(S)-酮基布洛芬拆分用脂肪酶基因的克隆及表達

許麗娟，趙玉紅，劉瑞恩，趙運英，張金紅

南開大學生命科學學院，天津 300071

(S)-酮基布洛芬拆分用脂肪酶基因的克隆及表達

許麗娟，趙玉紅，劉瑞恩，趙運英，張金紅

南開大學生命科學學院，天津 300071

本實驗室篩選出一株具有不對稱拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯的菌株 NK13為材料，經(jīng)鑒定為巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium。通過構建其基因文庫，從中篩選得到陽性克隆重組子pUC-NK1。測序分析表明，該重組子質粒中包含一長度為 633 bp的脂肪酶基因的完整開放閱讀框，核苷酸同源性對比證明該脂肪酶基因屬首次發(fā)現(xiàn)(GenBank Accession No.EU381317)，將此基因克隆到原核表達載體pET21b(+)中構建重組表達質粒pET-NKest1，轉化Escherichia coli BL21，經(jīng)Isopropyl-β-D-Thiogalactoside(IPTG)誘導在宿主菌中得到表達，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測證明該脂肪酶成熟蛋白分子量約為20 kDa。薄層層析與HPLC檢測結果顯示，表達菌株轉化外消旋酮基布洛芬氯乙酯得到(S)-酮基布洛芬過量(e.e.%)，由野生菌NK13的5.84%提高到75.28%，提高約15倍，說明該脂肪酶具有優(yōu)先拆分得到(S)-酮基布洛芬的特性。

不對稱拆分，(S)-酮基布洛芬，脂肪酶，克隆，表達

Abstract:We screened a strain NK13 for a certain extent asymmetric hydrolysis the rac-ketoprofen Chloroethyl ester to(S)-Ketoprofen.As identified, NK13 was Bacillus megaterium.Digested NK13 genomic DNA with Sau3AΙ partially and recovered the fragment from 2 kb to 6 kb, cleaved the plasmid of pUC18 with BamH Ι, ligated the 2?6 kb fragment of NK13 genomic DNA into pUC18 plasmid, and then transformed an Escherichia coli strain DH5α.We created the gene library of NK13 and obtained a positive clone, pUC-NK1 in the library from the tributyrin flat.The result of sequencing showed that there was a whole open read frame(ORF)of 633 bp lipase gene in the plasmid of pUC-NK1.To compare with the genes of GenBank, this lipase gene was reported firstly(GenBank Accession No.EU381317).The lipase gene was amplified by PCR, using pUC-NK1 plasmid as template, and subcloned into the high expression vector pET21b(+)under the control of T7 promoter.The recombinant plasmid, pET-NKest1, was then transformed into an Escherichia coli strain BL21(DE3)for the production of recombinant lipase protein.After 3 hours of induction by isopropyl-β-D-thiogalactoside(IPTG), lipase was expressed.SDS-PAGE analysis showed that the relative molecular mass of the lipase protein was about 20 kDa.The result of high performance liquid chromatography(HPLC)showed that the conversion rate of the recombinant strain was fifty times than the wild strain NK13’s.The(S)-Ketoprofen enantiomeric excess of the recombinant strain was 75.28%, which indicated that thelipase could hydrolyze(S)-Ketoprofen Chloroethyl ester firstly.If we research the conditions of the hydrolysis rac-ketoprofen Chloroethyl ester of this lipase further, maybe it could offer a foundation to product(S)-Ketoprofen industrially.

Keywords:enantioselectivity,(S)-Ketoprofen, lipase, cloning, expression

2-芳基丙酸類藥物屬于非甾體消炎鎮(zhèn)痛藥，是解熱鎮(zhèn)痛、消炎抗風濕的基本藥物和主要產(chǎn)品，它是目前處方藥和非處方藥處方量最大的一類藥物。常用的有布洛芬、奈普生和酮基布洛芬 3種，其 α位有一個手性碳原子存在(S)-構型和(R)-構型一對光學對映體，臨床上一般以外消旋體的形式供應。其中酮基布洛芬的消炎鎮(zhèn)痛作用是阿司匹林的 150倍，解熱作用是阿司匹林的100倍，臨床上用于治療慢性類風濕性關節(jié)炎、變性性關節(jié)炎、外傷和術后疼痛等。藥理實驗表明，其(S)-異構體的消炎鎮(zhèn)痛作用是外消旋酮基布洛芬的2倍，而(R)-異構體的活性很低，但有其他方面藥用價值，它對牙周病的骨質疏松有治療作用[1]。

目前，(S)-酮基布洛芬的制備方法主要有不對稱合成、酶法拆分、非對映體結晶拆分等。其中利用微生物脂肪酶催化的立體選擇性拆分[2-6]獲得單一對映體具有立體專一性強、拆分效率高、生產(chǎn)條件溫和、無環(huán)境污染等諸多優(yōu)點，已經(jīng)成為研究的熱點。然而酶法拆分在工業(yè)化生產(chǎn)中也存在著許多缺點，如需對過量的生物量進行處理，對營養(yǎng)供應進行適當?shù)目刂?，每批反應的產(chǎn)率并不穩(wěn)定等，目前我國工業(yè)化生產(chǎn)條件尚未成熟。

近年來，研究微生物酯酶/脂肪酶拆分酮基布洛芬的報道也有很多[7-9]。意大利Menarini公司開發(fā)的(S)-酮基布洛芬于 1996年首次在西班牙上市，現(xiàn)在我國尚無生產(chǎn)此藥的廠家。本實驗室經(jīng)過篩選得到了一株具有不對稱拆分外消旋酮基布洛芬氯乙酯的野生菌 NK13，前期研究[10]已表明該野生菌中存在不止一種能夠拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯的酶，其中已經(jīng)得到一個新的酯酶基因[11]，本研究通過構建其基因文庫，克隆表達了另一個脂肪酶基因，并對該酶的性質進行了研究。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium NK13菌株，從生產(chǎn)奈普生藥廠附近的土壤中分離得到；pUC18為本實驗室保存；E.coli DH5α為本實驗室保存；pET21b(+)及E.coli BL21(DE3)由南開大學生命科學學院蔡寶立教授惠贈。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

各種限制性內切酶、DNA marker、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase)、T4 DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒購自大連寶生物TaKaRa公司。溶菌酶、RNase、蛋白酶K、氨芐青霉素購自北京鼎國生物技術公司。其他試劑均為分析純。NK13菌株液體培養(yǎng)基：葡萄糖1.2%；蛋白胨0.5%；NaCl 1%，pH 7.0。LB培養(yǎng)基用于E.coli DH5α培養(yǎng)，SOC培養(yǎng)基用于轉化后菌體復蘇。

1.3 基因組DNA文庫的構建

提取NK13基因組DNA，用Sau3AI進行部分酶切后，瓊脂糖凝膠回收2～6 kb的DNA片段，質粒pUC18用BamHⅠ酶切后用去磷酸化酶(CIAP)處理。回收DNA片段和酶切后的去磷酸化載體用T4 DNA連接酶連接后，用電轉化[12]方法轉化 E.coli DH5α，涂布在含有三丁酸甘油酯和羅丹明B的Amp抗性 LB平板上培養(yǎng)，構建基因文庫，篩選有水解圈的陽性克隆，命名為pUC-NK1。將過夜培養(yǎng)的陽性克隆pUC-NK1菌液送三博遠志公司進行測序。

1.4 脂肪酶基因的擴增

根據(jù)測序結果，在脂肪酶基因兩側設計一對引物，P1:5'-TTCCATATG GCGGAAGCAAACCATAATCCG-3'，P2:5'-TTGGATCC GTTTGTATTTTGTCCCCCGC-3'(在上下游引物 5'端分別引入 NdeⅠ和 BamHⅠ酶切位點，下劃線標識)，以陽性克隆 pUC-NK1的質粒DNA為模板，PCR擴增脂肪酶基因。PCR反應條件：94℃預變性3 min；94℃變性50 s，51℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)。

1.5 重組表達質粒pET-NKest1的構建

提取pUC-NK1菌株質粒并以其為模板，用引物P1和P2擴增目的基因，試劑盒回收PCR產(chǎn)物，與T-vector連接轉化E.coli DH5α，PCR鑒定的陽性重組質粒用NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收脂肪酶基因片段，與經(jīng)同樣雙酶切處理的pET21b(+)載體連接，構建酯酶基因重組表達質粒 pET-NKest1，轉化E.coli BL21(DE3)，用于脂肪酶的表達。

1.6 脂肪酶的表達

接pET-NKest1表達菌株單菌落于20 mL氨芐青霉素終濃度為100 μg/mL的 LB培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。按 1%接種量轉入 500 mL培養(yǎng)基，至OD600值為0.6～0.8之間時，加入IPTG至終濃度為0.8 mmol/L，37℃培養(yǎng)3 h，收獲菌體，SDS-PAGE電泳觀察結果。

1.7 薄層層析法檢測表達菌株對酮基布洛芬氯乙酯轉化率

在誘導3 h后的pET-NKest1表達菌株液體培養(yǎng)基中加入10 μL酮基布洛芬氯乙酯(20 mg/mL)，間隔 2 h取出一份加入鹽酸和乙酸乙酯萃取，取有機相，進行薄層層析(TLC)，美國UVP公司 GDS-8000型凝膠成像分析系統(tǒng)測定轉化率。

1.8 高壓液相色譜(HPLC)檢測產(chǎn)物光學純度

將層析板上與酮基布洛芬對應的點取下分別放到離心管中，再加1 mL乙酸乙酯充分振蕩萃取；12 000 r/min離心10 min后取上清液作為HPLC檢測樣品。在CHIROBIOTIC V柱上，以四氫呋喃：檸檬酸+檸檬酸鈉(pH 6.3，0.05 mol/L)=10：90緩沖液為流動相檢測酮基布洛芬的光學純度(e.e.值)。進樣量20 μL/次，流速1 mL/min。

2 結果

2.1 基因文庫的構建

將Sau3AI部分酶切的NK13基因組DNA和質粒pUC18用BamHⅠ酶切后，用去磷酸化酶(CIAP)處理，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳(圖1)。

構建NK13基因文庫得到了約20000個轉化子，從其中篩選得到一株具有水解三丁酸甘油酯能力的陽性克隆pUC-NK1(圖2)。

2.2 脂肪酶基因的擴增

圖1 NK13基因組DNA和pUC18質粒的酶切結果Fig.1 Enzyme digestion of NK13 genomic DNA and plasmid pUC18.M1: λ-Hind Ⅲ marker; M2: DL2000 marker; 1: NK13 DNA digestied with Sau3AI; 2: genomic DNA of NK13; 3:plasmid pUC18; 4: pUC18 digested with BamHⅠ.

圖2 基因文庫中的陽性克隆Fig.2 Positive clones of pUC-NK1 in gene libraries.

圖3 脂肪酶基因序列Fig.3 Sequence of the lipase gene and its deduced amino acid.

測序結果顯示 pUC-NK1陽性質粒中插入的外源片段長度為3038 bp，經(jīng)DNAStar軟件進行分析，發(fā)現(xiàn)一長度為633 bp的開放閱讀框(圖3)，編碼的蛋白在其N端有一段信號肽序列(斜體部分)。將該核苷酸序列與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中的基因核苷酸序列進行比對，結果顯示其與 Bacillus subtilis lipase(lipW)基因同源性最高，為77%。其推導的氨基酸序列與Bacillus subtilis subsp.酯酶同源性最高，為85%。該脂肪酶基因已錄入NCBI數(shù)據(jù)庫，GenBank登錄號為EU381317。

2.3 重組表達質粒的構建

以基因文庫中得到的pUC-NK1質粒為模板，用引物 P1和 P2成功擴增出與預期大小相符的條帶(圖4)。

回收PCR產(chǎn)物，與T-vector連接測序，結果表明重組質粒中的基因片段與預期的脂肪酶基因序列一致。用NdeⅠ和BamHⅠ從質粒T-vector上雙酶切脂肪酶酶基因，與經(jīng)相同酶切的 pET21b(+)載體連接，成功構建重組表達質粒pET-NKest1，轉化E.coli BL21(DE3)宿主菌。篩選陽性轉化子，提質粒用NdeⅠ和 BamHⅠ進行雙酶切檢驗(圖5)，證明構建的表達質粒pET-NKest1已成功轉入E.coli BL21(DE3)。

2.4 脂肪酶的表達

pET-NKest1表達菌株經(jīng)IPTG誘導3 h后，目的蛋白得到表達，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳檢測，發(fā)現(xiàn)重組蛋白的分子量約為20 kDa(圖6)。

2.5 表達菌株中酮基布洛芬氯乙酯的轉化率

表達菌株中酮基布洛芬氯乙酯轉化率隨著轉化時間的增加而提高，轉化20 h時，酮基布洛芬氯乙酯轉化率超過50%(圖7)。

2.6 HPLC檢測產(chǎn)物光學純度

分別將2～20 h的轉化產(chǎn)物進行高效液相色譜分析(圖8)，其中4 h時的轉化產(chǎn)物(S)-酮基布洛芬對映體過量值(e.e.%)最高，達75.28%。

圖4 PCR擴增脂肪酶基因產(chǎn)物Fig.4 PCR products of the lipase gene.M: DL2000 marker; 1:PCR products.

圖5 pET-NKest1質粒的酶切鑒定Fig.5 Identification of plasmid pET-NKes1 by enzyme digestion.M: λ-Hind Ⅲ marker; 1: plasmid pET-NKest1; 2:pET-NKest1 digestied with NdeⅠ and BamHⅠ.

圖6 SDS-PAGE分析E.coli BL21(DE3)中脂肪酶的表達Fig.6 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein expressed in the E.coli BL21(DE3).M: protein marker; 1: the cell of pET-NKest1 induced at 3 h; 2,3: E.coli BL21(DE3)including pET21b(+)plasmid; 4: supernatant of of pET-NKest1 induced at 3 h.

圖7 E.coli BL21(DE3)轉化酮基布洛芬氯乙酯TLC結果Fig.7 Transformation for ketoprofen chloroethyl ester in E.coli BL21(DE3).M: protein marker; 1?10: the transformated products at 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h;A: ketoprofen chloroethyl ester; B: ketoprofen.

圖8 HPLC檢測轉化產(chǎn)物的光學純度Fig.8 HPLC analysis of the transformated products.1?4:HPLC analysis of the transformated products at 2 h,4 h, 10 h,20 h.

3 討論

脂肪酶是一類重要的水解酶，在食品、醫(yī)藥、皮革和洗滌等行業(yè)中都有廣泛的應用。隨著酶學研究的發(fā)展，脂肪酶的很多特性被發(fā)現(xiàn)，其中脂肪酶可以專一性用于制備許多用化學方法難以合成的手性化合物及其前體，而且由于脂肪酶催化的反應還有選擇立體專一性強、拆分效率高、生產(chǎn)條件溫和、無環(huán)境污染等諸多優(yōu)點，成為手性分離技術的研究熱點之一。國外對脂肪酶的研究報道較多，而國內這方面的研究起步較晚，不同微生物產(chǎn)的脂肪酶在酶活、酶學性質及應用領域等方面都存在很大的差異。

本實驗室以自篩選得到的一株具有不對稱能力的菌株Bacillus megaterium NK13為材料，前期的研究已發(fā)現(xiàn)野生 NK13菌中存在不止一種可以拆分酮基布洛芬氯乙酯的酶，本研究成功地從 NK13中克隆到了其中一個能夠拆分酮基布洛芬氯乙酯的脂肪酶基因(GenBank Accession No.EU381317)，構建了其重組表達質粒并在大腸桿菌中表達出具有生物活性的脂肪酶，檢測了表達菌株對底物的轉化效率及產(chǎn)物的光學純度，4 h時轉化產(chǎn)物(S)-酮基布洛芬達到75.28%，是野生菌的15倍。如果進一步優(yōu)化脂肪酶的表達及拆分條件，或進一步篩選NK13中其他立體選擇性更高的酶，將具有更好的工業(yè)應用前景。

本研究得到的這個脂肪酶是從 Bacillus megaterium NK13中獲得的第2個具有不對稱拆分外消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的酶。與前期 NK13中發(fā)現(xiàn)第一個具有拆分外消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的酯酶[11]相比，本試驗發(fā)現(xiàn)的脂肪酶具有優(yōu)先選擇拆分(S)-酮基布洛芬的能力，拆分得到(S)-酮基布洛芬過量達到了75.28%，但該脂肪酶的轉化速率比酯酶要慢，酯酶45 min時對底物的轉化率已接近50%，而該脂肪酶需要10 h轉化率才能達到一半。這個結果有利于揭示野生菌 Bacillus megaterium NK13對外消旋酮基布洛芬氯乙酯的轉化率高、而光學專一性不強是否與微生物中具有轉化不同光學對映體化合物的酶的共存直接相關。

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Cloning and expression of lipase gene to enantioselective resolution of(S)-ketoprofen

Lijuan Xu, Yuhong Zhao, Ruien Liu, Yunying Zhao, and Jinhong Zhang
College of Life Science of Nankai University, Tianjin 300071, China

Received:July 3, 2009;Accepted:November 5, 2009

Supported by:Natural Science Foundation of Tianjin(No.05YFJMJC01100).

Corresponding author:Jinhong Zhang.Tel: +86-21-23508233; E-mail: jinhzhang@nankai.edu.cn天津市自然科學基金項目(No.05YFJMJC01100)資助。