熒光標(biāo)記脂肪酶的固定化及其穩(wěn)定性

徐佳音，張馳，宋錫瑾，王杰

1 浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，杭州 310027 2 浙江大學(xué)化學(xué)系，杭州 310027

熒光標(biāo)記脂肪酶的固定化及其穩(wěn)定性

徐佳音1，張馳1，宋錫瑾1，王杰2

1 浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系，杭州 310027 2 浙江大學(xué)化學(xué)系，杭州 310027

將標(biāo)記有熒光探針FITC(異硫氰基熒光素)的脂肪酶固定化，通過(guò)測(cè)定活性和熒光光譜，探究各種因素對(duì)固定化后熒光標(biāo)記脂肪酶性質(zhì)的影響，并分析活性、構(gòu)象和熒光光譜三者之間的聯(lián)系。研究結(jié)果表明：在固定化脂肪酶過(guò)程中，聚乙二醇 400二丙烯酸酯能形成合理的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，使酶活較高；配體誘導(dǎo)酶的催化構(gòu)象，使酶活性提高到未誘導(dǎo)酶的2倍以上；配體抽提能使脂肪酶活性中心得到釋放從而提高催化活力。固定化脂肪酶的穩(wěn)定性大大提高，在90℃、強(qiáng)酸強(qiáng)堿下固定化酶仍保有原酶70%、60%以上的活性；用鹽酸胍、脲等溶解變性劑浸泡15 d后，酶活性仍然可以保持初始活性的70%以上。熒光光譜能較好地反映脂肪酶的活性和構(gòu)象變化，最適pH和溫度下脂肪酶的熒光強(qiáng)度最低，在溶解變性劑中，熒光強(qiáng)度隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，這表明不同條件下脂肪酶構(gòu)象經(jīng)歷的去折疊過(guò)程不同。

脂肪酶，固定化，穩(wěn)定性，熒光光譜，構(gòu)象

Abstract:The lipase labeled with the fluorescein isothiocyanat(FITC)was immobilized on the derivatives of the polyethylene glycol.The article discussed the effect of factors on the characters of lipase and analyzed the relationships among the activity of lipase, conformation, and fluorescence spectrum while the activity and the fluorescence spectrum of immobilized lipase were determined.The results demonstrated that polyethylene glycol 400-diacrylate could form appropriate network to improve the activity of enzyme.Adding ligand induced the lipase’s catalytic conformation to increase the activity twice more than before.The active centre of lipase could be released by the extraction of ligand thus increasing the activity.After immobilization, the stability of labeled lipase improved greatly: immobilized lipases retained more than 70% and 60% of initial activity under conditions of 90°C and strong acid or alkali, respectively.After immersing immobilized lipases into guanidine hydrochloride or urea for 15 days, the lipases retained upwards of 70% activity.The fluorescence spectrum could obviously reflect the changes of the activity and conformation of lipase.The fluorescence intensity was the minimum in the optimal pH and temperature.In the denaturing agent it declined as time passed.These results indicated that the unfolded processes of immobilized lipases are different under different conditions.

Keywords:lipase, immobilization, stability, fluorescence spectrum, conformation

脂肪酶(Lipase E.C.3.1.1.3)是一類特殊的酯鍵水解酶，它能在油水界面上催化酯水解、酯合成、酯交換及立體異構(gòu)體拆分等有機(jī)合成反應(yīng)，因此工業(yè)用途廣泛，是目前被重點(diǎn)研究的生物催化劑。為了改善生物催化劑使用穩(wěn)定性差、易失活、適應(yīng)反應(yīng)介質(zhì)能力弱等缺點(diǎn)，常將脂肪酶固定化后使用。但這種工作多注重于工藝本身[1-3]，對(duì)脂肪酶固定化后微環(huán)境構(gòu)象變化研究甚少。熒光光譜法是一種根據(jù)蛋白質(zhì)熒光發(fā)射光譜特定部位的熒光強(qiáng)度得到熒光譜圖，進(jìn)而直觀地獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化信息的方法[4]。熒光光譜還可同時(shí)提供激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、熒光強(qiáng)度等許多物理參數(shù)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析和定量測(cè)定[5-6]。本研究將熒光探針異硫氰基熒光素(FITC)[7-8]標(biāo)記到脂肪酶上，然后通過(guò)交聯(lián)聚合固定化脂肪酶。通過(guò)測(cè)定酶活性和熒光光譜，探究pH值、溫度和變性劑對(duì)固定化后熒光標(biāo)記脂肪酶性質(zhì)的影響，獲得固定化后微環(huán)境變化對(duì)脂肪酶影響的信息。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

F-4500熒光分光光度計(jì)，購(gòu)于日本Hitachi公司；pHS-3B型pH計(jì)，購(gòu)于上海雷磁儀器廠；紫外光聚合設(shè)備，自制，波長(zhǎng)365 nm；球形索式抽提器；半透膜，購(gòu)于華東醫(yī)藥，截留分子量8000～12000 Da，直徑34 mm。

脂肪酶(EC3.1.1.3，CRL)，購(gòu)于 Sigma公司，用pH 7.43的磷酸鹽緩沖液配制成2 mg/mL，置于4℃的冰箱中保存；FITC，購(gòu)于 Sigma公司；聚乙二醇200二丙烯酸酯、聚乙二醇400二丙烯酸酯和三羥甲基丙烷三丙烯酸酯(TMPTA)，購(gòu)于天津天驕化工有限公司，工業(yè)級(jí)；月桂酸、氫氧化鈉、乙醇、丙酮、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、琥珀酸二辛酯磺酸鈉(AOT)、橄欖油、聚乙烯醇為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪酶的熒光標(biāo)記

按文獻(xiàn)[9]的方法，將熒光探針 FITC加入到脂肪酶液(按1.2.4法測(cè)得酶液的活力為0.89 U/mL，考馬斯亮藍(lán)法[10]測(cè)得蛋白含量為0.48 mg/mL)中，采用半透膜攪拌透析除去多余的FITC，最后取出透析袋中的熒光標(biāo)記脂肪酶液待用。

1.2.2 脂肪酶的固定化

分別稱取45 g聚乙二醇200二丙烯酸酯和聚乙二醇 400二丙烯酸酯，編號(hào)分別為 Poly-200、Poly-400，各加入3 g月桂酸，待加熱溶解后逐滴滴加FITC熒光標(biāo)記酶液9 mL，隨后加入3.5 mL AOT，直到混合液成為均一的W/O乳化體系為止。然后根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)獲得的單體和交聯(lián)劑的最佳配比量[1]，加入22.5 g交聯(lián)劑TMPTA。向上述2個(gè)混合物中分別加入0.675 g光引發(fā)劑安息香甲醚，待溶解后放入紫外光聚合裝置下聚合45 s。聚合完成后，依次用水和 95%乙醇清洗表面，除去未反應(yīng)完全的原料后，放入溫度為37℃、真空度為0.09 MPa的真空干燥箱干燥，得 2種脂肪酶聚合物(LP)：FITC標(biāo)記LP-200、FITC標(biāo)記LP-400。此外，不加月桂酸的固定化酶聚合物(其余配比不變)作為空白對(duì)照。

1.2.3 配體的洗脫

研磨干燥好的熒光標(biāo)記脂肪酶聚合物，并用40～60目方孔的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩分級(jí)。用濾紙包好研磨后的聚合物顆粒，把它放入球形索式抽提器中，用石油醚(沸程60℃～90℃)為溶劑進(jìn)行抽提，連續(xù)抽提15 h。抽提完畢后放入真空干燥箱，在37℃、真空度為0.09 MPa條件下干燥。

作為對(duì)照，取部分研磨后的粉末直接保存，不進(jìn)行配體的洗脫。

1.2.4 脂肪酶活性測(cè)定

配制150 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的聚乙烯醇溶液，加入50 mL橄欖油后高速攪拌，乳化。取4 mL乳化液與5 mL、pH 7.5的磷酸緩沖液混合后置于37℃水浴中保溫5 min，接著加入1 g脂肪酶聚合物，反應(yīng)15 min后立即取出迅速加入15 mL、乙醇/丙酮(1:1，V/V)終止反應(yīng)，滴加酚酞指示劑3滴，用0.05 mol/L NaOH滴定至溶液變?yōu)榉奂t色為止，以不加酶的溶液作為空白對(duì)照。酶活以在上述條件每分鐘生成1 μmol脂肪酸需要的酶量為1個(gè)活性單位(U)。

1.2.5 熒光光譜測(cè)定

采用F-4500型熒光光度儀測(cè)定熒光光譜，熒光光譜條件：激發(fā)波長(zhǎng)為489 nm，激發(fā)狹縫為2.5 nm，發(fā)射狹縫為1 nm，測(cè)定溫度為25℃，預(yù)保溫15 min，檢測(cè)510～550 nm的熒光發(fā)射光譜。

1.2.6 熒光標(biāo)記LP穩(wěn)定性研究

取一定量的LP-200和LP-400，分別在37℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃的烘箱中放置 1 h后取出，按1.2.4和1.2.5的方法測(cè)定其酶活和熒光光譜，考察熒光標(biāo)記LP的溫度穩(wěn)定性。

取一定量的LP-200和LP-400，分別放入pH值為3.2、4.7、7.4、8.7、11的溶液中1 h，然后過(guò)濾、真空干燥(溫度37℃、真空度0.09 MPa)，測(cè)定熒光標(biāo)記LP的活性和熒光光譜，考察熒光標(biāo)記LP的pH穩(wěn)定性。

取LP-200、LP-400分別放入5 mol/L 的鹽酸胍和8 mol/L的脲溶液中，分別放置2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、15 d，然后過(guò)濾、真空干燥(溫度37℃、真空度0.09 MPa)，考察溶解變性劑對(duì)熒光標(biāo)記LP的活性和熒光光譜的影響。

1.2.7 載體熒光數(shù)據(jù)的處理

計(jì)算固定化后酶蛋白在變性過(guò)程中的相對(duì)構(gòu)象變性量f、相對(duì)活性變化量a以及相對(duì)構(gòu)活比r，公式如下[11-13]：

其中，F(xiàn)N和AN代表酶蛋白最大活性下的熒光值和最大活性值，F(xiàn)和A代表不同變性條件下的實(shí)時(shí)熒光值和活性值。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同聚合單體對(duì)熒光標(biāo)記LP的影響

在脂肪酶固定化過(guò)程中，分別使用Poly-200和Poly-400作為聚合單體的，最后得到的脂肪酶聚合物分別為 LP-200和 LP-400，其對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記的活性見表 1。從中可以看出：經(jīng)熒光探針標(biāo)記的脂肪酶，LP-400的活性要高于LP-200；原因是Poly-400的單體鏈長(zhǎng)，在固定化過(guò)程中產(chǎn)生的網(wǎng)格較大，所以在反應(yīng)過(guò)程中，傳質(zhì)阻力較小，有一定的優(yōu)勢(shì)，因此Poly-400的效果比Poly-200的好。

圖1是連接上FITC后的不同聚合單體對(duì)LP的影響的熒光光譜圖。可以看出，在相同的條件下，LP-400的熒光強(qiáng)度要略高于LP-200，這是由于以下原因：LP-400所包裹脂肪酶形成的構(gòu)象變化利于其活性的表達(dá)，其構(gòu)象相對(duì)LP-200所包裹的構(gòu)象更舒展，使得其熒光強(qiáng)度變大。

2.2 配體誘導(dǎo)對(duì)熒光標(biāo)記LP的影響

在熒光標(biāo)記脂肪酶的固定化過(guò)程中加入月桂酸配體進(jìn)行誘導(dǎo)，以此對(duì)比未加配體的情況，其結(jié)果如表1所示，誘導(dǎo)之后的LP經(jīng)過(guò)配體洗脫后，其活性普遍是未誘導(dǎo)的LP活性的2倍以上。其原因如下：脂肪酶活性中心上存在一個(gè)“蓋子”結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)使酶的活性中心與分子表面相隔開；用配體進(jìn)行誘導(dǎo)之后，酶的構(gòu)象發(fā)生變化，“蓋子”被打開，含活性部位的疏水基團(tuán)易暴露在分子表面，這是底物易與活性中心接觸的催化構(gòu)象；其后進(jìn)行的交聯(lián)聚合能夠捕抓這一催化構(gòu)象，因此宏觀表現(xiàn)為配體誘導(dǎo)后酶的活性更大。

表1 不同單體的FITC標(biāo)記的LP活性Table 1 Activity of FITC labeled LP with different polymer monomers

圖1 不同LP在489 nm激發(fā)下的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectrum of different LP in the excitation wavelength of 489 nm.

圖2是熒光標(biāo)記LP的熒光光譜圖，從中可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)配體誘導(dǎo)的熒光光譜強(qiáng)度要大于未誘導(dǎo)的LP，同時(shí)在 LP-400的光譜中兩者的差異性相對(duì)于LP-200較大。此結(jié)果也與脂肪酶的“蓋子”開合狀態(tài)相關(guān)：當(dāng)存在配體誘導(dǎo)時(shí)，脂肪酶的“蓋子”結(jié)構(gòu)打開，構(gòu)象舒展，其標(biāo)記在隱蔽處的熒光探針也開始接收到激發(fā)光進(jìn)而產(chǎn)生發(fā)射光，因此熒光強(qiáng)度變強(qiáng)；而由于LP-400所采用的聚合單體在脂肪酶的固定化上相對(duì)于LP-200較成功[1]，因此其“蓋子”打開的程度相對(duì)也較大，總體上的構(gòu)象變化也較大，所以表現(xiàn)在熒光光譜上是 LP-400未加配體和加配體的熒光光譜產(chǎn)生了更為明顯的差距。

2.3 配體抽提對(duì)熒光標(biāo)記LP的影響

表 1中顯示了配體的抽提情況對(duì)熒光標(biāo)記 LP的影響，結(jié)果表明：經(jīng)抽提后的LP活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于未抽提 LP的活性。加入的配體為脂肪酶的底物類似物，故脂肪酶與配體的結(jié)合部位是酶的活性中心，不進(jìn)行配體的抽提，脂肪酶的活性將會(huì)降低。

圖2顯示了LP未經(jīng)抽提和已抽提配體的熒光光譜，從這圖中可以發(fā)現(xiàn)，兩者的熒光光譜都比較接近，說(shuō)明兩者在構(gòu)象上較為相似。從理論上來(lái)說(shuō)，抽提的過(guò)程并不會(huì)破壞脂肪酶在載體中穩(wěn)定的構(gòu)象，因此其未抽提的構(gòu)象應(yīng)該與抽提的構(gòu)象完全相似，但是結(jié)果卻與理論不完全相同，其原因是：配體與脂肪酶的連接位點(diǎn)為脂肪酶的活性部位，但由于配體連接上的脂肪酶已經(jīng)進(jìn)行了熒光標(biāo)記，因此配體可能會(huì)遮擋一小部分位于活性部位附近的熒光探針，最終導(dǎo)致未抽提配體的熒光光譜略小于已抽提配體的LP。

2.4 溫度對(duì)熒光標(biāo)記LP的影響

固定化后的熒光標(biāo)記脂肪酶能克服耐熱性差的缺點(diǎn)，提高酶的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，溫度從37℃升高到50℃時(shí)，固定化脂肪酶的活性隨溫度升高逐漸增大，50℃時(shí)脂肪酶的活性最大，比游離脂肪酶的最適溫度高了13℃。但當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記的LP-400和LP-200酶活都降低。對(duì)比液體中的酶活變化情況[9]，可以發(fā)現(xiàn)固定化酶在 90℃仍然具有70%左右的活性，而游離酶在70℃下已完全失活，說(shuō)明固定化后的脂肪酶的熱穩(wěn)定性大大提高，結(jié)果表明：聚合單體和酶分子之間的非共價(jià)作用不但可以很好地維持酶活性構(gòu)象，而且聚合單體和一些氨基酸殘基基團(tuán)的作用力也很有可能增加這些殘基的熱穩(wěn)定性。另外，不同的溫度條件下，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記的LP-200和LP-400的活性變化非常相近，因?yàn)長(zhǎng)P-200和LP-400中聚乙二醇性質(zhì)相差較小，使酶活的變化規(guī)律類似。

圖2 LP-200(A)和LP-400(B)在489 nm激發(fā)下的熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectrum of LP-200(A)and LP-400(B)in the excitation wavelength of 489 nm.

圖3中的熒光光譜圖顯示了在不同溫度下固定化后的脂肪酶的固體熒光光譜圖，對(duì)比兩圖發(fā)現(xiàn)，LP-400和LP-200的37℃和50℃的熒光曲線類似，而與60℃至90℃的熒光曲線存在明顯區(qū)別；同時(shí)酶活曲線也反映出37℃與50℃的活性較接近，而60℃之后活性大幅度下降。37℃至50℃時(shí)脂肪酶的構(gòu)象保持在最佳狀態(tài)，活性高；隨著溫度增加到60℃及以上，活性中心由于整體構(gòu)象的過(guò)于舒展而被破壞，活性表達(dá)能力逐步降低。

對(duì)不同溫度條件下的熒光光譜圖和活性按照公式(1-3)處理后得到相關(guān)數(shù)據(jù)，如表2所示。相對(duì)構(gòu)活比 r是相對(duì)構(gòu)象變性量 f和相對(duì)活性變化量 a的比值，其反映了酶構(gòu)象變化的程度對(duì)活性變化的影響，該數(shù)值越高說(shuō)明盡管酶整體構(gòu)象改變較大，但活性中心處的構(gòu)象改變較小，即構(gòu)象變化位點(diǎn)的重點(diǎn)不在活性中心處，酶的活性變化不大。當(dāng)同一物質(zhì)在同一變性條件下，該理論值應(yīng)該是一個(gè)穩(wěn)定的常數(shù)，但是考慮到實(shí)際情況的復(fù)雜性，r值會(huì)有所波動(dòng)，但是波動(dòng)幅度越小越好，波動(dòng)越小說(shuō)明熒光光譜反映的構(gòu)象變化越真實(shí)越精確。從表 2中可以得到：在不同溫度條件下，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記的LP-200的r值為0.52左右，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記的LP-400的r值為0.65，表明在不同的溫度下，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記的LP-200構(gòu)象的變化對(duì)酶活力影響較小。

2.5 pH值對(duì)熒光標(biāo)記LP的影響

脂肪酶經(jīng)過(guò)固定化后，它的最適pH仍然為7.4，但是耐酸耐堿性大幅度提高，即使到了較為極端的pH值(pH 3.2和pH 11.0)，也能始終保持60%以上的活性，體現(xiàn)出了固定化后的優(yōu)勢(shì)。經(jīng)過(guò)FITC標(biāo)記后的LP-200和LP-400的活性下降規(guī)律基本相同，都是隨著酸堿強(qiáng)度的增大，酶活性逐步降低。

圖4中的熒光光譜圖表明在最適pH 7.4時(shí)脂肪酶的熒光強(qiáng)度最低，隨著酸性和堿性的增加，熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)。與溫度對(duì)脂肪酶的作用機(jī)理相同，最適pH條件下脂肪酶結(jié)構(gòu)緊湊，F(xiàn)ITC的熒光被掩蓋，因此熒光強(qiáng)度最低；偏離最適pH越遠(yuǎn)，酶結(jié)構(gòu)逐漸舒展，熒光強(qiáng)度增大，同時(shí)活性降低。

對(duì)不同 pH值條件下的熒光光譜圖和活性圖按照公式處理后得到相關(guān)數(shù)據(jù)，如表3所示。從表中可以得到：在非最適 pH條件下，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記的LP-200的r值為0.5左右，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記的LP-400的r值為0.6，表明 FITC熒光標(biāo)記的LP-200在pH條件下構(gòu)象的變化程度對(duì)酶活影響較小。同時(shí)將在不同溫度條件下的熒光標(biāo)記LP的r值和pH值變性條件下的r值比較，在熒光探針標(biāo)記和同種聚合單體下的LP的r值比較接近，存在較好的重復(fù)性。

表2 FITC熒光標(biāo)記的LP-200和LP-400在不同溫度下的處理數(shù)據(jù)Table 2 Data of FITC labeled LP-200 and LP-400 at different temperatures

表3 FITC熒光標(biāo)記的LP-200和LP-400在不同pH值下的處理數(shù)據(jù)Table 3 Data of FITC labeled LP-200 and LP-400 at different pH

圖4 FITC熒光標(biāo)記的LP-200(A)和LP-400(B)在不同pH值下的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectrum of FITC labeled LP-200(A)and LP-400(B)at different pH.

2.6 溶解變性劑對(duì)熒光標(biāo)記LP的影響

熒光標(biāo)記LP在5 mol/L鹽酸胍或8 mol/L脲的作用下，隨著時(shí)間的推移，酶活逐漸降低，但是降低趨勢(shì)逐漸減小，10 d后酶活趨于穩(wěn)定。對(duì)比游離脂肪酶的變性實(shí)驗(yàn)，熒光標(biāo)記的游離脂肪酶在鹽酸胍或脲的作用下 2 h后就完全失活，而經(jīng)過(guò)固定化后，15 d后活性仍然有70%以上，顯示出了固定化后酶的良好穩(wěn)定性。對(duì)比兩種聚合單體Poly-200和Poly-400，可以發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過(guò) Poly-400固定化的脂肪酶在溶解變性劑的作用下，在前幾天的活性保持率要略高于Poly-200的情況，但是等到活性穩(wěn)定后，其活性值與后者差距不大。

圖5、6中的熒光光譜圖顯示了熒光標(biāo)記LP在鹽酸胍和脲的作用下的熒光光譜變化，其變化趨勢(shì)同活性基本相同，都是前期變化幅度大，后期基本穩(wěn)定。但是其熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)與之前的溫度、pH值變性的固體熒光光譜恰好相反，其原因應(yīng)是由于變性過(guò)程中構(gòu)象去折疊所經(jīng)歷的過(guò)程不同導(dǎo)致的。

對(duì)在溶解變性劑作用下的熒光光譜圖和活性曲線按照公式處理后得到相關(guān)數(shù)據(jù)，如表4、5所示。從表中可以得到：在5 mol/L鹽酸胍或8 mol/L脲作用下，F(xiàn)ITC標(biāo)記的 LP-200、LP-400的 r值在0.95～1.20之間，都非常接近。這表明 LP在兩種變性劑中的構(gòu)象變化對(duì)活性產(chǎn)生影響的過(guò)程非常相似，間接表明了5 mol/L鹽酸胍和8 mol/L脲具有非常一致的構(gòu)象變性作用。

表4 FITC熒光標(biāo)記的LP-200和LP-400在5 mol/L鹽酸胍作用下的處理數(shù)據(jù)Table 4 Data of FITC labeled LP-200 and LP-400 in the 5 mol/L guanidine hydrochloride

表5 FITC熒光標(biāo)記的LP-200和LP-400在8 mol/L脲作用下的處理數(shù)據(jù)Table 5 Data of FITC labeled LP-200 and LP-400 in the 8 mol/L urea

圖5 FITC熒光標(biāo)記的LP-200(A)和LP-400(B)在5 mol/L鹽酸胍作用下的熒光光譜Fig.5 Effect of 5 mol/L guanidine hydrochloride on the fluorescence spectrum of FITC labeled LP-200(A)and LP-400(B).

圖6 FITC熒光標(biāo)記的LP-200(A)和LP-400(B)在8 mol/L脲作用下的熒光光譜Fig.6 Effect of 8 mol/L urea on the fluorescence spectrum of FITC labeled LP-200(A)and LP-400(B).

3 結(jié)論

采用聚乙二醇 200二丙烯酸酯和聚乙二醇 400二丙烯酸酯兩種單體對(duì)標(biāo)記有FITC的脂肪酶進(jìn)行固定化，結(jié)果表明由于后者主鏈較長(zhǎng)，在載體化過(guò)程中產(chǎn)生的網(wǎng)格較大，使得形成的脂肪酶構(gòu)象更舒展，熒光強(qiáng)度更大，酶活更高。

用月桂酸作為配體對(duì)脂肪酶進(jìn)行誘導(dǎo)后再進(jìn)行固定化，誘導(dǎo)之后的LP活性普遍是未誘導(dǎo)的LP活性的 2倍以上。說(shuō)明配體能夠誘導(dǎo)酶處于催化構(gòu)象從而更適合活性的表達(dá)，然而不對(duì)配體抽提會(huì)導(dǎo)致脂肪酶活性中心被配體占據(jù)，降低酶對(duì)目標(biāo)底物的催化活性。

對(duì)固定化酶的穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，酶的最適溫度為50℃，比游離脂肪酶的最適溫度高了13℃，且在90℃時(shí)仍保持有原酶70%的活性；耐酸堿性大幅度提高，即使到了較為極端的pH值下，也能始終保持60%以上的活性。最適pH或溫度條件下脂肪酶的熒光強(qiáng)度最低，隨變性過(guò)程的進(jìn)行，酶構(gòu)象逐漸舒展，熒光強(qiáng)度逐漸增大，活力逐漸降低。固定化脂肪酶在鹽酸胍和脲溶解變性劑中，15 d后活性仍然有70%以上。但溶解變性劑對(duì)脂肪酶的變性作用機(jī)理與溫度、pH不同，因?yàn)樽冃赃^(guò)程中熒光強(qiáng)度的變化趨勢(shì)恰好相反。

REFERENCES

[1]Gong W, Song XJ, Wang J.Study on lipase conformation recording and its stability.J Zhejiang Univ(Eng Sci), 2006,40(5): 841?844.龔偉, 宋錫瑾, 王杰.脂肪酶構(gòu)象刻錄及穩(wěn)定性研究.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(工學(xué)版), 2006, 40(5): 841?844.

[2]Zeng SH, Yang JK, Yan YJ.Studies on stability of immobilized lipase and its application.Chin J Bioproc Eng, 2007, 5(1): 45?49.曾淑華, 楊江科, 閆云君.固定化脂肪酶性質(zhì)及其應(yīng)用研究.生物加工過(guò)程, 2007, 5(1): 45?49.

[3]Fishman A, Cogan U.Bio-imprinting of lipases with fatty acids.J Mol Catal B: Enzym, 2003, 22(3/4): 193?202.

[4]Jiao M, Lang Y, Li HT, et al.Studies on the unfolding of catalase induced by urea and guanidine hydrochloride.Acta Chim Sin, 2003, 61(9): 1362?1368.焦銘, 梁毅, 李洪濤, 等.脲和鹽酸胍誘導(dǎo)過(guò)氧化氫酶去折疊的研究.化學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 61(9): 1362?1368.

[5]Wang SY, Xu XL, Liu QL, et al.The application of fluorescence spectroscopy in the study on protein conformation.Progress Chem, 2001, 13(4): 257?260.王守業(yè), 徐小龍, 劉清亮, 等.熒光光譜在蛋白質(zhì)分子構(gòu)象研究中的應(yīng)用.化學(xué)進(jìn)展, 2001, 13(4): 257?260.

[6]Xu TK, Li N, Shen XH, et al.Interaction of surface active fluorescence probes and bovine serum albumin.Spectrosc Spectral Anal, 2005, 25(9): 1443?1445.徐同寬, 李娜, 沈興海, 等.表面活性熒光探針分子與牛血清蛋白的相互作用.光譜學(xué)與光譜分析, 2005,25(9): 1443?1445.

[7]Schnaible V, Przybylski M.Identification of fluorescein-5’-isothiocyanate-modification sites in proteins by electrospray-ionization mass spectrometry.Bioconjugate Chem, 1999, 10(5): 861?866.

[8]Lin SH, Faller LD.Preparation of Na, K-ATPase specifically modified on the anti-fluorescein antibodyinaccessibile site by fluorescein 5’-isothiocyanate.Anal Biochem, 2000, 287(2): 303?312.

[9]Zhang C, Song XJ, Wang J, et al.Stability and fluorescence spectra of lipase labeled with FITC.Chin J Appl Chem, 2008, 25(12): 1381?1384.張弛, 宋錫瑾, 王杰, 等.FITC標(biāo)記脂肪酶的穩(wěn)定性和熒光光譜.應(yīng)用化學(xué), 2008, 25(12): 1381?1384.

[10]Li JW, Yu RY, Yuan MX, et al.Principle and Method of Biochemical Experiment.Bejing: Bejing University Press,1994: 174.李建武, 余瑞元, 袁明秀, 等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法.北京: 北京大學(xué)出版社, 1994: 174.

[11]Ye MQ, Yi TY, Li HP, et al.Study on thermal and thermal chemical denaturation of bovine immunoglobulin G.Acta Chim Sin, 2005, 63(22): 2047?2054.葉茂青, 易同寅, 李華屏, 等.牛血清IgG熱化學(xué)變性和熱變性的研究.化學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 63(22): 2047?2054.

[12]Moosavi-Movahedi AA, Nazari K.Denaturation of horseradish peroxidase with urea and guanidine hydrochloride.Int J Biol Macromol, 1995, 17(1):43?47.

[13]Farruggia B, Pico GA.Thermodynamic features of the chemical and thermal denaturations of human serum albumin.Int J Biol Macromol, 1999, 26(5): 317?323.

Immobilization of lipase labeled with fluorescent probe and its stability

Jiayin Xu1, Chi Zhang1, Xijin Song1, and Jie Wang2
1 Department of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China 2 Department of Chemistry, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China

Received:August 19, 2009;Accepted:November 19, 2009

Supported by:National Natural Science Foundation of China(No.20276067).

Corresponding author:Xijin Song.Tel: +86-571-87951224; E-mail: xjsong@zju.edu.cn國(guó)家自然科學(xué)基金(No.20276067)資助。