乳腺生物反應(yīng)器表達(dá)的重組人乳鐵蛋白的分離純化及生物活性鑒定

白倩，張焱，汪音爵，羅堅，李巖，黃永東，馬潤宇，蘇志國

1 北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029

2 中國科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室，北京 100190

生物技術(shù)與方法

乳腺生物反應(yīng)器表達(dá)的重組人乳鐵蛋白的分離純化及生物活性鑒定

白倩1,2，張焱2，汪音爵2，羅堅2，李巖2，黃永東2，馬潤宇1，蘇志國2

1 北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029

2 中國科學(xué)院過程工程研究所 生化工程國家重點實驗室，北京 100190

以國產(chǎn)高交聯(lián)度的快流速瓊脂糖為基質(zhì)，合成了不同配基密度的 SP (Sulfopropyl，磺酸基) 離子交換介質(zhì)，建立了乳腺生物反應(yīng)器表達(dá)重組人乳鐵蛋白 (Recombinant Human Lactoferrin，rHLF) 的純化方法。以溶菌酶為模型蛋白考察了不同配基密度離子交換介質(zhì)的靜態(tài)和動態(tài)吸附行為，結(jié)果表明介質(zhì)具有良好的吸附性能。不同配基密度離子交換介質(zhì)均可純化得到rHLF，其中，高配基密度 (0.24 mol/L) 的離子交換介質(zhì)每毫升可以處理50 mL rHLF牛乳，rHLF收率為86.5%，純度為98.5%。圓二色譜的測定結(jié)果表明純化的rHLF二級結(jié)構(gòu)與天然人乳鐵蛋白一致。生物學(xué)功能實驗結(jié)果表明，rHLF的鐵結(jié)合與釋放活性與天然人乳鐵蛋白相似，濃度為5 g/L的rHLF對大腸桿菌的生長具有明顯的抑制作用。

離子交換介質(zhì)，配基密度，重組人乳鐵蛋白，純化，抑菌活性

Abstract:Novel ion exchange adsorbents were synthesized by immobilizing sulfopropyl derivative onto homemade highly cross-linked agarose beads. The effects of different ligand densities (from 0.05 to 0.24 mol/L) on static and dynamic adsorption of the adsorbents were investigated using lysozyme as a model protein. Based on these results, rHLF was purified from the transgenic milk by our SP media. 1 mL high density (0.24 mol/L) adsorbent could handle 50 mL rHLF-containing milk. The mass recovery of rHLF was 86.5% and the purity was 98.5%. CD spectra demonstrated that the native structure of rHLF was not affected in the purification process. The biological functions of the purified rHLF, including iron binding, releasing and antimicrobial activities were then investigated. The results showed that rHLF had comparable iron binding and releasing activity to that of native HLF. 5 g/L concentration of rHLF significantly inhibited the growth ofEscherichia coli. These studies lay a solid foundation for the wideapplication of our self-prepared ion exchange adsorbents in protein purification.

Keywords:ion exchange adsorbents, ligand density, recombinant human lactoferrin, purification, antimicrobial activity

乳鐵蛋白 (Lactoferrin，LF) 又名乳轉(zhuǎn)鐵蛋白，是轉(zhuǎn)鐵蛋白家族的重要一員。其分子量大約80 kDa[1]，等電點為8.7左右[2]。乳鐵蛋白分子中結(jié)合了兩條糖鏈，占分子量的7%左右。蛋白分子N端和C端的特征環(huán)狀結(jié)構(gòu)可以結(jié)合三價鐵離子。乳鐵蛋白具有多種重要的生理功能，主要包括鐵吸收與釋放、抗菌活性以及炎癥反應(yīng)中的鐵離子代謝等。人乳中乳鐵蛋白含量較高，但因人乳來源有限，嚴(yán)重限制了其商業(yè)化應(yīng)用。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的突飛猛進(jìn)，利用家畜乳腺生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)人乳鐵蛋白已經(jīng)獲得成功[3]，從重組牛乳中純化所得的rHLF蛋白可以廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥及營養(yǎng)等領(lǐng)域。

離子交換層析技術(shù)適用范圍廣，洗脫條件溫和，已成為蛋白質(zhì)分離純化中非常重要的一種手段，rHLF蛋白也可以通過陽離子交換層析進(jìn)行有效純化[4-5]。但是蛋白質(zhì)在層析過程中存在的一個主要問題是介質(zhì)表面可能引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，造成蛋白質(zhì)的失活[6-7]。其中介質(zhì)表面的配基類型和密度對蛋白結(jié)構(gòu)影響最大。比如 Karger小組[8-9]研究了疏水介質(zhì)的配基類型對溶菌酶、胃蛋白酶、牛胰蛋白酶抑制劑等蛋白結(jié)構(gòu)的影響，研究發(fā)現(xiàn)介質(zhì)的疏水性越強，越易造成蛋白結(jié)構(gòu)的變化。Fernandez小組[10]利用 H-D 結(jié)合核磁共振發(fā)現(xiàn) α-乳白蛋白(α-Lactalbumin) 在不同的疏水表面其結(jié)構(gòu)變化的程度不同。Visser[11]和Eagle小組[12]利用圓二色光譜發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在介質(zhì)表面的吸附狀態(tài)類似于熔球態(tài)，盡管保留了大部分二級結(jié)構(gòu)，但是失去了三級結(jié)構(gòu)。黃永東等[13]在研究離子交換介質(zhì)的配基密度對重組乙肝病毒表面抗原 (r-HBsAg) 的結(jié)構(gòu)影響時發(fā)現(xiàn)介質(zhì)配基密度越大，蛋白越容易變性。此外，目前用于純化 rHLF蛋白的商品化離子交換介質(zhì) SP Sepharose Fast Flow為GE Healthcare公司產(chǎn)品，其價格昂貴。而且在實際操作中所處理的物料為牛乳，其成分復(fù)雜，對離子交換介質(zhì)的污染比較嚴(yán)重，所以使用周期有限。因此合成價低質(zhì)優(yōu)的離子交換介質(zhì)用于替代進(jìn)口介質(zhì)可以大幅度降低生產(chǎn)成本，解決對進(jìn)口介質(zhì)的長期依賴問題。

本研究在純化rHLF的過程中，研制開發(fā)了以國產(chǎn)高交聯(lián)度快流速瓊脂糖為基質(zhì)、不同配基密度的適用于rHLF分離純化的SP離子交換介質(zhì)。該介質(zhì)吸附性能良好，合成工藝中配基密度可控，一方面可以有效地控制層析過程對rHLF結(jié)構(gòu)的影響，從而得到具有正常生物活性的重組蛋白質(zhì)；另一方面有效地降低rHLF的生產(chǎn)成本，有望替代目前工業(yè)生產(chǎn)廣泛使用的進(jìn)口離子交換介質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1轉(zhuǎn)基因牛乳凍干粉

由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室提供。

1.1.2陽離子交換介質(zhì)

高交聯(lián)度快流速瓊脂糖 (QZT，6%瓊脂糖)由中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程技術(shù)中心合成；SP Sepharose FF購自GE Healthcare公司(美國)。

1.1.3試劑

牛血清白蛋白 (Bovine Serum Albumin，BSA) 購自 Roche 公司 (德國)；溶菌酶 (Lysozyme，LYZ) 購自Merck 公司 (德國)；天然人乳鐵蛋白購自Sigma公司 (美國)；化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；所用純水由Milli Q-plus超純水機(jī)制備 (Millipore，美國)。

1.1.4儀器

常壓層析系統(tǒng)：?KTA purifier購自 GE Healthcare 公司 (美國)；質(zhì)譜儀：LCQ Deca xpplus購自Thermo公司 (美國)；電泳儀：Mini-PROTEAN Tetra System 購自 Bio-Rad公司 (美國)；高效凝膠過濾色譜儀：Agilent 1100購自Agilent公司 (美國)；圓二色光譜儀：Jasco810 購自 Jasco公司 (日本)；滅菌鍋：手提式壓力蒸汽消毒器購自江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠；超凈臺：YT-CJ-2ND型生物工作臺購自北京半導(dǎo)體設(shè)備廠。

1.2 介質(zhì)合成及層析方法

1.2.1SP QZT FF 介質(zhì)的合成

以國產(chǎn)的快流速瓊脂糖 (QZT，6%瓊脂糖) 為基質(zhì)，經(jīng)活化，偶聯(lián)，收獲 3個步驟[14]合成了 SP瓊脂糖凝膠 (SP QZT FF)。通過改變活化劑烯丙基縮水甘油醚 (Allylglycidyl ether，AGE) 的用量，獲得不同配基密度的SP瓊脂糖凝膠，配基密度可以控制在 0.05～0.24 mol/L。(配基密度以介質(zhì)中磺酸基的交換容量來表示)。

1.2.2SP QZT FF 介質(zhì)的蛋白吸附性能

具體方法參見文獻(xiàn)[15]，所用緩沖液為20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，實驗數(shù)據(jù)均為3次實驗的平均值。溶菌酶含量的測定采用紫外吸收法，溶菌酶消光系數(shù)為 2.63 L/(g·cm)[16]。

1.2.3層析方法

對于rHLF的層析實驗，取轉(zhuǎn)基因牛乳凍干粉，45℃水溶解后，4℃、12 000 r/min 離心30 min去除脂肪，即得脫脂乳。以1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH至4.6，靜置20 min，4℃、12 000 r/min離心30 min，去除酪蛋白；再以1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0，4℃、12 000 r/min 離心 10 min，上清即為牛乳乳清。合成的介質(zhì)充分清洗后裝柱 (25 cm×10 mm I.D.，CV=5 mL)，用 0.5 mol/L NaOH 清洗5個柱床體積后，連接到常壓層析系統(tǒng)。使用 Buffer A (20 mmol/L PB，pH值隨具體實驗調(diào)整) 平衡后，乳清進(jìn)樣若干，進(jìn)樣完畢之后繼續(xù)使用Buffer A淋洗至UV基線，得到穿透峰p0，使用Buffer B (20 mmol/L PB，pH值和NaCl濃度隨具體實驗調(diào)整) 進(jìn)行線性洗脫，洗脫梯度為0%～100% Buffer B，洗脫時間60 min，收集洗脫峰分別記為p1、p2、p3等，流速1 mL/min，紫外檢測波長280 nm。

1.3 鑒定檢測方法

1.3.1蛋白質(zhì)濃度測定

蛋白質(zhì)濃度參照Bradford法測定[17]，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品BSA的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得原料及各個洗脫峰中的蛋白質(zhì)含量。

1.3.2質(zhì)譜鑒定

送交中國科學(xué)院化學(xué)研究所質(zhì)譜中心鑒定。

1.3.3高效凝膠過濾分析

凝膠過濾使用 Agilent 1100 層析系統(tǒng)和SuperdexTM75 (20 cm×10 mm，I.D.) 層析柱，緩沖液為 Buffer C (20 mmol/L PB+0.1 mol/L Na2SO4)，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量 100 μL。

1.3.4SDS-PAGE 電泳分析

SDS-PAGE 電泳參照文獻(xiàn)[18]。濃縮膠的濃度為 5%，分離膠的濃度為 12%，電泳緩沖液采用Tris-甘氨酸系統(tǒng)。

1.3.5圓二色光譜 (CD) 分析

圓二色光譜儀為Jasco810 (Jasco，日本)。掃描波長為190～260 nm，分辨率為1 nm。用與待測樣品中溶液相同的體系作為空白，CD譜圖為3次測量結(jié)果的平均值。

1.3.6rHLF鐵離子結(jié)合與釋放活性

鐵離子結(jié)合活性：將凍干的重組乳鐵蛋白溶解到 FeNTA溶液 (10 mmol/L硝酸鐵，8.5 mmol/L NTA，用固體 NaHCO3調(diào) pH至 7.0) 中，乳鐵蛋白與 Fe3+的摩爾比 1∶4，室溫下反應(yīng) 1 h后用0.15 mol/L NaCl溶液透析。透析所得蛋白溶液使用分光光度計進(jìn)行全波長掃描，掃描范圍260～700 nm。

鐵離子釋放活性：鐵飽和的重組人乳鐵蛋白分別在不同pH值 (pH 2.0～7.0) 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中透析平衡，使用分光光度計測量透析所得蛋白溶液在280 nm和465 nm處的吸收值。

1.3.7抗菌活性

用肉湯瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌，挑單菌落至10 mL液體培養(yǎng)基中，200 r/min 培養(yǎng)5 h，溫度37℃。取100 μL菌液加入到10 mL終濃度分別為0.5、2、5 g/L的rHLF蛋白溶液中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于 0、4、8、16、24 h的時候取出部分菌液測定其在 600 nm處的吸收值，陰性對照使用無菌水代替rHLF蛋白溶液，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 自制介質(zhì)蛋白吸附性能的考察

離子交換層析介質(zhì)的吸附性能會影響分離純化的效率[19]。介質(zhì)的吸附性能包括兩個方面：靜態(tài)吸附性能和動態(tài)吸附性能。靜態(tài)吸附平衡可以反映介質(zhì)的吸附量，而介質(zhì)的動態(tài)吸附行為與實際操作更為貼近，本研究首先采用溶菌酶作為模型蛋白質(zhì)考察了不同配基密度介質(zhì)的吸附性能，并與進(jìn)口介質(zhì)進(jìn)行了比較。

2.1.1靜態(tài)吸附平衡

以溶菌酶為模型蛋白質(zhì)考察了常溫25℃下自制介質(zhì)的靜態(tài)吸附平衡。按照 Langmuir吸附等溫方程[20]的形式計算了自制介質(zhì)吸附性能，結(jié)果見表1，隨著配基密度的增加，介質(zhì)對蛋白的飽和吸附容量qm隨之增加，解離常數(shù)Kd隨之減小，其中qm相近的自制介質(zhì) (配基密度為 0.20 mol/L) 與進(jìn)口介質(zhì)相比，其Kd值低于進(jìn)口介質(zhì)，這種現(xiàn)象的優(yōu)點是使得此自制介質(zhì)結(jié)合蛋白的能力增強，可以對在某些條件下帶電性較弱的蛋白形成有效吸附，雖然此介質(zhì)也可能會在純化過程中引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，但是可以通過提高緩沖液的電導(dǎo)來避免這種現(xiàn)象的發(fā)生。此外，自制介質(zhì)的最高配基密度可以達(dá)到0.24 mol/L，該介質(zhì)的吸附容量高于進(jìn)口介質(zhì)的吸附容量。

表1 不同配基密度對溶菌酶吸附性能的影響Table 1 Effect of different ligand densities on the adsorption character of Lysozyme to SP QZT FF (25°C)

2.1.2動態(tài)吸附平衡

通常選用穿透曲線來評價介質(zhì)的動態(tài)吸附性能，在沒有達(dá)到吸附飽和之前，層析柱流出液的蛋白濃度為零；當(dāng)達(dá)到吸附飽和臨界點時，層析柱流出液的蛋白濃度突然上升并很快達(dá)到進(jìn)樣料液的蛋白濃度，表現(xiàn)為一條非常陡峭的曲線，通常把峰高10%處稱為穿透點。圖1為流速為0.2 mL/min時，溶菌酶在不同配基密度自制SP QZT FF層析柱及進(jìn)口SP Sepharose FF層析柱中的穿透曲線。

圖1 溶菌酶在不同配基密度自制SP QZT FF柱及進(jìn)口SP Sepharose FF柱上的穿透液濃度隨層析過程的變化曲線Fig.1 Penetration profile of Lysozyme on SP Sepharose FF and self-prepared SP QZT FF with different ligand densities.C/C0:ratio of penetrating protein concentration to loading protein concentration;Volume/Column Volume: ratio of loading volume to column volume. The ligand densities of the adsorbents 1 to 5 were 0.05, 0.10, 0.15, 0.20 and 0.24 mol/L,respectively.

從結(jié)果可以看出，在流速為0.2 mL/min的條件下，隨著自制介質(zhì)配基密度的增加，溶菌酶的穿透時間越來越晚，說明其動態(tài)載量越來越大。此外，吸附曲線為窄陡型，說明自制介質(zhì)具有很好的動態(tài)吸附性能。其中高配基密度 (0.24 mol/L) 的自制介質(zhì)穿透時間晚于進(jìn)口介質(zhì)，說明自制高配基密度介質(zhì)的吸附容量高于進(jìn)口介質(zhì)，可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的高容量分離，具有良好的應(yīng)用前景。

2.2 重組人乳鐵蛋白的離子交換層析

影響離子交換層析的因素很多，包括層析介質(zhì)、流動相、pH值、鹽濃度、蛋白質(zhì)濃度等，這些因素之間的作用非常復(fù)雜。其中層析介質(zhì)是純化過程的核心，介質(zhì)的性能對于分離的效果起到?jīng)Q定性的作用。本實驗以重組人乳鐵蛋白為研究對象，考察了自制介質(zhì)對蛋白的純化效果。通過優(yōu)化實驗選擇 Buffer A (20 mmol/L PB，pH 6.0) 和Buffer B (20 mmol/L PB+1 mol/L NaCl，pH 6.0) 作為流動相。乳清進(jìn)料40 mL (蛋白濃度 6.75 g/L) 后用 Buffer A淋洗至UV基線，再以線性梯度洗脫并分別收集穿透峰和洗脫峰，實驗考察了不同配基密度介質(zhì)對rHLF分離純化的層析效果，圖2是以高配基密度 (0.24 mol/L) 自制介質(zhì)純化rHLF的層析譜圖，其他介質(zhì)對rHLF的層析行為均相似。

圖2 自制離子交換介質(zhì)分離rHLF層析譜圖Fig.2 Chromatogram of rHLF purified by self-prepared SP QZT FF. Column size: 25 cm×10 mm I.D., CV=5 mL; Buffer A:20 mmol/L PB, pH 6.0; Buffer B: 20 mmol/L PB+1 mol/L NaCl, pH 6.0; Loading volume: 40 mL; Flowing rate: 1 mL/min.The ligand density of the adsorbent was 0.24 mol/L.

對圖中p0、p1+p2、p3進(jìn)行了SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖3，自制介質(zhì)純化得到的p3峰為高純度的重組乳鐵蛋白，p1和p2峰僅含有少量的重組乳鐵蛋白，穿透峰p0里無重組人乳鐵蛋白，分離效果令人滿意。本實驗又對p3峰進(jìn)行了高效凝膠過濾分析 (HPSEC，High-Performance Size-Exclusion Chromatography，圖4)，結(jié)果表明自制介質(zhì)純化得到的重組人乳鐵蛋白的純度達(dá)到95%以上，使用紫外積分計算回收率達(dá)到80%以上。

此外，我們考察了不同配基密度介質(zhì)在分離轉(zhuǎn)基因牛乳過程中的處理量，并與進(jìn)口介質(zhì)進(jìn)行了比較。在層析進(jìn)樣過程中分段收集流出液，并使用HPSEC分析流出液組分，出現(xiàn)rHLF特征峰時對應(yīng)的進(jìn)樣體積即為最大處理量，結(jié)果見表2。隨著配基密度的增加，每毫升介質(zhì)對轉(zhuǎn)基因牛乳的最大處理量逐漸增加，其中1 mL高配基密度介質(zhì) (0.24 mol/L)可以處理50 mL轉(zhuǎn)基因牛乳，高于進(jìn)口介質(zhì)的處理量，節(jié)省了純化工藝的上樣時間，可以實現(xiàn) rHLF高容量分離。

圖3 自制離子交換介質(zhì)純化rHLF收集組分的SDS-PAGE電泳分析圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of fractions collected from self-prepared SP QZT FF. M: molecular weight marker; 1: p0flowing through from self-prepared SP QZT FF; 2: whey extract of transgenic milk; 3: p1+p2eluted from self-prepared SP QZT FF; 4: p3eluted from self-prepared SP QZT FF; 5: HLF standard. The ligand density of the adsorbent was 0.24 mol/L.

圖4 自制離子交換介質(zhì)層析洗脫峰p3的高效凝膠過濾圖Fig.4 HPSEC analysis of elution fraction p3from self-prepared SP QZT FF. The ligand density of the adsorbent was 0.24 mol/L.

表2 每毫升介質(zhì)對轉(zhuǎn)基因牛乳的最大處理量Table 2 Maximal transgenic milk treatment volume by 1 mL adsorbent

2.3 純化的重組乳鐵蛋白的分子量測定

MALDI-TOF 的結(jié)果表明，我們純化得到的重組人乳鐵蛋白的分子量為79 481 Da (圖5)，由于人乳鐵蛋白單肽的理論分子量為76 304 Da，所以重組人乳鐵蛋白的糖鏈分子量應(yīng)為3 177 Da。天然人乳鐵蛋白的分子量為82 000 Da左右，所以重組人乳鐵蛋白與天然人乳鐵蛋白的分子量相差2 000 Da左右，分子量的差異可能是牛乳腺表達(dá)的重組人乳鐵蛋白與天然人乳鐵蛋白的糖基化形式的差異造成的[3]。

圖5 rHLF分子量測定Fig.5 Determination of molecular weight of rHLF.

2.4 純化重組乳鐵蛋白的圓二色分析

為了評價自制介質(zhì)對牛乳腺表達(dá)的重組人乳鐵蛋白結(jié)構(gòu)的影響，我們使用圓二色譜比較了純化產(chǎn)品和天然人乳鐵蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6所示，不同配基密度介質(zhì)洗脫下來的rHLF均與天然HLF的圓二色譜曲線重合較好，說明離子交換層析中介質(zhì)配基密度的高低不會造成 rHLF二級結(jié)構(gòu)的不可逆變化，即我們自制介質(zhì)的純化不會導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)的變性，有利于我們得到完整生物活性的重組蛋白。

2.5 純化重組人乳鐵蛋白的生化性質(zhì)與生理功能的鑒定

重組表達(dá)蛋白質(zhì)的研究往往存在一個問題，即重組蛋白生物活性喪失，或活性較低。表達(dá)過程中的蛋白一級序列的改變，或者蛋白折疊的錯誤，甚至糖基化、磷酸化的錯誤修飾都能導(dǎo)致重組蛋白活性的異常。人乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因研究的目的是生產(chǎn)大量具有正常生物活性、功能的重組人乳鐵蛋白。因此對重組蛋白的理化性質(zhì)和生物活性的分析與鑒定就顯得尤為重要。本實驗考察了重組人乳鐵蛋白的活性，包括鐵離子結(jié)合能力和抑菌能力，來評估重組人乳鐵蛋白的生化性質(zhì)與生理功能。

圖6 不同配基密度離子交換介質(zhì)制備rHLF的圓二色譜圖Fig.6 Circular dichroism spectrum of rHLF desorbed from adsorbents with different ligand densities. The ligand densities of the adsorbents 1 to 5 were 0.05, 0.10, 0.15, 0.20 and 0.24 mol/L, respectively.

2.5.1鐵結(jié)合與釋放的結(jié)果

人乳鐵蛋白結(jié)合和釋放鐵離子的能力具有重要的生理意義。乳鐵蛋白在腸道中能夠識別并特異結(jié)合細(xì)胞表面的人乳鐵蛋白受體 (LF receptor，LFR)，從而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部釋放出 Fe3+，提供給細(xì)胞吸收利用。人乳鐵蛋白分子結(jié)合鐵離子之后空間結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，465 nm處出現(xiàn)特征吸收峰[21]。實驗結(jié)果表明，重組人乳鐵蛋白在體外經(jīng)過鐵飽和處理后，在465 nm處也出現(xiàn)了明顯特征吸收峰 (圖7)，這說明重組人乳鐵蛋白同樣具備結(jié)合鐵離子的能力[22]。接下來，我們比較了重組人乳鐵蛋白和天然人乳鐵蛋白在不同 pH條件下鐵離子的結(jié)合能力。實驗結(jié)果(圖8) 表明，重組人乳鐵蛋白在不同pH條件下與鐵離子的結(jié)合能力不同，在中性或偏酸性的條件下，重組人乳鐵蛋白能夠有效結(jié)合鐵離子。當(dāng)pH下降到4.5時，鐵離子開始解離；隨著pH的進(jìn)一步降低到pH 2.5時，大部分鐵離子均從乳鐵蛋白中解離出來，這與天然人乳鐵蛋白的鐵結(jié)合與釋放活性基本一致。

圖7 未結(jié)合鐵與結(jié)合鐵的rHLF的掃描圖譜Fig.7 Full-wavelength-scan profile of iron free and binding rHLF.

圖8 rHLF在不同pH條件下鐵結(jié)合與釋放情況Fig.8 Profile of iron binding rHLF in different pH conditions.

2.5.2重組乳鐵蛋白抑菌活性分析

人乳鐵蛋白能特異結(jié)合細(xì)菌生長不可或缺的鐵離子[23]，并抑制細(xì)菌的生長。也有報道[24]認(rèn)為人乳鐵蛋白能夠直接結(jié)合到細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖上，改變細(xì)胞壁的滲透壓，使細(xì)菌的胞質(zhì)外瀉而直接殺滅細(xì)菌。我們研究了重組人乳鐵蛋白在體外對大腸桿菌生長的抑制作用。結(jié)果表明，濃度為5 g/L的重組人乳鐵蛋白對大腸桿菌的生長具有明顯抑制作用(圖9)；當(dāng)重組人乳鐵蛋白的濃度降低到2 g/L時，對細(xì)菌的生長的抑制作用下降；當(dāng)重組人乳鐵蛋白的濃度進(jìn)一步降低到0.5 g/L時，對細(xì)菌基本沒有抑制作用。這說明，重組人乳鐵蛋白的抑菌作用是劑量依賴的，只有達(dá)到一定的劑量，人乳鐵蛋白才會表現(xiàn)出明顯的抑菌效果。

圖9 rHLF對大腸桿菌生長的抑制活性Fig.9 Antibacterial effect of rHLF.

3 結(jié)論

本研究自主合成了不同配基密度的 SP離子交換介質(zhì)，其中最高密度可以達(dá)到0.24 mol/L。以溶菌酶為模型蛋白的吸附實驗結(jié)果表明，層析介質(zhì)的吸附容量隨配基密度的增加而升高，制備的最高配基密度介質(zhì)的吸附容量高于進(jìn)口介質(zhì)，每毫升此介質(zhì)可以處理50 mL重組人乳鐵蛋白牛乳。不同配基密度層析介質(zhì)均具備良好的rHLF分離純化性能，其中最高配基密度介質(zhì)純化rHLF收率為86.5%，純度為98.5%。通過層析實驗發(fā)現(xiàn)，本實驗范圍內(nèi)的不同配基密度SP離子交換介質(zhì)不會對rHLF的二級結(jié)構(gòu)造成不可逆的改變，純化所得的rHLF具有與天然人乳鐵蛋白一致的生物學(xué)活性，可以用于rHLF純化的規(guī)模化生產(chǎn)。此外，自制介質(zhì)成本低廉 (價格僅約為進(jìn)口介質(zhì)的1/3～1/2)，有效地降低了rHLF的生產(chǎn)成本，解決了目前國內(nèi)蛋白質(zhì)純化長期依賴進(jìn)口介質(zhì)的問題。

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Purification and characterization of recombinant human lactoferrin expressed in a cattle mammary bioreactor

Qian Bai1,2, Yan Zhang2, Yinjue Wang2, Jian Luo2, Yan Li2, Yongdong Huang2, Runyu Ma1,and Zhiguo Su2

1College of Life Science and Technology,Beijing University of Chemical Technology,Beijing100029,China
2National Key Laboratory of Biochemical Engineering,Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences,Beijing100190,China

Received:February 1, 2010;Accepted:April 9, 2010

Supported by:National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (Nos. 2007AA100506, 2010AA100501),National Nature Science Foundation of China (No. 20706052).

Corresponding author:Jian Luo. Tel/Fax: +86-10-82627062; E-mail: jluo@home.ipe.ac.cn

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) (Nos. 2007AA100506, 2010AA100501)，國家自然科學(xué)基金 (No. 20706052) 資助。