改進計時電流法的數學模型和電路實現

陳旭海 陳敬華 潘海波 李玉榕 杜 民,* 林新華

(1福州大學電氣工程與自動化學院,福州 350000; 2福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術重點實驗室,福州 350000;3福建省醫(yī)科大學藥學院藥物分析學系,福州 350000)

改進計時電流法的數學模型和電路實現

陳旭海1,2陳敬華3潘海波2李玉榕2杜 民2,*林新華3

(1福州大學電氣工程與自動化學院,福州 350000;2福建省醫(yī)療器械和醫(yī)藥技術重點實驗室,福州 350000;3福建省醫(yī)科大學藥學院藥物分析學系,福州 350000)

當采用電化學計時電流法對樣品進行檢測時,由于檢測系統的延遲,采集到的電化學信號會產生偏差,這種現象在多通道電化學信號快速采集時尤為明顯.為克服該問題,我們提出一種新的電化學方法來快速產生電流峰值,通過測量峰值快速準確地測出被測物濃度.本文首先為該方法建立理論模型,推導出電流峰值與被測物的濃度關系;再引入經典控制理論中的控制環(huán)節(jié)來改進傳統電化學電路以實現該方法,并加入峰值檢測電路來準確獲取電流峰值信號;最后,利用該方法研究K3[Fe(CN)6]和3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB)溶液的電化學反應,證明了本方法相比傳統計時電流法具有更高的信噪比和靈敏度,電流峰值與濃度呈線性關系,并且檢測結果不受采樣時間延遲的影響,克服了計時電流法的不足.

計時電流法; 電化學分析儀; 峰值檢測器; 慣性環(huán)節(jié)

Abstract：To overcome the disadvantages of chronoamperometry we report a novel electrochemical method where a peak current is quickly generated for the current vs time curve by changing the waveform of voltage excitation in the working electrode.In particular,we derived a mathematical model to illustrate the principle of this method and it can also be used to demonstrate that the peak current is linear with regards to the concentration of the target substance.Moreover,we developed a device with an improved electrochemical circuit using a control element from control theory to change the waveform of voltage excitation.The improved circuit can detect the peak automatically without a precise sample time.Finally,the device was used to study the electrochemical behavior of K3[Fe(CN)6]and 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine(TMB).We show that the method has a better signal to noise ratio and higher sensitivity than chronoamperometry.The obtained peak current is linear with regards to the concentration of the target substance and can be quickly detected without a precise sample time.

Key Words： Chronoamperometry;Electrochemical analyser;Peak detector;Inertial element

計時電流法是一種簡單且應用廣泛的電化學檢測技術.它的工作原理是:在工作電極與參比電極之間施加一個階躍電勢作為激勵,由氧化還原反應產生的隨時間變化的響應電流流過工作電極和對電極,電流初始值較大,并隨時間逐漸減小.Cottrell根據擴散定律,采用拉普拉斯變換對溶液中一個平面電極上濃度的線性擴散做了理論推導,得到了著名的Cottrell方程[1]:

其中,iCottrell為階躍電勢激勵下的響應電流;F為法拉第常數;n為電極反應的電子轉移數;A為電極表面積;為電活性物質在溶液中的初始濃度;D為電活性物質的擴散系數;t為電解時間.該方程為計時電流法建立了較精確的數學模型,即電流與電解液的本體濃度成正比,且反比于時間的平方根.隨后,許多基于計時電流法與Cottrell方程的電化學檢測技術迅速發(fā)展起來,如:取樣電流伏安法、多電勢階躍法、計時電量法等[2-3].由于計時電流法具有硬件要求低、通用性強、穩(wěn)定性和重復性好等特點,這些基于計時電流法的檢測技術亦廣泛應用于電化學研究、疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等領域[4-8].值得注意的是,近年來基于多通道電化學電極陣列的生物傳感器已成為研究熱點[9-11],許多研究采用計時電流法,從優(yōu)化實驗條件、改進生物傳感器的角度出發(fā),改善多通道電化學生物傳感器的靈敏度與特異性[12-14].

然而,計時電流法在實際應用中仍存在一定局限.根據方程(1),電壓施加一段時間后,微弱的電流值容易受到儀器內部和外部的電磁干擾,信噪比低.此外,在生化檢測中,微量的被測溶液中通常包含生物活性物質,如:細胞、DNA、蛋白質等,這些物質長時間暴露在空氣中易失去生物活性,進一步導致信號不穩(wěn)定,所以實驗中不同濃度的被測物采用計時電流法得到的i-t曲線,經過一段時間后往往重疊在一起而難以區(qū)分[15-16].因此,施加電壓后等待較長時間再進行電流采樣來判斷被測物濃度,容易導致誤差.如果在電壓施加后迅速對電流采樣,雖然可以實現快速檢測,避免干擾,但是由方程(1)可見,在it曲線的初始部分,電流初始值極大,需要檢測系統有較寬的測量范圍;曲線斜率大,即電流下降快,如果采樣時間有微小偏差,就會導致電流采樣值的誤差,因此需要儀器能精確控制采樣時間.然而,在多通道采集系統中,設備需要對多通道生物傳感器中的各個電解池依次采樣,而設備中的關鍵元件,如數字/模擬轉換器(DAC)、模擬/數字轉換器(ADC)、模擬開關等又不可避免地存在一定延遲,所以任意兩個電解池的采樣時間都不可能完全一樣,誤差也就難以避免.目前報道的多通道電化學傳感器的通道數從幾個到上百個[9-11],若相鄰兩個通道的時間延遲為△t,則設備對第n個通道進行采集時,將會延遲n△t.通道數越多,延遲越嚴重,誤差也就越大.因此,這些缺點在一定程度上限制了基于計時電流法的多通道電化學生物傳感器的應用.

這種電流初始值極大且下降迅速的問題主要由工作電極上施加的階躍電壓導致,本文通過以下兩步來改進儀器,以實現快速精確的電化學檢測:

(1)在傳統的電化學恒電勢儀中加入控制環(huán)節(jié)改變激勵電壓的波形,使得在i-t曲線的初始部分出現峰值,并且電流峰值與被測物的濃度呈線性關系.

(2)在傳統的電化學信號檢測電路中加入峰值檢測器來鎖存電流峰值,使得在峰值采樣時,無需精確控制采樣時間也能獲取精確的電流峰值.

通過以上改進,不僅能實現快速精確的電化學檢測,由于儀器電路結構簡單、對元件性能要求低,所以還可以很方便地擴展為多通道檢測電路.本文首先為該方法建立數學模型,證明電流峰值與被測物濃度的關系,然后通過對電路改進實現該方法,最后通過一系列實驗來測試該方法.

1 理論部分

1.1 峰值的產生

考慮O+ne→R的體系,其中O是氧化物,R是還原物.傳統計時電流法在t=0時刻施加階躍電勢給工作電極,當t＞0時,電極表面的氧化物濃度迅速降為0,產生無窮大的電流初始值,并按Cottrell方程的形式隨時間迅速遞減.實際檢測中也可以看到,電流初始峰值極大,往往超出儀器量程且非常接近0點,難以測量.在此,假設為工作電極施加一個較緩慢上升的激勵電勢,使電極表面氧化物濃度下降變緩,使得在濃度下降和物質傳遞的過程中出現瞬時的動態(tài)平衡,從而產生電流峰值,以便于檢測.慣性環(huán)節(jié)廣泛應用于經典控制理論中,并且具有簡單可靠的電路結構[17-18],它的特性是:當輸入為階躍信號時,輸出緩慢上升,經過一段時間后達到穩(wěn)態(tài).基于以上思想,我們在恒電勢儀的輸入端加入一個慣性環(huán)節(jié)來減緩電壓上升的速度,如圖1所示,直流輸出替代傳統電化學電路中的DAC產生階躍電壓,經慣性環(huán)節(jié)的緩沖作用后再由恒電勢儀施加到電解池中的電極上,由此得到的響應電流中將會出現峰值.

以下將通過理論模型來分析峰值產生的機理,并推導出電流峰值與被測物濃度的關系.

1.2 峰值電流的數學模型

假設在電壓施加到工作電極前,即t＜0時,被測溶液均勻且氧化物濃度為,而在電壓施加的整個過程中,即t＞0時,遠離電極的本體相不變,氧化物濃度仍為.施加的電壓的波形為:

電壓E(t)隨時間緩慢上升,并趨于穩(wěn)定值E∞,τ為電路的慣性時間常數,τ越大,電壓上升速度越慢.令t時刻,溶液中與電極表面距離為x處的氧化物濃度為CO(x,t),t＞0時在電子傳遞和物質擴散的作用下,假設電極表面的氧化物濃度CO(0,t)以相反的趨勢緩慢下降并趨于0,即:

T是電極表面氧化物濃度的慣性時間常數,由電路的慣性時間常數τ決定,τ越大,T亦越大,濃度下降速度越慢.根據Fick第二定律[19],解線性擴散方程:

其中DO是溶液中氧化物的擴散系數,設邊界條件為:

方程(3)和方程(4)通過拉普拉斯變換為:

由式(7)和式(8)得:

再根據Fick定律[19],可得:

其中JO(0,t)為電極表面氧化物流量,n為電子數,i(t)為流過面積為A的電極表面的電流.將其經拉普拉斯變換得:

將式(10)代入式(12)中,可得電流的拉普拉斯變換為:

用Matlab對該式進行拉普拉斯反變換,得:

則有:

由式(16)可見,電流由兩部分組成,第一部分iCottrell(t)為由原始的不含慣性環(huán)節(jié)的系統產生的電流,第二部分idec(t)可看做由慣性環(huán)節(jié)所產生的衰減成分.令 n=1,F=9.64853×104C,A=4π×10-6m2,DO=5×10-10m2·s-1,=1 mol·L-1,可得 K=2.7112×10-5.再令T=1 s,并代入式(14),由Matlab繪圖得到采用該方法產生的時間電流曲線如圖2所示.

由圖2可見,在慣性環(huán)節(jié)的衰減作用下,在t=1s時刻i-t曲線出現峰值.約在 t＞10 s后,idec(t)逐漸衰減為0,即慣性環(huán)節(jié)的衰減作用逐漸消失,此時i(t)曲線逼近iCottrell(t)曲線,因此在曲線的后半段可以用i(t)曲線近似替代iCottrell(t)曲線.

系數K中包含有許多重要參數,如本體濃度、電極表面積等,為求得電流峰值ipeak與K的關系,對式(14)求極值:

由以上分析可見,基于這種方法,我們可以采用峰值檢測器自動檢測電流峰值,從而快速確定被測對象濃度或電極表面積等參數,且不需要高速的電子器件來精確設定采樣時間,大幅降低了儀器成本,尤其適用于多通道檢測.以下將通過改進傳統電化學電路來實現該方法.

2 實驗部分

2.1 電路改進

傳統的電化學工作站由恒電勢儀、信號采集兩個主要部分組成[20-21],目前市場上主流的電化學分析儀和大部分已報道的電化學工作站都具有相似的電路結構[2,22-25],在此不詳細敘述傳統電化學電路,而著重介紹在傳統電路上的改進.改進電化學檢測系統的原理框圖見圖4,其中,inertial element(慣性環(huán)節(jié))和peak detector(峰值檢測器)是改進后加入的電路模塊,其他部分是傳統電化學電路的原理框圖.

在改進的系統中,加入了一個一階慣性環(huán)節(jié)和一個峰值檢測器,DAC輸出幅值可調的階躍電壓,通過慣性環(huán)節(jié)轉換為上升較緩慢的電壓后,再輸入到恒電勢儀.在實際應用中,可采用電壓固定的直流輸出模塊作為慣性環(huán)節(jié)的輸入,從而進一步簡化電路.由電解池產生的電流經過i/V轉換器轉換為電壓,再經濾波放大后輸出到峰值檢測器,峰值檢測器自動保持峰值電壓,等待ADC采集.圖5(A)為一階慣性環(huán)節(jié)電路圖,慣性時間常數T由電路中的C2和R6決定,即T=C2×R6.當待測物濃度較高時,可以增大T值來降低峰值電流,從而提高儀器的最高檢測限;相反,減小T值,可以提高儀器的靈敏度,從而檢測到低濃度的被測物.圖5(B)為峰值檢測器的電路圖,電路由兩個運放組成,當輸入電壓上升時,二極管D6導通,電路相當于電壓跟隨器,輸出跟隨輸入上升,同時為電容C4充電;當輸入電壓下降,D6截止,由于運放U7的輸入阻抗很大,C4放電電流極小,因此在10 V輸入電壓的情況下,輸出電壓在500 ms內可以維持在輸入電壓的99.99%以上.因此,即使采用低速ADC進行多通道采集,也可以獲得精確的峰值電流.

如圖6所示,為得到完整準確的信號波形來驗證該方法,實驗所用的改進后的電化學分析儀由三部分組成:直流可調穩(wěn)壓電源,主機和上位機.采用16位DAC(MAX542)用于輸出階躍電壓,16位ADC(MAX1168)用于數據采集,并采用DSP(TMS320 F2806)作為主控制器用于協調儀器各部分硬件和與PC之間的數據通信.如前所述,在實際應用中,由于我們只關心電流峰值大小,可以采用干電池供電、直流穩(wěn)壓電源芯片替代DAC、帶ADC的8051核的單片機替代MAX1168和TMS320F2806.該實驗儀器采集完整電流波形并通過RS-232接口將數據上傳至PC顯示和存儲,PC機的數據采集軟件采用Borland C++builder 6.0編譯環(huán)境構建,采集到的數據由Matlab7.1做進一步分析處理.

2.2 材料與試劑

K3[Fe(CN)6]購買自美國Sigma公司,TMB底物購買自美國Neogen公司,辣根過氧化酶(HRP)購自北京博奧森生物技術有限公司.HRP酶儲備液由牛血清白蛋白(BSA)和HRP按1∶2000的體積比配成指定濃度,并加入滅菌水,4℃保存.所有試劑均由從MilliQ系統制得的超純水(電阻率:18 MΩ·cm)配制.工作電極為金電極,對電極為鉑電極,參比電極為Ag/AgCl電極,均購自上海辰華儀器公司.

3 結果與討論

首先,用該裝置研究較高濃度的K3[Fe(CN)6]溶液(0.08-1 mmol·L-1)和較低濃度的 K3[Fe(CN)6]溶液(0.625-10 μmol·L-1)的電化學行為.在 t=1 s 時,對較高濃度的K3[Fe(CN)6]溶液施加電壓,電壓穩(wěn)定值為0.8 V,如圖7所示,在t=1.1 s附近響應電流立刻達到峰值,五次實驗后,上位機軟件繪制出五條具有不同峰值的曲線,分別對應五種不同濃度的溶液.峰值檢測器將峰值長時間保持,等待ADC進行精確采集.由圖7的擬合曲線可見,峰值與濃度的線性度極高(線性相關系數為0.99752).同樣,盡管濃度較低(圖8),電流信號噪聲較大,峰電流值仍與溶液濃度保持較高的線性度(線性相關系數為0.99672).但由于電極和溶液接觸面存在雙電層電容效應,在施加階躍電壓的瞬間,電容因充電而產生微小的峰電流,該電流與被測對象產生的峰電流相疊加,導致圖7與圖8擬合的直線向上偏移而未通過坐標零點,此外,儀器中運算放大器的零點漂移現象和ADC的基準電壓的微小偏差也可能導致該擬合直線未過零點.由于采樣值整體偏移,所以在軟件或硬件校準時,可以簡單地減去一個偏移量來解決該問題.由理論分析可知,由該方法產生的i-t曲線的后段可以近似等同于傳統計時電流法產生的i-t曲線,在圖7中,1 mmol·L-1的K3[Fe(CN)6]溶液產生的峰電流值是1.8 s時刻電流值的175倍,也就是說,相比傳統計時電流法,利用該方法產生的峰電流具有非常高的靈敏度和檢測速度,峰電流的信噪比(62 dB)也遠高于傳統計時電流法(17 dB).尤其在濃度較低的情況下,如圖8所示,傳統計時電流法得到的電流信號極其微弱,容易受到外界電磁干擾,對應不同濃度的各條i-t曲線的后段相互重疊,而采用該方法得到的峰值電流則具有很高的信噪比和靈敏度.

用該裝置研究加入微量HRP到TMB-H2O2溶液前后的電化學反應,結果如圖9所示.加入3 μL配制好的HRP后,在其催化作用下,TMB被H2O2迅速氧化,電流峰值明顯增大.同樣,在i-t曲線的后段,兩條曲線仍然重疊,沒有明顯區(qū)別,這也再次表明,該方法較傳統計時電流法有更高的靈敏度和準確度.

此外,本方法與循環(huán)伏安法(CV)相比,具有如下優(yōu)點:(1)本方法所產生的峰電流值遠高于CV法得到的電流峰值,具有更高的靈敏度;(2)采用本方法進行檢測,從電壓施加到產生峰電流的時間小于1 s,遠比CV法檢測時間少,更適用于快速檢測;(3)本方法所需儀器的硬件結構簡單,可用直流輸出代替DAC輸出,無需高速模擬元件,采用低速ADC即可實現大規(guī)模電極陣列芯片的電流峰值采集.但是,相比本方法的電流-時間曲線,以CV法為代表的許多電化學方法記錄的是電流-電勢曲線,包含了更多的電化學反應的信息,可用于電極反應的機理研究.而本方法則更適用于多通道在現場快速定量檢測.未來工作中,本課題組可能將多電勢階躍的思想引入該方法,使其同樣適用于電化學反應的機理研究.

4 結 論

本研究報道了一種改進自計時電流法的電化學快速檢測方法的理論建模、電路實現,并通過實驗證明了該方法較傳統計時電流法有更高的靈敏度和準確度,克服了計時電流法的不足.在實際應用中,該裝置可以進一步簡化,并能很容易地擴展為多通道檢測裝置.由于該方法通過電流峰值進行定量,不需要精準控制采樣時間,因此非常適合于大規(guī)模電化學電極陣列的信號檢測.

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Mathematical Model and Circuit Realization to Improve Chronoamperometry

CHEN Xu-Hai1,2CHEN Jing-Hua3PAN Hai-Bo2LI Yu-Rong2DU Min2,*LIN Xin-Hua3
(1College of Electrical Engineering and Automation,Fuzhou University,Fuzhou 350000,P.R.China;2Fujian Key Laboratory of Medical Instrumentation&Pharmaceutical Technology,Fuzhou 350000,P.R.China;3Department of Pharmaceutical Analysis,Faculty of Pharmacy,Fujian Medical University,Fuzhou 350000,P.R.China)

O646

Received:May 27,2010;Revised:July 27,2010;Published on Web:September 23,2010.

*Corresponding author.Email:fjkeylab@163.com;Tel:+86-591-83759450.

The project was supported by the National High Technology Research and Development Program of China(863)(2008AA02Z433,2006AA02Z4Z1),

International Science and Technology Cooperation Project of China(2009DFA32050)and Natural Science Foundation of Fujian Province,China

(2008J1005).

國家高技術研究發(fā)展規(guī)劃項目(863)(2008AA02Z433,2006AA02Z4Z1),科技部國際合作項目(2009DFA32050)及福建省科技廳重點項目(2008J1005)資助