一種利用基因表達變化檢測、鑒別抗生素的新方法

趙冰，孫趙麟，楊亮，梁海華，沈立新，段康民

西北大學生命科學學院 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術教育部重點實驗室，西安 710069

一種利用基因表達變化檢測、鑒別抗生素的新方法

趙冰，孫趙麟，楊亮，梁海華，沈立新，段康民

西北大學生命科學學院 西部資源生物與現(xiàn)代生物技術教育部重點實驗室，西安 710069

本研究利用基因表達變化構建一個高通量檢測篩選抗生素化合物的新方法。采用含 luxCDABE報道子的質粒pCS26和 pMS402為載體，構建大腸桿菌重組質粒、篩選銅綠假單胞菌以及沙門氏菌的隨機啟動子庫，獲得對抗生素有反應的啟動子-報道子融合體，構成抗生素篩選體系。通過重復實驗篩選出15個啟動子-報道子融合體，它們對不同抗生素有不同的反應，通過這一系統(tǒng)可以檢測樣品中的抗生素，并初步判斷與現(xiàn)有抗生素的異同。使用這種方法可以進行高通量篩選潛在的抗菌物質。

抗生素，篩選，啟動子，報道子

Abstract:We designed and constructed an antibiotic screening system by using antibiotic responsive genes as reporters.Plasmid pCS26 carrying a promoterless luminescence reporter, luxCDABE, was used as the vector and the promoter regions of antibiotic responsive genes/operons from Escherichia coli were cloned upstream of the lux reporter to form the first part of the screening reporter array.Random promoter library of Salmonella enterica and Pseudomonas aeruginosa were screened for antibiotic responsive clones which consist of the second part of the screening array.The selected final reporter array responded to different antibiotics in distinct patterns and enabled in vivo high-throughput screening for antibiotics.Unknown antibiotics could, in general,be classified by analyzing the response patterns.This screening system is both sensitive and efficient and should prove to be a useful tool for screening new antibiotic compounds.

Keywords:antibiotics, screening, promoter, reporter

由于抗藥性的出現(xiàn)和蔓延，臨床使用的抗生素在逐漸失去效用，開發(fā)新的抗生素已成為人類醫(yī)學和微生物學的一個緊迫課題[1-3]，而新的篩選方法是新型抗生素研究的關鍵之一。新抗生素篩選方法需要具有高特異性和高靈敏性，而且最好可以對大量樣品進行高通量檢測[4]。

傳統(tǒng)的抗生素篩選模型主要基于病原菌的體外實驗檢測尋找殺菌或抑菌物，其優(yōu)點是得到的化合物可以進入病原菌細胞；缺點是作用點不明確，難以進行化學改進，篩選過程有明顯的隨機性，而且不靈敏[5]。上世紀70、80年代起進行的靶點篩選技術，主要是利用體外篩選體系，尋找生物化學抑制物，優(yōu)點是比較靈敏，可檢測低效物，可用于化學改進，而且篩選方便。但缺點是需要將體外實驗轉化為體內實驗，篩選到的化合物常常面臨難以進入細胞的問題[6-7]?；驑擞浄椒ㄊ钱斍昂Y選方法中最先進的技術之一。通過標記特殊基因，尋找相關生物活性物，優(yōu)點是靈敏、可檢測低效物、可用于化學改進、易篩選、高通量、可進入細胞。但缺點是需要前期知識，需要建立系統(tǒng)[8]。

本實驗利用以熒光素酶(Luciferase)基因(lux- CDABE)作為報道子的高通量基因表達檢測技術，發(fā)現(xiàn)甄別對低于抑制濃度(Sub-inhibitory concentration)已知抗生素有反應的啟動子。使用這些啟動子-報道子系統(tǒng)進行抗生素的分類篩選。具備高通量、靈敏、高效等特點。

1 材料

1.1 菌株、培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)pKD-phzA1[9]、大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)10B，質粒 pMS402、pCS26、銅綠假單胞菌隨機啟動子文庫[10]、沙門氏菌Salmonella enterica隨機啟動子文庫[11]均為本實驗室保存。常規(guī)使用的培養(yǎng)基為LB，大腸桿菌、沙門氏菌和銅綠假單胞菌常規(guī)培養(yǎng)在 LB 培養(yǎng)基中 37℃有氧過夜培養(yǎng)。含有質粒的菌株根據(jù)需要分別添加卡那霉素(50 μg/mL)和甲氧芐氨嘧啶(300 μg/mL)。測試用菌使用前接單菌落到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，加入相應抗生素，37℃搖床培養(yǎng)14 h后，調整OD600到0.440±0.01。

1.2 主要試劑和儀器

酵母粉、胰蛋白胨為英國Oxoid公司產品；氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)、羧芐青霉素(Carbenicillin，Cb)、氯霉素(Chloramphenicol，Cm)、紅霉素(Erythromycin，Em)、四環(huán)素(Tetracycline，Tc)、慶大霉素(Gentamicin，Gm)、壯觀霉素(Spectinomycin，Spe)、甲氧芐氨嘧啶(Trimethoprim，Tmp)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，Cip)、利福平(Rifampicin，Rif)、磺胺(Sulfanilamide，SAs)、卡那霉素(Kanamycin，Kan)、瓊脂粉均來自Wolsen公司；多粘菌素(Polymixin，poly)來自Sigma公司；DMSO、EDTA、Tris-base、培養(yǎng)基均為美國Amresco公司產品；限制性內切酶BamH I、Xho I購自美國 New England BioLabs公司；T4 DNA連接酶由TaKaRa公司提供；Taq酶、dNTPS均購自北京天為時代公司；DNA 產物純化試劑盒購自北京鼎國公司；其他試劑均為國產分析純。Wallac 1420 Multilabel Counter購自 PerkinElmer公司；離心機Centrifuge5415D、Centrifuge5810R、PCR儀Mastercycle Gradient均購自 Eppendorf公司；Luminescent Image Analyzer LAS 3000 購自 Fujifilm公司；96孔板、384孔板均為 Costar公司產品；Multi-blot Replicator(48 pins and 96 pins)為V&P公司產品。

2 方法

2.1 大腸桿菌脅迫相關基因重組質粒的構建

PCR擴增6個已知脅迫相關基因的啟動子區(qū)域并將其克隆到含有l(wèi)uxCDABE 報道子的pCS26報道質粒上。以大腸桿菌染色體基因組為模板，利用特定的引物(表1)PCR擴增各個不同的啟動子片段。PCR產物用 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴增產物用DNA純化試劑盒純化后，用Xho I和BamH I酶切，以T4 DNA連接酶連接到用相同酶切的質粒pCS26上，電轉化至10B菌株中，在含有卡那霉素的平板上篩選陽性克隆。獲得帶有相應基因啟動子-lux報道子融合體質粒。相應基因的啟動子活性以lux發(fā)光量(Counts per second，CPS)來表示。其他分子生物學操作依據(jù)報道的方法進行[12]。

2.2 啟動子庫篩選的方法

通過環(huán)丙沙星和羧芐青霉素對銅綠假單胞菌和沙門氏菌隨機啟動子庫進行篩選。對銅綠假單胞菌Cb和 Cip的濃度分別為 5 μg/mL和 0.1 μg/mL；對沙門氏菌 Cb和 Cip的濃度分別為 7.5 μg/mL和0.005 μg/mL。將構建好的隨機啟動子庫[10-11]接到含有上述濃度Cip或是Cb的含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基的 384孔板中，37℃過夜培養(yǎng)，然后使用 96針轉接器將該庫中所有克隆同時轉接到384孔板的Cip和Cb培養(yǎng)基中，將384孔板放在Victor Multilabel Counter 中于37℃每隔6 h對菌體的發(fā)光情況進行檢測，共計檢測30 h。以無抗生素培養(yǎng)基中菌體的發(fā)光值為對照，將在含有Cip或是Cb培養(yǎng)基中發(fā)光值增加3倍或3倍以上變化的克隆挑出，采用同樣的方法轉接至另一個384孔板中，每隔2 h檢測其發(fā)光值，共計檢測28 h，再將含抗生素條件下發(fā)光值有3倍或3倍以上變化的克隆挑出。最后將篩選出的陽性克隆轉接到底部透光的黑色96孔板中，在Victor Multilabel Counter中每隔 0.5 h檢測其發(fā)光值，同時檢測其OD600值，共計檢測24 h[11]。

表1 大腸桿菌中6個與脅迫相關因子的引物序列Table 1 Sequences of the primers used for PCR amplifying E.coli stress response gene promoters

2.3 DNA測序和序列分析

使 用 pZE.05(5′CCAGCTGGCAATTCCGA-3′)和 pZE.06(5′AATCATCACTTTCGGGAA-3′)分別作為正向和反向引物[11]，對篩選出的對抗生素有反應的克隆進行PCR擴增，擴增產物用pZE.06為引物進行測序，并使用Vector NTI軟件(Invitrogen公司)進行后續(xù)分析，確定有關克隆上的基因。

2.4 雙層培養(yǎng)基混菌法抗生素反應的測試

下層為1%固體瓊脂LB培養(yǎng)基，上層為0.5%瓊脂 LB培養(yǎng)基并混合菌液。將混菌的培養(yǎng)基平板置于無菌操作室，風干20 min。然后在培養(yǎng)基中加入不同抗生素1.5 μL，在不同菌中抗生素的濃度不同(表2)。37℃過夜培養(yǎng)，然后于Las-3000下照相。

表2 實驗中抗生素的使用濃度Table 2 Concentrations of antibiotics used for different bacteria(μg/mL)

2.5 液體培養(yǎng)基中抗生素反應測試

在黑色底部透明 96孔板中加入 80 μL培養(yǎng)基(含相應抗生素)。稀釋過夜培養(yǎng)的菌液20倍，即取100 μL菌液到2 mL LB培養(yǎng)基中，然后分別將上述稀釋后的菌液加入到96孔板中，每孔加入10 μL。按計算好的抗生素濃度(表 2)將抗生素母液加入每行的第二孔中，然后依次做梯度稀釋直到每行的倒數(shù)第一個孔，第一個孔加10 μL水為對照，一塊96孔板上重復兩組進行檢測。同時用50 μL礦物油覆蓋。在 Wallac 1420 Victor Multilabel Counter上于37℃每隔0.5 h測定 OD600值，共測定24 h。

3 結果

3.1 對抗生素有反應的啟動子的篩選

3.1.1 已報道的大腸桿菌脅迫相關基因的重組質粒的建立

細菌普遍存在應對壓力的脅迫響應基因(Stress response genes)。一定濃度抗生素的存在對細菌的生長有所影響，是一種生存壓力(Stress)，脅迫響應基因對其有響應，因而可以作為報道子檢測抗生素的存在[13]。實驗選取大腸桿菌中6個已報道的脅迫相關基因構建報道重組質粒，用以檢驗抗生素對脅迫相關基因的影響，并檢驗以此作為抗生素報道子的可行性。6個與脅迫相關基因的啟動子克隆到以熒光素酶基因為報道子的 pCS26質粒上，經PCR擴增后獲得重組質粒中啟動子序列(圖1)，并經測序驗證。構建好的融合報道質粒分別命名為pBZ-cspA、pBZ-dinD、pBZ-ibpAB、pBZ-recA、pBZ-rpoH、pBZ-uvrA。

3.1.2 對抗生素有反應的銅綠假單胞菌和沙門氏菌隨機啟動子的篩選

高濃度的抗生素可以殺菌或抑菌，但低于抑制濃度的抗生素可以作為信號分子調節(jié)包括致病因子在內的許多基因的表達[14]。這些對抗生素有反應的基因反過來可以用于檢測抗生素的存在。從細菌隨機啟動子庫中篩選對抗生素有反應的啟動子克隆是構建篩選體系的另一個途徑。

本研究以環(huán)丙沙星和羧芐青霉素對沙門氏菌和銅綠假單胞菌部分隨機啟動子庫[9-10]進行了篩選。其中銅綠假單胞菌含有質粒pMS402，沙門氏菌含有質粒 pCS26。pMS402質粒和 pCS26質粒帶有無啟動子的luxCDABE報道基因，插入外源啟動子后，通過luxCDABE發(fā)光的大小表明啟動子的活性。以未添加抑制濃度抗生素條件下的基因表達情況為對照，初步從銅綠假單胞菌隨機啟動子庫的1920個克隆中篩選出在添加抑制濃度抗生素條件下表達情況有3倍或3倍以上變化的克隆，其中對Cb有反應的82個，Cip 218個，隨后對這些克隆分別在2種條件下于底部透光的96孔板中進行第2次、第3次篩選。挑選發(fā)光值發(fā)生3倍或3倍以上變化的克隆，并通過 2次平行實驗進行進一步驗證，最后確定受 Cb調節(jié)的基因有1個，受Cip調節(jié)的基因有2個。Cip對其為正向激活作用，即Cip促進其啟動子的表達，結果見表2前3個基因。在對沙門氏菌隨機啟動子庫進行篩選最終獲得受調節(jié)的基因有 19個。12個對Cip敏感，而且Cip對其表現(xiàn)都為正向激活作用。7個基因對Cb敏感，對ycfC、traI 、rrlA為抑制作用，其余都是正調節(jié)(表3)。

圖1 重組質粒的PCR鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmids by PCR.M: DNA marker; 1: cspA; 2: dinD; 3: ibpAB; 4: recA; 5: rpoH; 6: uvrA.

表3 抗生素反應菌株測序比對的相關數(shù)據(jù)Table 3 List of the genes identified that were regulated by subinhibitory concentrations of antibiotics

3.2 篩選系統(tǒng)的檢驗

3.2.1 固體平板上抗生素對細菌啟動子的影響情況

本試驗選擇 12種抗菌藥物對已篩選出的對抗生素有反應的報道子進行雙層培養(yǎng)基法混菌，在含菌的平板上分別點上12種抗生素，在Las-3000下檢測啟動子的發(fā)光強度。

這些對抗生素有反應的啟動子使熒光素酶基因表達而發(fā)光。發(fā)光的強弱顯示啟動子的活性即通過測定菌體發(fā)光的強弱來反映基因的表達水平。圖2是混合含有recA基因作為啟動子的大腸桿菌和含有glgB作為啟動子的沙門氏菌的雙層培養(yǎng)以及它們對不同抗生素的反應結果。其中黑色區(qū)域代表此處啟動子受正向激活作用，熒光素酶發(fā)光增強。這些結果表明，同一種抗生素可以引起不同基因表現(xiàn)出不同的反應。而同一基因對不同抗生素的反應也不相同，有的受到激活，有的受到抑制，有的對抗生素沒有反應。

圖2 兩個代表性啟動子-報道子對12種抗生素的反應Fig.2 Representative responses of two promoters to 12 antibiotics.(A)recA.(B)glgB.Black zones on the plates indicate that luminescence is elevated.Imaging obtained using Las-3000.

圖3 對29種啟動子的cluster分析圖譜Fig.3 Cluster analysis of antibiotic responsive reporters.

為了比較不同基因的反應，將不同種類抗生素對基因的影響進行cluster分析[15]，結果將類似反應的基因歸為8個clusters(圖3)。從每個cluster中選取代表性報道子，最終從29個基因中篩選出15個基因，分別是uvrA、recA、dinD、glgB、hha、(yadI)STM0718、yaaU、iciA、leuA、yegQ、PSLT046、phzA1、PA4643-4642、PA0508、PA0006-lptA。

3.2.2 液體培養(yǎng)基中抗生素對啟動子的影響情況

對這15個基因在液體LB培養(yǎng)基中的表達情況進行驗證。發(fā)現(xiàn)抗生素對基因的表達影響也存在于液體培養(yǎng)基中。圖4是液體培養(yǎng)基中抗生素對2個代表基因的抑制和促進。

3.3 通過報道子檢驗未知抗生素X

為了進一步檢驗獲得的篩選系統(tǒng)，通過選取的15個報道子對一個抗生素樣品進行了檢測。采用雙層培養(yǎng)基法進行菌液培養(yǎng)，并在平板上點不同抗生素，通過對比抗生素X與其他抗生素對啟動子發(fā)光的影響，發(fā)現(xiàn)X與Tc、Gm、Spe對同種啟動子的促進作用的相似性高于其他抗生素。后經驗證為硫酸新霉素，屬于氨基糖苷類抗生素。說明這種抗生素篩選模型可以進行初步的抗生素類別鑒定。

4 討論

圖4 低濃度抗生素對recA和PA0508的表達調節(jié)Fig.4 Effect of subinhibitory antibiotic on the expression of recA(A)and PA0508(B).(A)The inhibitory of Spe to recA.(B)The promotery of Em to PA0508.Cps represents the expressin of gene;OD represents the growth of gene.

抗生素是微生物在生長過程中分泌的一類次級代謝物，非微生物基本生命活動所必需。這些化學物質在一定濃度下具有抑制或殺死其他微生物的作用。但是，隨著研究的不斷深入，抗生素除傳統(tǒng)意義上的抑菌和殺菌外，還表現(xiàn)出其他的活性[14]。特別是在低于最小抑制濃度的條件下，抗生素作為一種信號分子對外界基因的表達具有調節(jié)作用。低于抑制濃度的抗生素可以調節(jié)致病因子的表達[16-18]，誘導病原菌的抗藥性[19]，影響微生物群體中細胞間的相互作用以及微生物與寄主的相互作用[20]。所以高濃度的抗生素對細菌是抑制的，而低濃度時很可能促進細菌的生存[14]。而抗生素對細菌的不同作用也就提供了通過細菌來辨別抗生素的可能性。

本研究采用pMS402和pCS26為載體，通過克隆和隨機啟動子文庫篩選的方法，選取對低于抑制濃度抗生素有反應的報道子構成抗生素篩選體系。這些質粒載體特性是都具有一個多克隆位點，以及缺失啟動子的報道基因 luxCDABE，并帶有強轉錄終止子，pMS402具有卡那霉素和甲氧芐氨嘧啶的抗性基因，pCS26具有卡那霉素抗性基因。luxCDABE基因的表達強弱直接體現(xiàn)了啟動子活性的大小，因此，通過構建啟動子-lux報道子的融合體，便于在固體平板上和液體培養(yǎng)基中檢測啟動子的活性。可以更直觀地檢測抗生素對啟動子的影響。

實驗構建的大腸桿菌重組質粒含有脅迫相關基因：基因recA、uvrA、dinD是已被報道的與大腸桿菌SOS修復相關的基因[21]。SOS修復系統(tǒng)是生物細胞在修復DNA損傷的一套網絡系統(tǒng)，在DNA損傷時，LexA調控自身及其下游的其他30多種SOS修復蛋白的表達，其中RecA和UvrA是SOS系統(tǒng)中研究最多的兩種修復蛋白，在DNA損傷后表達大大增加[22]。將報告基因置于recA和uvrA啟動子調控下，一旦環(huán)境樣品中存在致畸物，將損傷細胞DNA，從而誘導報告基因的表達，最后通過報告基因表達的強度來判斷致畸物的含量。當喹諾酮藥物作用于細菌DNA時，引起SOS反應[23]，促進recA、uvrA、dinD等一系列SOS相關基因表達，在實驗中也可以看到喹諾酮類藥物Cip對這3個基因有促進表達的作用。這與文獻報道的結果相一致。

篩選體系中大部分報道子是對實驗室保存的銅綠假單胞菌和沙門氏菌隨機啟動子庫篩選得到的。測序分析表明這些啟動子控制的基因功能多樣(表2)，并非是由于脅迫相關的基因。這表明低于抑制濃度的抗生素的確對基因組中很多基因具有調節(jié)作用，這種情況下的抗生素更可能的是以信號分子起作用[14]。但是，抗生素對這些基因的具體調節(jié)還有待進一步研究。

本研究建立的由 15個啟動子-報道子融合體構成的抗生素篩選體系對代表各大類不同的抗生素都有不同的反應，可以用來檢測樣品中是否存在抗生素成分，表明這一體系具有篩選潛在抗生素的功能。可以預計，系統(tǒng)將難以避免獲得假陽性結果，這將依賴進一步的檢驗進行排除。通過比較該篩選體系中啟動子對已知抗生素的反應，同時可以初步判斷樣品抗生素是否與已知的抗生素相同?？傊?，這一系統(tǒng)將是抗生素物質篩選中有用的新型工具。

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Construction of a promoter reporter array for antibiotic screening

Bing Zhao, Zhaolin Sun, Liang Yang, Haihua Liang, Lixin Shen, and Kangmin Duan
Key Laboratory of Resources Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education, Faculty of Life Sciences, Northwest University,Xi’an 710069, China

Received:May 13, 2009;Accepted:November 11, 2009

Supported by:National Natural Science Foundation of China(Nos.30870097, 30611120520).

Corresponding author:Kangmin Duan.Tel: +86-29-88305288; E-mail: kduan@nwu.edu.cn國家自然科學基金(Nos.30870097, 30611120520)資助。