p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體基因敲除對小鼠面神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生的影響

張風(fēng)河 黃萍 楊丕山 張雪

（1.山東大學(xué)口腔醫(yī)院 口腔頜面外科；2.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 放療科，山東 濟南 250012）

神經(jīng)營養(yǎng)蛋白在神經(jīng)發(fā)育和功能維持方面起著重要作用，其功能作用的信號傳導(dǎo)主要是通過2種受體來完成，即酪氨酸蛋白激酶（tyrosine protein kinase,Trk）受體（TrkA、TrkB、TrkC）和p75神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體（p75 neurotrophin receptor，p75-NTR）。研究表明，單純抑制p75NTR并不能提高脊髓的再生[1]，但在發(fā)育和周圍性神經(jīng)損傷中，p75NTR在雪旺氏細胞髓鞘化以及再髓鞘化中是必需的[2]。在周圍神經(jīng)的雪旺氏細胞中，神經(jīng)損傷是p75NTR表達的有力刺激因素[3]，這提示p75NTR在周圍神經(jīng)再生調(diào)控中具有重要作用。然而，p75NTR在損傷的周圍神經(jīng)再生中是正向還是反向調(diào)控作用目前仍不清楚，本研究對p75NTR在p75NTR基因敲除小鼠面神經(jīng)損傷后再生中的作用進行了研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組

選取由澳大利亞弗林德絲大學(xué)醫(yī)學(xué)中心提供的實驗動物90只，其中野生型129sv小鼠和p75NTR基因敲除小鼠各45只。年齡6～8周，體重25～29 g，健康，雌性，手術(shù)后在相同標(biāo)準(zhǔn)條件下喂養(yǎng)。2種小鼠用于霍亂毒素B（cholera toxin B，CTB）順行標(biāo)記和免疫組織化學(xué)檢測各35只（其中各5只通過順行標(biāo)記方法觀察再生軸突長度），用于Fast Blue逆行標(biāo)記各10只。

1.2 實驗儀器和試劑

Olympus SZX-12解剖顯微鏡（Olympus公司，日本），Leica冷凍切片機（Leica公司，德國），微量注射器（Hamilton公司，美國），CTB、Fast Blue、鼠生長相關(guān)肽43抗體（GAP43）（Sigma公司，美國），羊CTB抗體（List Biologicals公司，美國），兔抗-PGP9.5（1∶5 000）（Invitrogen公司，美國），兔抗鈣基因相關(guān)肽（rabbit anti-calcitonin gene related peptide，CGRP）（Merke公司，德國）。

1.3 方法

1.3.1 面神經(jīng)損傷及位置記錄 采用1 μL·g-1氯胺酮和0.5 μL·g-1illumxylazil腹腔注射麻醉90只小鼠，常規(guī)消毒鋪巾，在右側(cè)耳根部做1 cm弧形切口，沿著外耳道向下分離，顯微鏡下仔細分離結(jié)締組織后解剖出面神經(jīng)干，牽引開腮腺組織暴露神經(jīng)分叉及前端的分支，然后用特制的夾持鉗在距胸鎖乳突窩神經(jīng)出顱2 mm處夾持30 s，然后松開旋轉(zhuǎn)90°再夾持30 s，顯微鏡下觀察可見神經(jīng)形成透明帶的Ⅳ度損傷。左側(cè)不損傷，作為對照。為標(biāo)記神經(jīng)損傷的精確部位，將0/8絲線縫合于損傷處神經(jīng)外膜上。

1.3.2 面神經(jīng)核運動神經(jīng)元再生的逆行標(biāo)記 在面神經(jīng)損傷手術(shù)后第4天，選取野生型129sv小鼠和p75NTR基因敲除小鼠各10只重新打開創(chuàng)口，在面神經(jīng)總干分叉處切斷，然后將近中殘端置入含有5%Fast Blue的0.2 μL一端封閉的聚氯乙烯小管中。經(jīng)固定后，分層縫合。手術(shù)后第7天，在水合氯醛腹腔麻醉下，經(jīng)心臟4%多聚甲醛全身灌注，然后取出腦干，置于4%多聚甲醛中充分固定24 h，然后依次置于10%、20%、30%的蔗糖緩沖液中過夜，-20℃冷凍連續(xù)切片（16 μm），直接貼到明膠處理過的玻片上，干燥后置于PBST溶液中清洗后封片，在熒光顯微鏡下對面神經(jīng)核運動神經(jīng)元進行計數(shù)分析。

1.3.3 神經(jīng)元計數(shù) 在熒光顯微鏡下由其他研究人員進行雙盲計數(shù)，觀察光的波長為370 nm。計數(shù)時每3個連續(xù)切片計數(shù)1個，只計算含有細胞核的神經(jīng)元，將得到的實驗側(cè)和對照側(cè)面神經(jīng)核神經(jīng)元細胞總數(shù)相除，每只小鼠得到1個百分比。

1.3.4 面神經(jīng)損傷后軸突再生的順行標(biāo)記 手術(shù)后第2天，選取野生型129sv小鼠和p75NTR基因敲除小鼠各5只重新打開創(chuàng)口，在損傷近心端微量注射器注射CTB 0.2 μL，停留1 min以免滲漏。手術(shù)后第3天，水合氯醛腹腔麻醉下，經(jīng)心臟4%多聚甲醛全身灌注，取出面神經(jīng)。神經(jīng)取出后，置于4%多聚甲醛中充分固定24 h，然后依次置入10%、20%、30%的蔗糖緩沖液中過夜，-20℃冷凍連續(xù)切片（20 μm），以備做CTB免疫組織化學(xué)。

1.3.5 免疫組織化學(xué)檢測 將順行標(biāo)記3 d后以及損傷后7 d的面神經(jīng)標(biāo)本進行冷凍切片，直接貼到明膠處理過的玻片上，待干燥后，用PBST清洗，阻斷并用20%普通馬血清（normal horse serum，NHS）進行孵育2 h。分別加入羊CTB抗體（1∶10 000）、GAP-43（1∶500）、兔抗-PGP9.5（1∶5 000）以及CGRP過夜。PBST徹底沖洗后加入適當(dāng)?shù)腇ITC標(biāo)記二抗（1∶100）2 h，經(jīng)過充分的清洗，標(biāo)本放在熒光顯微鏡下觀察。為觀察CTB標(biāo)記的再生軸突長度，在面神經(jīng)損傷處遠中不同距離對標(biāo)記陽性的神經(jīng)纖維進行測量。應(yīng)用GAP43、PGP9.5和CGRP進行再生軸突的計數(shù)，于面神經(jīng)損傷遠中3 mm處獲取圖像，在選取的斷面劃一條神經(jīng)長軸垂直線，對經(jīng)過此線且對3種標(biāo)記物有免疫反應(yīng)的所有再生軸突進行計數(shù)。然后計算平均數(shù)作為每個斷面標(biāo)記纖維的數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，各組所獲得的平均及百分比數(shù)據(jù)進行t檢驗分析。

2 結(jié)果

2.1 p75NTR敲除對軸突再生速度的影響

面神經(jīng)損傷后，將順行標(biāo)記物CTB注射到損傷神經(jīng)點的近中來標(biāo)記軸突生長速度。損傷3 d后，野生型129sv小鼠軸突再生速度可以達到每天2 mm。損傷后3 d新生軸突最多可以達到6 mm。相比較而言，p75NTR基因敲除小鼠軸突生長速度大大低于野生型小鼠，一般不超過每天1 mm，損傷后3 d新生軸突最多可以達到2.5 mm。

2.2 p75NTR敲除對運動神經(jīng)元再生的影響

面神經(jīng)損傷7 d后，p75NTR基因敲除小鼠面神經(jīng)核運動神經(jīng)元的數(shù)量比野生型129sv小鼠有顯著降低（圖1）。野生型129sv小鼠實驗側(cè)運動神經(jīng)元標(biāo)記指數(shù)為（77.8±4.5）%，p75NTR基因敲除小鼠實驗側(cè)運動神經(jīng)元標(biāo)記指數(shù)為（53.1±5.2）%，二者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 野生型129sv小鼠和p75NTR基因敲除小鼠面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)核運動神經(jīng)元再生情況 熒光顯微鏡 ×100Fig 1 The regeneration of facial motoneurons in the facial nerve nucleus in wild type 129sv mice and p75NTR knockout mice fluorescence microscope ×100

2.3 p75NTR敲除對軸突再生數(shù)量的影響

為觀察神經(jīng)再生軸突數(shù)量，損傷神經(jīng)的遠中部分進行GAP43、PGP9.5和CGRP染色，2種小鼠在神經(jīng)損傷遠中3 mm處再生的神經(jīng)纖維都會出現(xiàn)對這些標(biāo)記物的免疫反應(yīng)（圖2）。定量檢測表明野生型129sv小鼠對GAP43、PGP9.5及CGRP產(chǎn)生免疫反應(yīng)的纖維數(shù)量分別為27.5±3.2、38.6±4.1、20.4±2.9。而p75NTR基因敲除小鼠對GAP43、PGP9.5及CGRP產(chǎn)生免疫反應(yīng)的纖維數(shù)量分別為14.2±2.2、20.8±3.4、9.7±2.1，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

圖2 野生型129sv小鼠和p75NTR基因敲除小鼠面神經(jīng)損傷后面神經(jīng)纖維對GAP43、PGP9.5、CGRP產(chǎn)生的免疫反應(yīng) 熒光顯微鏡 ×400Fig 2 The facial nerve fibres immunoreactive for GAP43,PGP9.5 and CGRP in wild type 129sv mice and p75NTR knockout mice fluorescence microscope ×400

3 討論

先前的許多研究試圖去探索p75NTR在神經(jīng)再生中的功能性作用，但所得結(jié)論是有爭議的，這可能歸因于研究分析所采用的不同模型和不同方法。通過一個脛腓總神經(jīng)受損的模型，Boyd等[4]發(fā)現(xiàn)p75NTR敲除的小鼠未受損的運動神經(jīng)元數(shù)量減少但再生的運動神經(jīng)元的相對數(shù)量卻明顯增加了。在脊神經(jīng)背根被橫切的模型中，p75NTR敲除的小鼠背角中檢測到更多的單胺能神經(jīng)元的再生和基本的傳入[5]。上述研究似乎表明p75NTR在神經(jīng)元中的存在可能會對軸突的生長和再生造成阻礙。但本研究發(fā)現(xiàn)在面神經(jīng)擠壓性損傷的模型中，p75NTR基因敲除小鼠神經(jīng)元的再生速度和再生神經(jīng)元的數(shù)量明顯下降。利用在CTB下的順行追蹤技術(shù)，發(fā)現(xiàn)p75NTR基因敲除小鼠軸突生長速度相對于野生型小鼠來說要慢的多。利用逆行追蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)面神經(jīng)核中再生的運動神經(jīng)元的數(shù)量在p75NTR基因敲除小鼠中也明顯減少。從CGRP、PGP9.5和GAP43標(biāo)識陽性的軸突中得到的數(shù)據(jù)也顯示p75NTR基因敲除小鼠外周神經(jīng)軸突再生的延遲性，從而證明p75NTR的存在是外周神經(jīng)運動軸突快速生長的關(guān)鍵。

p75NTR在外周神經(jīng)中促進軸突生長的機制可能和受傷后雪旺氏細胞中神經(jīng)營養(yǎng)因子濃度變化有關(guān)。周圍神經(jīng)受損后，雪旺氏細胞中的神經(jīng)營養(yǎng)因子和p75NTR將會上調(diào)[6]。其原因是p75NTR在雪旺氏細胞中扮演神經(jīng)營養(yǎng)因子聚集底物的角色，可以在局部建立神經(jīng)營養(yǎng)因子梯度方面起關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)p75NTR在衛(wèi)星細胞中的上調(diào)與因外周神經(jīng)損傷而侵犯脊神經(jīng)背根神經(jīng)節(jié)形成籃狀結(jié)構(gòu)的異常去甲腎上腺素能神經(jīng)再生相關(guān)聯(lián)[7]。由于籃狀結(jié)構(gòu)的形成需要p75NTR的表達，表明神經(jīng)膠質(zhì)中p75NTR與軸突再生和生長有關(guān)。雪旺氏細胞表面p75NTR的缺失將會導(dǎo)致神經(jīng)損傷后的神經(jīng)營養(yǎng)因子梯度的喪失和再生軸突生長的延遲或側(cè)突軸突的生長。

另外，在雪旺氏細胞和外周神經(jīng)元中p75NTR可能會產(chǎn)生受體介入膜內(nèi)蛋白水解作用（the receptormediated intramembrane proteolysis，RIP）[8-9]。RIP在髓鞘伴蛋白質(zhì)引起的軸突崩解的小腦神經(jīng)元中是需要的[10]。p75NTR的RIP產(chǎn)物在細胞外可能會中和髓鞘抑制因子對再生神經(jīng)元的作用和促進神經(jīng)元的再生。但是，仍無法解釋對神經(jīng)再生起積極作用的p75NTR不僅僅在受損的雪旺氏細胞和衛(wèi)星神經(jīng)膠質(zhì)細胞中表達，其同時也在運動和感覺神經(jīng)元中高度表達。p75NTR在神經(jīng)元表達的同時顯示了促進和抑制作用。當(dāng)外周神經(jīng)也表達髓鞘抑制因子時，這些神經(jīng)元中的p75NTR可以通過NgR/LINGO-1/p75NTR受體通道對這些抑制因子作出反應(yīng)導(dǎo)致軸突崩解[11]。本研究發(fā)現(xiàn)p75NTR基因敲除小鼠的軸突再生出現(xiàn)延遲，表明NgR/LINGO-1/p75NTR信號在外周神經(jīng)中不是顯性的。但是需要利用條件性敲除的模型或體外培養(yǎng)模型作進一步的研究去區(qū)分神經(jīng)元p75NTR和神經(jīng)膠質(zhì)p75NTR對神經(jīng)再生和軸突生長的作用。

p75NTR還可以通過調(diào)節(jié)雪旺氏細胞遷移來影響周圍神經(jīng)發(fā)育。雪旺氏細胞對軸突生長具有重要作用，生長期軸突和雪旺氏細胞之間具有雙向信號調(diào)節(jié)。因此，雪旺氏細胞可以調(diào)控軸突發(fā)育，軸突也可以反向調(diào)控雪旺氏細胞的遷移[12]。對軸突及其相關(guān)的雪旺氏細胞進行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)在發(fā)育中的軸突上雪旺氏細胞數(shù)量確實減少，這表明在發(fā)育中的軸突上雪旺氏細胞的再髓鞘化被嚴重破壞，這說明p75NTR對雪旺氏細胞發(fā)育以及神經(jīng)元具有多功能的調(diào)節(jié)作用[13]。由于p75NTR在神經(jīng)元和雪旺氏細胞中都有表達，因此在神經(jīng)的發(fā)育中p75可能在動態(tài)的雙向活動中有重要作用。

致謝：感謝澳大利亞弗林德絲大學(xué)周新富教授在本研究中的幫助。

[1]Song XY,Zhong JH,Wang X,et al.Suppression of p75NTR does not promote regeneration of injured spinal cord in mice[J].J Neurosci,2004,24（2）：542-546.

[2]Song XY,Zhou FH,Zhong JH,et al.Knockout of p75（NTR）impairs re-myelination of injured sciatic nerve in mice[J].J Neurochem,2006,96（3）：833-842.

[3]Johnson EM Jr,Taniuchi M,DiStefano PS.Expression and possible function of nerve growth factor receptors on Schwann cells[J].Trends Neurosci,1988,11（7）：299-304.

[4]Boyd JG,Gordon T.A dose-dependent facilitation and inhibition of peripheral nerve regeneration by brain-derived neurotrophic factor[J].Eur J Neurosci,2002,15（4）：613-626.

[5]Scott AL,Borisoff JF,Ramer MS.Deafferentation and neurotrophin mediated intraspinal sprouting：A central role for the p75 neurotrophin receptor[J].Eur J Neurosci,2005,21（1）：81-92.

[6]Funakoshi H,Frisén J,Barbany G,et al.Differential expression of mRNAs for neurotrophins and their receptors after axotomy of the sciatic nerve[J].J Cell Biol,1993,123（2）：455-465.

[7]Zhou XF,Li HY.Roles of glial p75NTR in axonal regeneration[J].J Neurosci Res,2007,85（8）：1601-1605.

[8]Ahmed Z,Mazibrada G,Seabright RJ,et al.TACE-induced cleavage of NgR and p75NTR in dorsal root ganglion cultures disinhibits outgrowth and promotes branching of neurites in the presence of inhibitory CNS myelin[J].FASEB J,2006,20（11）：1939-1941.

[9]Ahmed Z,Suggate EL,Brown ER,et al.Schwann cell-derived factor-induced modulation of the NgR/p75NTR/EGFR axis disinhibits axon growth through CNS myelinin vivoandin vitro[J].Brain,2006,129（Pt 6）：1517-1533.

[10]Domeniconi M,Zampieri N,Spencer T,et al.MAG induces regulated intramembrane proteolysis of the p75 neurotrophin receptor to inhibit neurite outgrowth[J].Neuron,2005,46（6）：849-855.

[11]Pot C,Simonen M,Weinmann O,et al.Nogo-A expressed in Schwann cells impairs axonal regeneration after peripheral nerve injury[J].J Cell Biol,2002,159（1）：29-35.

[12]Bhattacharyya A,Brackenbury R,Ratner N.Axons arrest the migration of Schwann cell precursors[J].Development,1994,120（6）：1411-1420.

[13]Mandemakers WJ,Barres BA.Axon regeneration： It′s getting crowded at the gates of TROY[J].Curr Biol,2005,15（8）：R302-R305.