膠原蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及酶的分離純化

劉麗莉，馬美湖，余秀芳，王文濤

1 華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，武漢 430070 2 河南科技大學食品與生物工程學院，洛陽 471003

膠原蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及酶的分離純化

劉麗莉1,2，馬美湖1，余秀芳1，王文濤1

1 華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，武漢 430070 2 河南科技大學食品與生物工程學院，洛陽 471003

從堆積骨骼的土樣中篩選出高產(chǎn)膠原蛋白酶的MBL13菌株，經(jīng)鑒定為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus。對其所產(chǎn)的膠原蛋白酶BCC進行分離純化，并進行酶學性質(zhì)的研究。從菌株的發(fā)酵液中純化出分子量約為38.0 kDa BCC酶。酶反應的最適溫度為40℃，最適pH為8.0。在50℃以下穩(wěn)定，60℃保溫1 h酶活僅保留10%；在pH 7.0～8.5活性較穩(wěn)定；金屬離子Ca2+、Zn2+、Mg2+對酶有激活作用，金屬離子Cu2+對酶有顯著的抑制作用。EDTA和EGTA能抑制該酶，表明BCC酶為一種金屬蛋白酶。酶的底物特異性表明該酶為骨膠原蛋白酶，且對Ⅰ型骨膠原蛋白水解能力極顯著高于Ⅱ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白。將純化的BCC酶應用于骨膠原蛋白的水解可以得到不同鏈長的多肽，其水解能力高于標準品膠原酶Ⅰ型。本研究為工業(yè)酶提供了新的菌株和新型膠原蛋白酶，為膠原蛋白酶的開發(fā)提供了重要的理論依據(jù)。

膠原蛋白酶，篩選，純化，性質(zhì)

Abstract:We isolated the strain MBL13 with high collagenase productivity from the soil of piled up animal bones.It was identified as Bacillus cereus.We purified and characterized Bacillus cereus collagenase(BCC).The molecular weight of BCC was 38.0 kDa and the optimum temperature and pH for the enzyme activity were 40°C and 8.0 respectively.The enzyme was stable when the temperature was below 50°C, but only retained 10% activity when kept at 60°C for 1 h.The enzyme activity was stable between pH 7.0–8.5.Some metal ions such as Ca2+, Zn2+, Mg2+enhanced the enzyme activity, and Cu2+brought the obvious inhibition.In addition, EDTA and EGTA could inhibit the enzyme activity.We suggested that the purified enzyme was a member of the metalloproteases.Based on the experiment of substrate specificity, we found that the purified enzyme was bone collagenolytic protease, and had a much stronger capacity of hydrolysis for type I collagen than that for type II collagen and type III collagen.By BCC hydrolyzing bone collagen, we obtained polypeptides with different chain lengths.The comparative test indicated that the hydrolysis capacity of BBC was higher than that of standard type I collagenase.The results introduced a new strain and a novel collagenolytic protease for industrial enzyme.

Keywords:collagenase, screening, purification, property

隨著我國養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，屠宰所產(chǎn)生的副產(chǎn)物是不可忽視的。骨骼是豐富的蛋白質(zhì)資源，主要成份是膠原蛋白，骨膠原蛋白是膠原蛋白的一種?，F(xiàn)今利用高新技術如酶技術對龐大的骨資源進行深加工，開發(fā)新型的功能性骨膠原多肽具有十分重要的經(jīng)濟價值成為研究的熱點[1-3]。膠原蛋白酶的研究始于19世紀末。膠原蛋白酶(Collgaenolytci protease)定義為在適當?shù)膒H和溫度下，只切割活性膠原螺旋區(qū)或明膠而不作用于其他蛋白底物的酶類[4-5]。然而，只有為數(shù)有限的蛋白酶具有獨特的特點可以引起膠原蛋白的降解。膠原蛋白酶按照其來源可分為微生物膠原蛋白酶和動物膠原蛋白酶。細菌膠原酶可分泌到胞外，通過發(fā)酵可大量獲得，微生物來源的膠原酶在應用方面具有更廣的應用范圍[6]。膠原蛋白酶在醫(yī)學上可用于治療異常增生，如腰椎間盤突出癥等疾病，也可在細胞研究中應用于分離胃腸細胞、胰島素和上皮細胞等，還可應用于膠原結構、生物合成的研究等，具有重要的理論研究意義和應用研究價值[7]。

本實驗從堆積骨骼的土樣中篩選出骨膠原蛋白的產(chǎn)生菌株，以探討應用工業(yè)化發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)該酶的可能，篩選到的一株高產(chǎn)膠原蛋白酶的MBL13菌株。對其所產(chǎn)膠原蛋白酶BCC進行了提純及性質(zhì)研究，以期為進一步開發(fā)和利用新型的膠原蛋白酶提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑

酸性可溶性Ⅰ型膠原(Acid-soluble typeⅠ collagen from calfbone)和膠原酶Ⅰ型(酶活大于125 U/mg)購自Sigma公司。電泳所需的生化試劑為超純試劑，分別購自美國 Simga公司和 Flkua公司。DEAECellulose-52、Sephadex G-100為Pharmacia 公司產(chǎn)品。低分子質(zhì)量標準蛋白購自上海升正生物技術公司。細菌16S rDNA PCR擴增試劑盒(Code NO1310)和切膠試劑盒(Code NO1DV805A)購自TaKaRa公司。骨明膠，食品級。其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

ZHWY-2102C型立式雙層恒溫搖床(上海智誠有限公司)；SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；YM75(Z)不銹鋼立式電熱蒸汽消毒器(上海三申醫(yī)療器械有限公司)；DYCZ-24DN 型雙垂直電泳儀(北京六一儀器廠)；HD-3000型核酸檢測儀、恒流泵、收集器(上海嘉鵬科技有限公司)；超速冷凍離心機(Avanti J-E，Beckman coulter, USA)等。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(1000 mL)：骨明膠10 g，NaCl 5 g，蛋白胨5 g，pH 7.2～7.5。初篩培養(yǎng)基(1000 mL)：骨明膠 20 g，葡萄糖 5 g，NaCl 0.1 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，pH 7.2～7.5。復篩培養(yǎng)基(1000 mL)：葡萄糖 20 g，酵母粉 1.5 g，骨明膠 10 g，NaH2PO4·2H2O 0.5 g，K2HPO4·3H2O 2.5 g，CaC120.05 g，pH 7.0～7.2[8]。固體培養(yǎng)基：在上述液體培養(yǎng)基中加入2.0%瓊脂，即成相應固體培養(yǎng)基。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

斜面及平板培養(yǎng)：37℃恒溫培養(yǎng)48 h。復篩發(fā)酵培養(yǎng)：復篩培養(yǎng)基10 mL盛于50 mL三角瓶中，接種后在37℃，搖床180 r/min培養(yǎng)48 h。產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)：復篩培養(yǎng)基30 mL盛于250 mL三角瓶中，接種后37℃，搖床180 r/min培養(yǎng)48 h。

1.2.2 BCC產(chǎn)生菌的篩選

采集的土樣先經(jīng)富集培養(yǎng)48 h；稀釋涂布于初篩培養(yǎng)基的平板上形成單菌落，滴加酸性汞試劑在菌落周圍，選擇透明圈直徑與菌落之比較大的進行復篩，并測定發(fā)酵液中膠原蛋白酶活力(酸性汞試劑：HgCl215 g，濃 HCl 20 mL，加蒸餾水至 100 mL)。

1.2.3 BCC酶的分離純化

將發(fā)酵液離心，取上清液得粗酶液，以硫酸銨分段鹽析得沉淀為 A酶樣，將其溶解后并采用pH 7.5、20 mmol/L Tris-HCl緩沖液透析，然后過以同樣緩沖液平衡的DEAE-Cellulose-52柱并洗滌，然后以 0.1～0.5 mol/L NaCl和 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液進行線形梯度洗脫，收集活性部分得酶樣 B，濃縮后在Sephadex G-100柱上凝膠過濾，收集活性峰，冷凍干燥得純化的酶C制品。該純化BCC酶在分離膠濃度為15%，SDS-PAGE電泳進行純度分析，考馬斯亮藍法顯跡[9-10]。

1.2.4 純化BCC的酶學性質(zhì)研究

最適反應溫度和熱穩(wěn)定性：在不同溫度下按照標準方法測定酶活力，以酶活力最高者為 100%。酶液在 10℃、20℃、30℃、37℃、50℃、60℃、70℃下分別保溫1 h，迅速冷卻至室溫，按上述方法測殘余酶活力，以未保溫的酶液的酶活力為 100%[11]。酶的最適反應pH和pH穩(wěn)定性：將酶液分別加在不同pH(pH 3.0～11.0)的緩沖液中，按標準方法測酶活力，以酶活力最高者為 100%。將酶液用不同pH(pH 3.0～11.0)的緩沖液稀釋，37℃保溫1 h后，測殘余酶活力，以未保溫的酶液的酶活力為100%[12]。金屬離子對純化酶活力的影響：在酶反應體系內(nèi)加入不同的金屬離子，各種金屬離子的終濃度分別為2 mmol/L，在37℃下保溫30 min，測剩余酶活，以不含金屬離子的反應液為對照[13]。抑制劑對純酶活性的影響：采用2 mmol/L和5 mmol/L的不同抑制劑(EDTA、EGTA、PMSF、Leupeptin、N-ethylmaleimide)的緩沖液，以未加的酶活力為100%，測定相對酶活的變化。酶的底物特異性：分別以骨明膠、可溶性Ⅰ型膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、牛血清白蛋白(BSA)為作用底物，以骨明膠測定的酶活為100%計，測定相對酶活。

1.2.5 BCC酶解骨膠原蛋白的產(chǎn)物的SDS-PAGE分析及其對比實驗

自制骨膠原蛋白[14-15]5 g，加入100 mL 蒸餾水中，90℃熱處理20 min。冷卻后加入純化BCC酶液和膠原酶Ⅰ型標準品酶液，37℃下酶解反應，于不同酶解時間取樣，酶解液在SDS-PAGE上電泳分析，分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度為5%。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 BCC酶活性的測定方法

采用茚三酮顯色法[16]。取0.01 mL酶液，加入20 mmol/ L Tris-HCl(pH 7.5)緩沖液溶液溶解的 1 mg/mL可溶性 I型膠原 0.3 mL，37℃反應30 min，然后加入0.6 mL 10%三氯乙酸(TCA)終止反應，以先加終止液的相同反應物為對照，反應物10 000 ×g離心10 min，取上清液0.2 mL加入0.5 mL，茚三酮顯色溶液，充分混合后，蓋住試管口，在100℃水浴中加熱15 min，冰水冷卻5 min后，加入2.5 mL 60%丙醇稀釋。充分混勻后，570 nm處比色。

酶活力單位定義為：在37℃、pH 7.5條件下，每分鐘水解膠原產(chǎn)生相當于1 μmol亮氨酸的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測定方法

采用Bradford法[17]測定，以牛血清白蛋白為標準。

1.3.3 分子量的測定方法

按Laemmli等[18]的SDS-PAGE方法進行。分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度為5%。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)BCC菌株的篩選結果

從湖南和河南骨骼加工廠堆積骨骼處采集到50份土樣先經(jīng)液體富集培養(yǎng)48 h，稀釋涂布于LB培養(yǎng)基上形成單菌落。再點接于初篩培養(yǎng)基中進行初篩，選擇細菌水解透明圈直徑與菌徑之比較大的進行搖床發(fā)酵復篩，發(fā)酵液測定膠原蛋白酶活力。實驗結果表明骨膠原蛋白水解所形成的透明圈的大小與細菌產(chǎn)膠原蛋白酶的能力具有相關性。經(jīng)富集培養(yǎng)通過初篩、復篩，分離出的60株細菌能分泌膠原蛋白酶。其中有3株產(chǎn)酶能力均在30 U/mL以上。有一株編號為 MBL13的細菌每毫升發(fā)酵液含膠原蛋白酶的活力達36.80 U/mL，經(jīng)單株分離且連續(xù)傳代產(chǎn)酶能力無明顯下降。經(jīng)形態(tài)學觀察、生理生化特性、16S rDNA 序列分析和傅里葉紅外測定細胞結構，鑒定該菌株為蠟樣芽孢桿菌 Bacillus cereus(另文發(fā)表)。

2.2 BCC酶的分離純化

通過硫酸銨沉淀、DEAE-Cellulose-52離子交換層析及Sephadex G-100凝膠過濾對MBL13 發(fā)酵液中的酶進行分離純化，結果見表1。

表1 MBL13菌產(chǎn)BCC酶的純化Table 1 Purification of the BCC collagenase from MBL13

經(jīng)過純化后的BCC酶活達到2443 U/mg，提純倍數(shù)為 20.4，得率為 25.2%。各步提取的酶樣品用SDS-PAGE檢測(圖1)，結果表明硫酸銨沉淀樣品A中雜帶較多，樣品B中蛋白酶已占主要部分，樣品C中已是單一條帶，表明蛋白酶已達到電泳純。最終純化的膠原蛋白的分子量約為38 kDa。接近于一般細菌所產(chǎn)蛋白酶18～35 kDa的分子量[19]。

2.3 BCC酶反應最適溫度和熱穩(wěn)定性

純酶液與可溶性Ⅰ型膠原蛋白溶液等體積混和，在 10℃～70℃的溫度下反應 30 min，測得酶的最適作用溫度為40℃。

將酶液在不同的溫度下分別保溫 1 h后立即在0℃冰浴中冷卻，然后在37℃下測酶活，以剩余的酶活性作為評價酶的熱穩(wěn)定性的指標。結果顯示，純化酶在10℃～40℃保溫1 h保留75%以上的酶活力；50℃保溫1 h 后，剩余的酶活為60%左右，在60℃保溫1 h僅剩10%酶活，表明純化酶不能耐受高溫，熱穩(wěn)定性一般(圖2)。

圖1 各步分離純化蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of the protein bands from the various purification steps.1: protein marker; 2: DEAE-Cellulose-52 column chromatography; 3: ammounium sulfate precipitation; 4:purified collagenase.Protein was stained with Commassie Brilliant Blue R 250 staining.

圖2 溫度對BCC酶活的影響Fig.2 Effect of temperature on the enzyme activity of BCC collagenase.The optimal temperature for the enzyme activity(□)was determined at different temperatures(10°C–70°C).The enzyme was preincubated at 10°C–70°C for 1 h to determine the stability(◆)of the enzyme activity.

2.4 BCC酶最適反應pH和pH 穩(wěn)定性

取純酶液0.5 mL，加入9.5 mL不同pH的緩沖液(pH 3.0～11.0)，與可溶性Ⅰ型膠原蛋白等體積混合，在37℃保溫30 min測定酶活的變化。

如圖3所示，在 pH 7.0～8.0之間酶活力都較高，酶的最適pH為8.0。將適量酶液與不同pH 緩沖液在37℃預處理1 h 后，測定剩余酶活力。pH 7.0～8.5之間剩余酶活仍能保持在 80%以上。在 pH 3.0～7.0之間，隨著pH的降低，剩余酶活力顯著下降；pH 8.5～10.0之間，隨著pH的增大，酶活從80%急劇下降為2%。

2.5 不同金屬離子對BCC酶活的影響

在酶與底物的反應體系中，加入不同的金屬離子，使其終濃度為2 mmol/L，以不加金屬離子的酶活為100%，測定其酶活(圖4)。多種金屬陽離子對該酶的活性都有較大的影響，其中Ca2+、Zn2+、Mg2+對酶有激活作用，Ca2+能提高純化酶的活性；金屬離子 Cu2+對酶有顯著的抑制作用；其他金屬離子也對酶活有一定的影響作用，但作用不明顯。

圖3 pH值對BCC酶活的影響Fig.3 Effect of pH on the enzyme activity of BCC collagenase.The optimal pH for the activity(□)and pH stability(◆)of the enzyme were determined at various pHs(pH 3.0–11.0), with the reactions preincubated at the given pHs for 1 h.The buffers used were 50 mmol/L sodium citrate(pH 3.0–6.6), 50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.0–9.0), and 50 mmol/L Na2CO3-NaHCO3(pH 9.16–10.83).To determine the stability, the enzyme was preincubated at 37°C for 1 h in each of the specified buffer.

圖4 金屬離子對BCC酶活的影響Fig.4 Effect of metal ions on the enzyme activity of BCC collagenase.

2.6 抑制劑對BCC酶活的影響

以未加抑制劑的樣品為對照，測定含有抑制劑的樣品的膠原蛋白酶活性，從而計算出抑制劑的作用效率，以膠原蛋白酶的相對剩余酶活來表示，結果見表2。EDTA和EGTA可以強烈抑制純化的膠原蛋白酶活性，N-ethylmaleimide、PMSF和Leupeptin對純化酶的活性影響較小，可以保留近80%的相對酶活；由于金屬蛋白酶在反應中心需要二價金屬離子，而且通常能抑制二價金屬離子作用的EDTA和EGTA被稱為金屬蛋白酶的抑制劑[20]。因此，該純化酶表明是一種金屬蛋白酶。

2.7 BCC酶的底物特異性

分別以骨明膠、可溶性Ⅰ型膠原蛋白、Ⅱ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、牛血清白蛋白(BSA)為底物，測定適當稀釋后純化酶液的酶活性高低，以明膠為底物作為對照，測定相對酶活的變化，結果見圖5。純化酶對底物的作用順序為：骨明膠＞Ⅰ型膠原蛋白＞Ⅲ型膠原蛋白＞Ⅱ型膠原蛋白，對BSA沒有作用。經(jīng)方差分析，不同底物對相對酶活的影響存在極顯著(P＜0.01)。即底物為Ⅰ型膠原蛋白時，相對酶活顯著高于Ⅲ型膠原蛋白和Ⅱ型膠原蛋白。由于骨骼中Ⅰ型膠原蛋白占總蛋白的85%～90%。，因此，實驗結果表明該菌所產(chǎn)酶對Ⅰ型骨膠原蛋白具有特異性，純化BCC酶屬于骨膠原蛋白酶。

2.8 膠原蛋白酶的酶解產(chǎn)物分析及其對比實驗

為了進一步了解純化的BCC酶的酶解能力，將其應用于骨膠原蛋白的水解，并針對相同酶活的純化BCC酶和膠原酶Ⅰ型標準品(美國)進行對比實驗。酶解產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析結果見圖6、7。

表2 抑制劑對BCC酶活的影響Table 2 Effect of inhibitors on the enzyme activity of BCC collagenase

圖5 純化酶對底物的特異性Fig.5 Substrate specificity of BCC collagenase.

將純化的BCC酶應用于骨膠原蛋白的水解，該酶水解骨膠原蛋白得到的最終產(chǎn)物為低分子量的多肽，隨著酶解時間的增加，肽的分子量隨之變小。而且水解后產(chǎn)生的多肽并不是連續(xù)的，說明該酶對骨膠原蛋白的水解是特異的，具有特定的酶切位點。這也進一步說明該酶為膠原蛋白酶，通過控制酶解時間，可以得到不同鏈長的多肽。即該酶可以用于骨膠原蛋白的水解生產(chǎn)骨多肽，可有望用于骨骼的深加工生產(chǎn)(圖6)。

圖6 純化酶酶解骨膠原蛋白的SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE analysis of bone collagen digested with the purified enzyme.1: enzymolysis time 60 min; 2: enzymolysis time 120 min.

圖7 酶解骨膠原蛋白的SDS-PAGE對比分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of bone collagen digested with BCC collagenase and collagenase I.1: the collagen polypeptides by BCC collagenase hydrolyzing bone collagen at 90 min; 2:the collagen polypeptides by collagenase I(standard sample,USA, Sigma)hydrolyzing bone collagen at 90 min; 3: protein marker.

由圖7可知，在相同的酶解條件下，純化的BCC酶的酶解液中大部分多肽條帶的分子量低于膠原酶Ⅰ型標準品。即表明在統(tǒng)一的酶解條件下，BCC酶能產(chǎn)生更多低分子量的骨膠原多肽。因此，結果表明MBL13所產(chǎn)的BCC酶酶解骨膠原蛋白的能力強于標準品膠原酶Ⅰ型。

3 討論

膠原蛋白酶是一種經(jīng)濟價值較高的蛋白酶種，國外膠原蛋白酶的產(chǎn)生菌都是通過以膠原或重組膠原(Reconstitude collagen)為底物篩選模型獲得的，但這種方法涉及膠原的提取，操作復雜，膠原極易變性，成本較高。本研究利用骨明膠為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，從堆積骨骼處分離得到一批產(chǎn)膠原蛋白酶活性的菌株，篩選出一株MBL13，經(jīng)鑒定為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus，其不但產(chǎn)酶量高，而且酶的活性強，具有重要的研究開發(fā)價值。在膠原蛋白酶的純化過程中，經(jīng)硫酸銨沉淀、DEAECellulose-52離子交換層析及Sephadex G-100凝膠過濾純化后，得到分子量為38 kDa的BCC酶，該酶的比活力達到 2443 U/mg，提純倍數(shù)為 20.4，得率為25.2%。酶學性質(zhì)研究表明，BCC酶最適作用溫度為 40℃，最適作用 pH為 8.0。pH穩(wěn)定范圍為7.0～8.5，其熱穩(wěn)定性一般，酶活最佳保持在60℃以下。因此，有待進一步提高酶活熱穩(wěn)定性的研究，使之更廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)中。除了金屬離子 Cu2+明顯抑制酶的活性外，其他離子對酶活性的影響不大，這些生理特性賦予了BCC酶在工業(yè)中有極大的應用優(yōu)勢。抑制劑實驗表明該純化酶是一種金屬蛋白酶，該酶的底物特異性表明酶對Ⅰ型膠原蛋白有極顯著的特異性，為一種骨膠原蛋白酶。對比實驗表明純化的 BCC酶水解能力強于標準品膠原酶Ⅰ型，因此具有極大的開發(fā)潛力。

針對骨骼的酶解研究，相關報道很多，但我國卻沒有骨專用的膠原蛋白產(chǎn)品，而且目前我國有關膠原蛋白酶的生產(chǎn)成本高，產(chǎn)量有限，限制了該酶的應用。本實驗從骨骼堆積處的土樣中篩選到的降解骨膠原蛋白的菌株MBL13，為開發(fā)骨骼深加工提供了新的思路，為解決工業(yè)化生產(chǎn)膠原蛋白酶提供了新型的專用生產(chǎn)出發(fā)菌。

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Screening of collagenase-producing strain and purification of Bacillus cereus collagenase

Lili Liu1,2, Meihu Ma1, Xiufang Yu1, and Wentao Wang1
1 College of Food Science & Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China 2 School of Food & Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China

Received:August 17, 2009;Accepted:November 19, 2009

Supported by:Key Projects in the National Science & Technology Pillar Program during the Eleventh Five-year Plan Period(No.2006BAD05A17).

Corresponding author:Meihu Ma.Tel: +86-27-87283177; Fax: +86-27-87283177; E-mail: mameihuhn@yahoo.com.cn“十一五”國家科技支撐計劃(No.2006BAD05A17)資助。