高滲條件下利用蔗糖提升2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)效率

陳克杰，周景文，劉立明，劉杰，堵國(guó)成，陳堅(jiān)

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122

2 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122

3 江蘇江山制藥有限公司，靖江 214500

工業(yè)生物技術(shù)

高滲條件下利用蔗糖提升2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)效率

陳克杰1,2，周景文1,2，劉立明1,2，劉杰3，堵國(guó)成2，陳堅(jiān)1,2

1 江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122

2 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122

3 江蘇江山制藥有限公司，靖江 214500

旨在進(jìn)一步提升維生素C前體2-酮基-L-古龍酸 (2-KLG) 的生產(chǎn)效率。在詳細(xì)考察了2-KLG工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中滲透壓變化規(guī)律的基礎(chǔ)上，研究了高滲對(duì)混合菌系細(xì)胞生長(zhǎng)和2-KLG合成的影響，提出蔗糖促進(jìn)伴生菌巨大芽胞桿菌Bacillusmegaterium生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)普通生酮古龍酸菌Ketogulonigenium vulgare生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的策略。結(jié)果表明，2-KLG的積累和堿性物質(zhì)的流加使?jié)B透壓上升了832 mOsmol/kg；高滲抑制了巨大芽胞桿菌的生長(zhǎng) (15.4%)，從而抑制普通生酮古龍酸菌 (31.7%) 的生長(zhǎng)，導(dǎo)致2-KLG產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度分別下降67.5%和69.3% (以1 250 mOsmol/kg為例)；蔗糖的添加則顯著促進(jìn)巨大芽胞桿菌的生長(zhǎng)，使高滲條件下 (搖瓶，1 250 mOsmol/kg) 2-KLG產(chǎn)量 (40.6 g/L) 提高87%；在3 L發(fā)酵罐中，補(bǔ)加10 mmol/L蔗糖使2-KLG發(fā)酵周期縮短10.8%，2-KLG生產(chǎn)強(qiáng)度提高10.4%。研究成果為在環(huán)境脅迫下提高混菌生產(chǎn)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量提供了潛在的策略。

混菌發(fā)酵，2-酮基-L-古龍酸，碳源調(diào)節(jié)，維生素C，高滲

Abstract:This study aimed to further enhance 2-keto-L-gulonic acid (2-KLG) production efficiency. A strategy for enhancingKetogulonigenium vulgaregrowth and 2-KLG production by improvingB. megateriumgrowth with sucrose was developed based on the time course of osmolality during 2-KLG industrial scale fermentation and effects of osmolality on cells growth and 2-KLG production.Results showed that the accumulation of 2-KLG and the feeding of alkaline matter led to an osmolality rise of 832 mOsmol/kg in the culture broth. High osmotic stress (1 250 mOsmol/kg) made the growth ofB. megateriumandK. vulgaredecreased 15.4% and 31.7%, respectively, and consequently the titer and productivity of 2-KLG reduced 67.5% and 69.3%, respectively. When supplement sucrose under high osmotic condition (1 250 mOsmol/kg),B. megateriumgrowth was significantly improved, with the result that2-KLG production was increased 87%. Furthermore, by applying this sucrose addition strategy further to batch fermentation in 3 L fermentor, the productivity of 2-KLG increased 10.4%, and the duration of fermentation declined 10.8%. The results presented here provide a potential strategy for enhancing the target metabolites produced by mixed strains at environmental stress.

Keywords:mixed culture, 2-keto-L-gulonic acid, carbon source regulation, Vitamin C, hyperosmotic stress

維生素C工業(yè)化生產(chǎn)普遍采用“二步發(fā)酵”工藝，即L-山梨糖到維生素C前體—2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonic acid，2-KLG) 的轉(zhuǎn)化由普通生酮古龍酸菌 (Ketogulonigenium vulgare，俗稱(chēng)小菌，原來(lái)鑒定為Gluconobacter oxydans) 和巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium，俗稱(chēng)大菌) 組成的混合菌系來(lái)完成[1]。而在典型2-KLG生產(chǎn)的速率模型中，L-山梨糖濃度與產(chǎn)酸速率為擬零級(jí)動(dòng)力學(xué)關(guān)系，表明2-KLG合成速率與發(fā)酵液中底物濃度無(wú)關(guān)，而與菌體濃度成正比[2]。因此，2-KLG的生產(chǎn)通常采用發(fā)酵液中L-山梨糖濃度處于最適范圍，通過(guò)補(bǔ)料分批發(fā)酵的模式，以維持較高的2-KLG合成速率[3]。類(lèi)似于有機(jī)酸發(fā)酵，2-KLG發(fā)酵過(guò)程中需流加一定的NaOH或Na2CO3等堿性物質(zhì)以維持發(fā)酵液中pH處于合適的生理范圍內(nèi)。而隨著發(fā)酵體系中2-KLG和Na+濃度的持續(xù)增加，導(dǎo)致滲透壓也持續(xù)上升，進(jìn)而影響菌體生長(zhǎng)、細(xì)胞形態(tài)、膜流動(dòng)性、代謝流分配和目標(biāo)代謝產(chǎn)物的合成[4-6]。因此，如能在充分理解2-KLG發(fā)酵過(guò)程中滲透壓的變化規(guī)律及其對(duì)混合菌系生理代謝功能影響的基礎(chǔ)上，發(fā)展高效合理的調(diào)控策略，有望進(jìn)一步提高2-KLG生產(chǎn)效率。

本文在研究了2-KLG工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中滲透壓的變化規(guī)律和高滲條件下混合菌系代謝行為 (菌體生長(zhǎng)和2-KLG合成) 的基礎(chǔ)上，針對(duì)性地提出碳源調(diào)節(jié)策略，實(shí)現(xiàn)了促進(jìn)巨大芽胞桿菌生長(zhǎng)，增加活性物質(zhì)分泌，增強(qiáng)混菌耐高滲能力，提升2-KLG生產(chǎn)效率的目的。這一研究結(jié)果為在混菌發(fā)酵體系中調(diào)控滲透壓等環(huán)境因素促進(jìn)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的高效合成提供了研究思路。

1 材料與方法

1.1 菌種

普通生酮古龍酸菌 (K. vulgare，俗稱(chēng)小菌)，巨大芽胞桿菌 (B. megaterium，俗稱(chēng)大菌)，由江蘇江山制藥有限公司 (江蘇靖江) 提供。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基 (g/L)：L-山梨糖20，酵母膏3，牛肉膏3，大豆蛋白胨10，玉米漿1.5，尿素1，KH2PO41，MgSO42，CaCO31。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：L-山梨糖80，玉米漿5，尿素 12，KH2PO41，MgSO41，CaCO35。

用氯化鈉作為滲透誘導(dǎo)劑時(shí)，根據(jù)需要適量添加。蔗糖補(bǔ)加濃度為10 mmol/L。以上所有培養(yǎng)基用自來(lái)水配置，由2 mol/L NaOH調(diào)pH值為6.7～7.0。碳源 (L-山梨糖) 和氮源分開(kāi)滅菌，滅菌條件為121℃，15 min。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1搖瓶培養(yǎng)

種子培養(yǎng)：先按劃線法自然搭配巨大芽胞桿菌、普通生酮古龍酸菌，再?gòu)幕炀泵娼臃N子培養(yǎng)基(75 mL/750 mL搖瓶)，30℃、200 r/min培養(yǎng)18 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將種液按接種量10%接入發(fā)酵培養(yǎng)基 (75 mL/750 mL 搖瓶)，30℃、200 r/min培養(yǎng) 72 h左右。定期取樣檢測(cè)相關(guān)參數(shù)。

1.3.2發(fā)酵罐培養(yǎng)

在3 L發(fā)酵罐 (韓國(guó)BioTron公司) 中進(jìn)行。發(fā)酵罐初始裝液量為2 L，接種量為10%。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，通氣 (1:0.8～1) 下，溶氧控制在30%～50%；溫度控制在 (30±0.5)℃；接種后調(diào)pH 7.0，前期不控制 pH，產(chǎn)酸后 pH下降，自動(dòng)流加 30% NaOH使 pH維持在 6.9～7.0；定期取樣檢測(cè) 2-KLG和 L-山梨糖的含量。當(dāng)殘?zhí)菨舛冉档?.3%以下時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。

1.4 分析方法

1.4.1菌體濃度測(cè)定

菌體濃度測(cè)定參見(jiàn)文獻(xiàn)[7]。

1.4.2巨大芽胞桿菌和普通生酮古龍酸菌的計(jì)數(shù)

巨大芽胞桿菌和普通生酮古龍酸菌以結(jié)晶紫染色后，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.4.3滲透壓測(cè)定

用冰點(diǎn)滲透壓計(jì) (德國(guó)Gonotec公司) 測(cè)定。

1.4.42-KLG與L-山梨糖含量的測(cè)定

采用Agilent 1200高效液相色譜儀測(cè)定[8]。色譜柱：Aminex HPX-87H (Bio-Rad)；流動(dòng)相：0.005 mol/L H2SO4；流速：0.6 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器。

1.4.5L-山梨糖到2-KLG轉(zhuǎn)化率的計(jì)算[9]

2 結(jié)果

2.1 2-KLG積累是發(fā)酵體系中滲透壓提升的主因

2-KLG工業(yè)化生產(chǎn)中相關(guān)發(fā)酵參數(shù)的變化趨勢(shì)如圖1A所示。典型的2-KLG發(fā)酵過(guò)程中，初始L-山梨糖濃度為15～25 g/L，發(fā)酵4～8 h后通過(guò)流加維持發(fā)酵過(guò)程中L-山梨糖濃度為15～30 g/L，36～44 h停止流加，直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)滲透壓與起始點(diǎn)比較，上升了832 mOsmol/kg。結(jié)合前述，發(fā)酵過(guò)程中滲透壓的增加并非源于 L-山梨糖濃度的增加，因其濃度始終維持在一定范圍，且發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)濃度有所降低。2-KLG的不斷分泌導(dǎo)致發(fā)酵體系pH不斷下降，為了將維持pH在一定的生理范圍內(nèi)需不斷流加NaOH，使得2-KLG的鈉鹽濃度不斷增加，從而導(dǎo)致滲透壓不斷上升。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中2-KLG濃度與滲透壓值的增加呈良好的線性關(guān)系(圖 1B)。這一結(jié)果表明，導(dǎo)致發(fā)酵液中滲透壓升高的主要原因在于2-KLG的不斷積累。

2.2 高滲對(duì)2-KLG發(fā)酵的影響

不同滲透壓 (氯化鈉誘導(dǎo)) 對(duì)混合菌系生長(zhǎng)和2-KLG合成的影響如圖2所示。當(dāng)滲透壓為1 250 mOsmol/kg時(shí)，穩(wěn)定期OD660值為4.51，與對(duì)照組 (不加NaCl) 比較，下降了14.9%。相應(yīng)地，2-KLG 產(chǎn)量 (21.6 g/L) 和生產(chǎn)強(qiáng)度(0.3 g/(L·h)) 均比對(duì)照組下降了67.5%和 69.3%。繼續(xù)提高發(fā)酵液中的滲透壓，細(xì)胞生長(zhǎng)和2-KLG合成則進(jìn)一步受到抑制，如滲透壓大于1 400 mOsmol/kg時(shí)，2-KLG產(chǎn)量?jī)H為10.3 g/L。

作者采用顯微計(jì)數(shù)法進(jìn)一步研究了高滲 (以1 250 mOsmol/kg為例) 對(duì)混合菌系生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組比較：1)巨大芽胞桿菌的延遲期延長(zhǎng)了9 h，普通生酮古龍酸菌延長(zhǎng)了11 h；2)巨大芽胞桿菌對(duì)數(shù)期平均比生長(zhǎng)速率下降了27.7%，普通生酮古龍酸菌下降了 52.9%；3) 巨大芽胞桿菌穩(wěn)定期菌體數(shù)量下降了 15.4%，普通生酮古龍酸菌下降了 31.7%。上述結(jié)果表明，高滲顯著抑制了普通生酮古龍酸菌的生長(zhǎng)。然而，普通生酮古龍酸菌生長(zhǎng)和合成2-KLG的能力取決于混合菌系中巨大芽胞桿菌的生長(zhǎng)狀況[10]。因此，高滲抑制普通生酮古龍酸菌生長(zhǎng)和2-KLG合成的根本原因在于巨大芽胞桿菌生長(zhǎng)受到抑制，導(dǎo)致活性物質(zhì)分泌減少。鑒于此，高滲條件下如何調(diào)控巨大芽胞桿菌的生長(zhǎng)，對(duì)2-KLG的高效生產(chǎn)就顯得尤為重要。

圖1 典型2-KLG工業(yè)發(fā)酵過(guò)程曲線 (A) 及滲透壓與2-KLG含量的關(guān)系 (B)Fig.1 Time-course of 2-KLG fermentation process during industrial production (A) and the correlation between osmolality and the 2-KLG concentration (B).

圖2 滲透壓對(duì)混菌生長(zhǎng)和2-KLG生產(chǎn)的影響Fig.2 Effect of osmolality on the mixed strains growth and the 2-KLG production.

2.3 蔗糖促進(jìn)高滲條件下2-KLG生產(chǎn)

在2-KLG發(fā)酵體系中，巨大芽胞桿菌并不能利用L-山梨糖、僅能利用玉米漿中的碳源生長(zhǎng)。玉米漿中還原糖的濃度約為11%[11]，因此作者選取并研究了玉米漿中典型碳源對(duì)高滲條件下 (以 1 250 mOsmol/kg為例) 混合菌系生長(zhǎng)和2-KLG合成的影響，結(jié)果如表1所示。表1表明，碳源的添加有效地促進(jìn)了混合菌系生長(zhǎng)和2-KLG合成。但總體而言，二糖更能顯著提高2-KLG的合成效率。

圖3 高滲對(duì)混菌中巨大芽胞桿菌 (A) 和普通生酮古龍酸菌 (B) 生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of osmolality on the growth ofB. megaterium(A) andK. vulgare(B).

表1 高滲條件下不同碳源對(duì)2-KLG生產(chǎn)和混菌生長(zhǎng)的影響Table 1 Effect of different carbon sources on the 2-KLG production and the mixed strains growth under 1 250 mOsmol/kg condition

基于上述結(jié)果，作者進(jìn)一步研究了高滲條件(以1 250 mOsmol/kg為例) 下添加蔗糖對(duì)混菌生長(zhǎng)和2-KLG合成的影響 (圖4)。與未添加蔗糖的對(duì)照組 (1 250 mOsmol/kg) 比較，平穩(wěn)期 (48 h) 混菌濃度、72 h時(shí)2-KLG含量 (40.6 g/L)、2-KLG生產(chǎn)強(qiáng)度、L-山梨糖消耗速率分別提高了73%、87%、95.0%和 88.9%。同時(shí)，蔗糖的添加也明顯地提高了2-KLG對(duì)L-山梨糖的轉(zhuǎn)化率。

圖4 蔗糖促進(jìn)高滲條件下2-KLG的生產(chǎn)Fig.4 Sucrose enhances the 2-KLG production under hyperosmotic stress (1 250 mOsmol/kg) induced by NaCl.

2.4 蔗糖提升分批發(fā)酵2-KLG生產(chǎn)效率

作者在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)一步研究了添加10 mmol/L蔗糖對(duì)2-KLG生產(chǎn)的影響 (圖5和表2)。與未添加的對(duì)照組比較：1) 巨大芽胞桿菌穩(wěn)定期細(xì)胞提高42%，普通生酮古龍酸菌穩(wěn)定期細(xì)胞提高10.6%；2) 發(fā)酵周期由 37 h縮至 33 h，發(fā)酵時(shí)間縮短了10.8%；3) 轉(zhuǎn)化率由 89.9%提高到 92.8%；4)2-KLG 生產(chǎn)強(qiáng)度由 1.87 g/(L·h)提高到 2.07 g/(L·h)，提高了10.4%。

圖5 蔗糖補(bǔ)加對(duì)2-KLG混菌分批發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of sucrose on the 2-KLG fermentation by mixed culture in 3 L fermentator. (A) 1, 2: 2-KLG; 3, 4: sorbose.

表2 3 L發(fā)酵罐上蔗糖對(duì)2-KLG發(fā)酵參數(shù)的影響Table 2 Effect of sucrose on the 2-KLG fermentation parameters by mixed culture in 3 L fermentator

3 討論

作為一個(gè)典型的有機(jī)酸發(fā)酵過(guò)程，維生素C前體物質(zhì)2-KLG發(fā)酵體系中pH因2-KLG的積累而不斷下降，為了維持最適pH范圍需不斷流加的堿性物質(zhì)則導(dǎo)致滲透壓不斷升高 (圖 1)。不斷升高的滲透壓顯著抑制了巨大芽胞桿菌和普通生酮古龍酸菌的生長(zhǎng)，并最終限制了2-KLG的合成 (圖3)。高滲對(duì)混合菌系中普通生酮古龍酸菌的毒害作用表現(xiàn)為：1) 滲透壓對(duì)普通生酮古龍酸菌的“直接作用”：直接抑制普通生酮古龍酸菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸；2) 滲透壓對(duì)伴生菌巨大芽胞桿菌的“間接作用”：影響巨大芽胞桿菌生長(zhǎng)以及活性物質(zhì)的分泌，從而間接影響普通生酮古龍酸菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸。2-KLG發(fā)酵中普通生酮古龍酸菌與巨大芽胞桿菌之間的關(guān)系體現(xiàn)在：1)普通生酮古龍酸菌具有高效合成2-KLG的全部酶系，但單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)非常微弱，且?guī)缀蹼y以合成2-KLG；2)巨大芽胞桿菌不具備合成 2-KLG的酶系，但能分泌活性物質(zhì)促進(jìn)普通生酮古龍酸菌生長(zhǎng)和合成 2-KLG；3) 普通生酮古龍酸菌生長(zhǎng)和合成2-KLG的能力隨著發(fā)酵初期混合菌系中巨大芽胞桿菌比例的增加而增加；4) 巨大芽胞桿菌裂解釋放的胞內(nèi)活性物質(zhì)對(duì)普通生酮古龍酸菌細(xì)胞生長(zhǎng)和L-山梨糖脫氫酶活性具有強(qiáng)烈的促進(jìn)作用[12-13]，且發(fā)酵體系中活性物質(zhì)的豐度直接決定普通生酮古龍酸菌合成2-KLG的效率?；诖耍绾卧诟邼B條件下提高2-KLG合成效率的著眼點(diǎn)在于保證巨大芽胞桿菌的充分生長(zhǎng)，以提供高豐度的生物活性物質(zhì)?；旌暇抵芯薮笱堪麠U菌僅能利用玉米漿中的碳源。因此，培養(yǎng)體系中充足的碳源對(duì)巨大芽胞桿菌的生長(zhǎng)就顯得尤為重要。作者在分析玉米漿中碳源種類(lèi)及其對(duì)巨大芽胞桿菌和普通生酮古龍酸菌生長(zhǎng)影響的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)高滲 (1 250 mOsmol/kg) 條件下蔗糖顯著促進(jìn)巨大芽胞桿菌單獨(dú)生長(zhǎng)與混菌體系中普通生酮古龍酸菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸，且效果一致。在 3 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵中添加蔗糖使2-KLG的生產(chǎn)強(qiáng)度提高了 10.4%。這一研究結(jié)果表明，添加蔗糖能夠有效提高高滲條件下巨大芽胞桿菌的生長(zhǎng)能力，促使生物活性物質(zhì)的分泌，進(jìn)而促進(jìn)普通生酮古龍酸菌的生長(zhǎng)和2-KLG的合成。

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Enhancing 2-keto-L-gulonic acid production under hyperosmotic stress by adding sucrose

Kejie Chen1,2, Jingwen Zhou1,2, Liming Liu1,2, Jie Liu3, Guocheng Du2, and Jian Chen1,2

1State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi214122,China
2Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi214122,China
3Jiangsu Jiangshan Pharmaceutical Co.Ltd.,Jingjiang214500,China

Received:April 16, 2010;Accepted:July 19, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006AA020303), Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period (No. 2007BAI46B02), National Basic Research Program of China(973 Program) (No. 2007CB714306), Key Program of National Natural Science Foundation of China (No. 20836003).

Corresponding author:Liming Liu. Tel: +86-510-85918307; E-mail: mingll@jiangnan.edu.cn

Jian Chen. E-mail: jchen@jiangnan.edu.cn

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (863計(jì)劃) (No. 2006AA020303)，“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃 (No. 2007BAI46B02)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃) (No. 2007CB714306)，國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目 (No. 20836003) 資助。