，多數(shù)細胞只含有1顆，最多只有9顆；在人工磁場中，強磁菌的趨磁性明顯強于弱磁菌，而在地磁場中沒有明顯的趨向運動。

REFERENCES

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Separation of magnetic bacteria by using a magnetic separator

Xinxing Liu, Ning Guo, Yingjie Yang, Wanjie Liang, and Jian Zhang
School of Minerals Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha 410083, China

Received:September 7, 2009;Accepted:November 16, 2009

Supported by:National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2004CB619201), National Natural Science Foundation of China(No.50774102).

Corresponding author:Yingjie Yang.Tel: +86-731-6635099; E-mail: yjyangcsu@126.com國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)(No.2004CB619201)，國家自然科學基金(No.50774102)資助。