成骨細(xì)胞中Runx2對(duì)機(jī)械離心力刺激的響應(yīng)

關(guān)鍵 程宗生 王健平 李德超 鄧慧鑫

（佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)院 口腔頜面外科，黑龍江 佳木斯 154004）

從Codivilla介紹牽張成骨術(shù)（distraction osteogenesis，DO）至今已有一百多年的歷史，但目前對(duì)牽引產(chǎn)生的機(jī)械力如何轉(zhuǎn)化為生物學(xué)信號(hào)的細(xì)胞和分子機(jī)制尚不清楚。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）參與DO中新骨的生成并發(fā)揮重要作用[1-3]，其可能參與DO力學(xué)信號(hào)向生物信號(hào)轉(zhuǎn)化過(guò)程[4-5]。BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在成骨細(xì)胞對(duì)機(jī)械力刺激響應(yīng)中的作用還不清楚，對(duì)該問(wèn)題的研究將為DO外源性應(yīng)用BMP提供理論基礎(chǔ)。本研究旨在通過(guò)生理狀態(tài)和阻斷BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路時(shí)，在mRNA層面對(duì)比研究成骨細(xì)胞株MC3T3-E1中Runx2對(duì)機(jī)械離心力刺激的響應(yīng)，從側(cè)面探討B(tài)MP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在成骨細(xì)胞對(duì)機(jī)械力刺激響應(yīng)中的作用和意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠胚成骨細(xì)胞株MC3T3-E1（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細(xì)胞中心），DMEM（GIBCO公司，美國(guó)），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），重組小鼠Noggin蛋白（Perpro Tech公司，美國(guó)），Trizol（上海生工公司），cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Power SYBRRGreen PCR試劑盒、ABI7300 PCR儀（ABI公司，美國(guó)），50 bp DNA Marker（TaKaRa公司，日本），細(xì)胞培養(yǎng)瓶/板（Coring公司，美國(guó)）。

1.2 MC3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng)

37℃、5%CO2、含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞，隔天換液。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底80%以上時(shí)，37℃下0.25%胰蛋白酶1.5 mL消化3～5 min，見(jiàn)瓶底出現(xiàn)針孔樣透明時(shí)，加入等量含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按1∶3傳代，第2天換液。

1.3 細(xì)胞加力

自制六孔細(xì)胞培養(yǎng)板離心支架，使之能將匹配的六孔板一起固定于LXJ-Ⅱ型離心沉淀機(jī)中離心，離心加力系統(tǒng)的剖面見(jiàn)圖1。根據(jù)公式：離心力（RCF）=1.118×10-5×R×V2計(jì)算離心力的大小，單位為重力加速度×g。離心半徑R約19 cm，轉(zhuǎn)速V約1 100 r·min-1，離心力約271×g。

圖1 離心加力系統(tǒng)的剖面圖Fig 1 Centrifugal profiles based augmentation systems

1.4 加力分組

將待測(cè)細(xì)胞隨機(jī)分為A、B、C、D組。A組為空白對(duì)照組，細(xì)胞未接受Noggin預(yù)處理和機(jī)械離心力加載；B組為細(xì)胞接受271×g離心力加載5 min；C組為細(xì)胞接受100 ng·mL-1Noggin預(yù)處理24 h；D組為細(xì)胞接受100 ng·mL-1Noggin預(yù)處理24 h和271×g離心力加載5 min，每組6孔。4組細(xì)胞同時(shí)種板，培養(yǎng)48 h后以無(wú)血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h，同步細(xì)胞周期。加力前24 h更換為含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，將六孔板無(wú)菌密封。30min后4組分別收獲細(xì)胞。

1.5 Runx2表達(dá)的檢測(cè)

按Trizol試劑說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用Power SYBR?Green染料法進(jìn)行PCR，引物由Invitrogen公司合成，目的基因Runx2（Gene-Bank accession number NM_004348）上游引物序列為：5′-TCCAACCCACGAATGCACTAC-3′，下游引物序列為：5′-GTAGTGAGTGGTGGCGGACT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為92 bp；內(nèi)參對(duì)照β-actin（GeneBank accession number NM_007393）上游引物序列為：5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′，下游引物序列為：5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段為171 bp。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，95℃ 15 s，62℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物同期進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Runx2對(duì)離心力刺激的響應(yīng)

MC3T3-E1細(xì)胞中Runx2 mRNA的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，B組Runx2 mRNA表達(dá)較A組增加（P<0.05），離心力可使Runx2 mRNA表達(dá)增加。D組經(jīng)Noggin預(yù)處理后比B組對(duì)離心力刺激時(shí)Runx2 mRNA表達(dá)降低（P<0.05），Noggin抑制Runx2 mRNA的表達(dá)。C組Runx2 mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化，A、C、D組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.692）。

圖2 成骨細(xì)胞Runx2 mRNA的表達(dá)Fig 2 The expression of Runx2 mRNA in osteoblastic MC3T3-E1 cells

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR產(chǎn)物電泳分析

凝膠電泳結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物雜帶少，RT-PCR產(chǎn)物純度較高（圖3）。

圖3 Runx2表達(dá)產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig 3 The electrophoresis results of expression product of Runx2

3 討論

成骨細(xì)胞是骨組織內(nèi)的力學(xué)敏感性細(xì)胞，同時(shí)它在骨改建過(guò)程中又處于一個(gè)中心調(diào)控的地位，是研究骨形成機(jī)制的基本單位[6-7]。MC3T3-E1細(xì)胞表型穩(wěn)定，使其在對(duì)成骨細(xì)胞的各項(xiàng)研究中得到了廣泛地應(yīng)用。目前對(duì)離體細(xì)胞有多種加力方式：低滲性膨脹、離心、單/雙向拉伸和流體剪切等，這些不同的離體應(yīng)變使細(xì)胞產(chǎn)生不同的生理響應(yīng)過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)的離心加力方式與Fitzgerald等[8]所提出的類似，離心力使貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞受到一個(gè)頂—底軸向的壓力，避免了細(xì)胞懸浮離心時(shí)細(xì)胞之間以及細(xì)胞與基質(zhì)之間附著狀態(tài)的喪失。Fitzgerald等[8]發(fā)現(xiàn)對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞加載3×g的離心力相當(dāng)于輕微力量，而287×g的離心力則相當(dāng)于劇烈刺激的力量。前期實(shí)驗(yàn)表明對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞加載271×g的離心力5 min能有效刺激成骨細(xì)胞，并且離心力刺激強(qiáng)度在成骨細(xì)胞生理范圍之內(nèi)。離心力在一定程度上反映成骨細(xì)胞受到機(jī)械力學(xué)刺激作用，但是無(wú)法完全模擬體內(nèi)DO成骨細(xì)胞的實(shí)際受力情況。

成骨細(xì)胞對(duì)力學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)胞膜上Ca2+通道、胞外基質(zhì)-整合素-細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)系統(tǒng)[9]、細(xì)胞因子等多種途徑入核作用于靶基因Runx2并調(diào)控相應(yīng)基因表達(dá)構(gòu)成復(fù)雜的力學(xué)信息傳遞網(wǎng)絡(luò)。本研究結(jié)果顯示：與A組相比，B組Runx2 mRNA表達(dá)增加，可能為成骨細(xì)胞對(duì)機(jī)械離心力刺激響應(yīng)的結(jié)果，驗(yàn)證了Runx2作為力學(xué)信號(hào)靶分子參與了成骨細(xì)胞響應(yīng)機(jī)械離心力刺激的生理過(guò)程。Ziros等[10]證實(shí)Runx2/Cbfa1蛋白及基因都是力學(xué)刺激的關(guān)鍵目標(biāo)，認(rèn)為Runx2/Cbfa1基因表達(dá)的增強(qiáng)是力學(xué)刺激在成骨細(xì)胞內(nèi)作用的“終點(diǎn)”。Li等[11]對(duì)成骨樣細(xì)胞施加離心力10 min后檢測(cè)到Runx2/Cbfa1 mRNA表達(dá)水平有短暫地增加改變，認(rèn)為成骨細(xì)胞通過(guò)多種復(fù)雜途徑響應(yīng)機(jī)械力學(xué)刺激。

采用Abe等[12]的方法阻斷BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使用100 ng·mL-1Noggin預(yù)處理24 h，其Runx2 mRNA表達(dá)水平可反映Noggin阻斷BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的效果，結(jié)果顯示，C組與A組和D組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為D組達(dá)到了阻斷BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的要求。D組Runx2 mRNA表達(dá)水平略高于A組，可能是除BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路外，其他信號(hào)通路對(duì)機(jī)械離心力刺激響應(yīng)的效果。

D組Runx2 mRNA表達(dá)水平較B組顯著降低。僅阻斷BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從現(xiàn)有理論來(lái)講，其他多種力學(xué)信號(hào)傳遞途徑應(yīng)不受影響，但是BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻斷后，力學(xué)靶點(diǎn)Runx2基因在相同的力學(xué)刺激強(qiáng)度下未能完成與B組同等的響應(yīng)程度，二者對(duì)機(jī)械離心力刺激響應(yīng)程度的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了成骨細(xì)胞對(duì)機(jī)械離心力刺激的生理響應(yīng)過(guò)程，而且可能在成骨細(xì)胞對(duì)力學(xué)信號(hào)引起的信息傳遞級(jí)聯(lián)反應(yīng)中扮演了重要角色。力學(xué)刺激可能通過(guò)BMP/Smad途徑[13-15]或BMP/p38MAPK途徑[16-17]等入核作用于Runx2等影響成骨特異性基因表達(dá)，從而刺激骨形成以響應(yīng)力學(xué)刺激，但其具體機(jī)制尚不清楚。BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在成骨細(xì)胞對(duì)機(jī)械力刺激響應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能介導(dǎo)力學(xué)信息傳遞網(wǎng)絡(luò)的其他途徑，并在力學(xué)刺激引起的信息傳遞級(jí)聯(lián)反應(yīng)中扮演重要角色，但還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

[1]Yonezawa H,Harada K,Ikebe T,et al.Effect of recombinant human bone morphogenetic protein-2（rhBMP-2） on bone consolidation on distraction osteogenesis：A preliminary study in rabbit mandibles[J].J Craniomaxillofac Surg,2006,34（5）：270-276.

[2]Zheng LW,Wong MC,Rabie AB,et al.Evaluation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 in mandibular distraction osteogenesis in rabbits：Effect of dosage and number of doses on formation of bone[J].Br J Oral Maxillofac Surg,2006,44（6）：487-494.

[3]陳安威,魏奉才,王克濤,等.腺病毒介導(dǎo)的人骨形成蛋白2基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)下頜牽張成骨的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,2007,42（1）：15-17.

CHEN An-wei,WEI Feng-cai,WANG Ke-tao,et al.Effect of bone morphogenetic proteins-2 on mandibular distraction osteogenesis in rabbits[J].Chin J Stomatol,2007,42（1）：15-17.

[4]Campisi P,Hamdy RC,Lauzier D,et al.Expression of bone morphogenetic proteins during mandibular distraction osteogenesis[J].Plast Reconstr Surg,2003,111（1）：201-208.

[5]Khanal A,Yoshioka I,Tominaga K,et al.The BMP signaling and its Smads in mandibular distraction osteogenesis[J].Oral Dis,2008,14（4）：347-355.

[6]關(guān)鍵,王健平,車笑非,等.缺氧條件對(duì)成骨細(xì)胞VEGF和TGF-β表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志,2008,22（8）：984-988.

GUAN Jian,WANG Jian-ping,CHE Xiao-fei,et al.Experimental study on the effect of hypoxia on the expression of VEGF and TGF-β1 of rat mandibular osteoblasts[J].Chin J Reparat Reconstr Surg,2008,22（8）：984-988.

[7]關(guān)鍵,闞娜,劉鳳玲,等.大鼠成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)、特性鑒定及低氧時(shí)VEGF表達(dá)的變化[J].中國(guó)口腔頜面外科雜志,2007,5（6）：451-455.

GUAN Jian,KAN Na,LIU Feng-ling,et al.In vitrostudy of expression of VEGF in osteoblast in Wistar rat under hypoxia[J].Chin J Oral Maxillofac Surg,2007,5（6）：451-455.

[8]Fitzgerald J,Hughes-Fulford M.Mechanically induced c-fos expression is mediated by cAMP in MC3T3-E1 osteoblasts[J].FASEB J,1999,13（3）：553-557.

[9]Carvalho RS,Bumann A,Schaffer JL,et al.Predominant integrin ligands expressed by osteoblasts show preferential regulation in response to both cell adhesion and mechanical perturbation[J].J Cell Biochem,2002,84（3）：497-508.

[10]Ziros PG,Gil AP,Georgakopoulos T,et al.The bone-specific transcriptional regulator Cbfa1 is a target of mechanical signals in osteoblastic cells[J].J Biol Chem,2002,277（26）：23934-23941.

[11]Li J,Jiang L,Liao G,et al.Centrifugal forces within usuallyused magnitude elicited a transitory and reversible change in proliferation and gene expression of osteoblastic cells UMR-106[J].Mol Biol Rep,2009,36（2）：299-305.

[12]Abe E,Yamamoto M,Taguchi Y,et al.Essential requirement of BMPs-2/4 for both osteoblast and osteoclast formation in murine bone marrow cultures from adult mice：Antagonism by noggin[J].J Bone Miner Res,2000,15（4）：663-673.

[13]Derynck R,Zhang YE.Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signaling[J].Nature,2003,425（6958）：577-584.

[14]Miyazono K,Maeda S,Imamura T.BMP receptor signaling：Transcriptional targets,regulation of signals,and signaling crosstalk[J].Cytokine Growth Factor Rev,2005,16（3）：251-263.

[15]Wan M,Cao X.BMP signaling in skeletal development[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,328（3）：651-657.

[16]程宗生,關(guān)鍵.骨形態(tài)發(fā)生蛋白/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制及其對(duì)離心力刺激的響應(yīng)[J].國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志,2009,36（3）：335-337.

CHENG Zong-sheng,GUAN Jian.Mechanism of bone morphogenetic protein/Smad signaling pathway and its response to centrifugal force[J].Int J Stomatol,2009,36（3）：335-337.

[17]Higuchi C,Myoui A,Hashimoto N,et al.Continuous inhibition of MAPK signaling promotes the early osteoblastic differentiation and mineralization of the extracellular matrix[J].J Bone Miner Res,2002,17（10）：1785-1794.