海參溶菌酶基因克隆及在畢赤酵母中的表達(dá)與純化

谷 躍 峰， 叢 麗 娜， 駱 寧

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

溶菌酶(Lysozyme，EC3.2.1.17)是一種堿性球蛋白,該酶主要通過水解細(xì)菌細(xì)胞壁N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1，4糖苷鍵，破壞肽聚糖支架，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出，從而使細(xì)菌溶解的。人和動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)亦無肽聚糖，故溶菌酶對人體和動(dòng)物細(xì)胞無毒性作用，所以作為天然防腐劑的溶菌酶在食品工業(yè)中有廣闊的應(yīng)用價(jià)值[1]。溶菌酶的來源十分廣泛，已知的可分為6類：c-型、g-型、i-型、植物溶菌酶、細(xì)菌溶菌酶和噬菌體溶菌酶[2]。海參溶菌酶即屬于i-型溶菌酶。巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)是目前分子生物學(xué)領(lǐng)域中用于表達(dá)重組蛋白的標(biāo)準(zhǔn)工具之一[3],該系統(tǒng)具有高表達(dá)、高穩(wěn)定性、高分泌、表達(dá)后加工、高密度發(fā)酵培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。目前已有數(shù)百種外源蛋白在該表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)[4]，其中也有研究者成功表達(dá)出了溶菌酶[5-6]，但 i-型溶菌酶在畢赤酵母中表達(dá)的研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)就是研究SJL在畢赤酵母中表達(dá)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種與試劑

海刺參,由大連獐子島漁業(yè)集團(tuán)提供；畢赤酵母GS115、表達(dá)載體pPIC9K和Trizol試劑等,Invitrogen公司；大腸桿菌DH5α、克隆載體pMD18-T、限制性核酸內(nèi)切酶(EcoRⅠ、NotⅠ、BglⅡ)、TaKaRa one step RNA PCR Kit (AMV),TaKaRa Biotechnology(大連)公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,TIANGEN生化科技(北京)有限公司；G418,德國Merck公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

YPD：1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖，1.5%瓊脂粉。用于菌體的生長、篩選及保藏。

MD：1.34%酵母氮源(YNB)，2%葡萄糖，4×10-7生物素，1.5%瓊脂粉。用于篩選菌株的表現(xiàn)型。

MM：1.34%酵母氮源，0.5%甲醇(體積分?jǐn)?shù))，4×10-7生物素，1.5%瓊脂粉。用于篩選菌株的表現(xiàn)型。

BMGY：1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)，1.34%酵母氮源，4×10-7生物素，1%甘油。用于誘導(dǎo)表達(dá)前菌體的生長。

BMMY：1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)，1.34%酵母氮源，4×10-7生物素，0.5%甲醇。用于誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)SJL基因的CDS區(qū)序列，使用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，上、下游引物分別命名為HS-1和HS-2，其中分別在上游引物中引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物中引入NotⅠ酶切位點(diǎn)，如下：

HS-1：5′--GCAGAATTCATGCAAGTTCCTTCTGATTGC--3′

HS-2：5′--AAGTTTGCGGCCGCTCAGTTGTTGCTCAT--3′

1.2.2 SJL基因的擴(kuò)增

從新鮮的海參腸組織中利用Trizol試劑法提取總RNA，并以此為模板，利用TaKaRa one step RNA PCR Kit (AMV)試劑盒和設(shè)計(jì)好的引物，通過一步法RT-PCR擴(kuò)增SJL基因。PCR循環(huán)參數(shù)為：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將SJL基因連接到克隆載體pMD18-T上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-SJL，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，挑陽性菌落，經(jīng)菌落PCR鑒定后送交TaKaRa Biotechnology(大連)公司測序驗(yàn)證。

1.2.3 重組畢赤酵母的構(gòu)建

從驗(yàn)證正確的菌株中回收pMD18-T-SJL，用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，回收SJL基因，連接到同樣經(jīng)雙酶切的表達(dá)載體pPIC9K中，構(gòu)建真核重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-SJL。再將pPIC9K-SJL經(jīng)BglⅡ線性化后，采用PEG1000轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中，構(gòu)建重組畢赤酵母，挑取單菌落。同時(shí)構(gòu)建陰性對照菌株，即將不包含SJL基因的表達(dá)載體pPIC9K轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中。將得到的單菌落分別點(diǎn)在MD和MM培養(yǎng)基上，通過比較生長速度來確定得到的菌株的表型，再經(jīng)含梯度濃度G418(0.25～4.0 mg/mL)的YPD培養(yǎng)基篩選出高拷貝陽性菌株，從中篩選出有活性的菌株。

1.2.4 SJL的誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)酵分析

將重組畢赤酵母菌株接種于10 mL BMGY液體種子培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)18 h。再按10%接種量轉(zhuǎn)接至25 mL BMGY液體培養(yǎng)基，30 ℃搖床擴(kuò)大培養(yǎng)18 h，離心收集菌體。將細(xì)胞沉淀全部轉(zhuǎn)移至25 mL BMMY液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)，每隔24 h取樣，并補(bǔ)加甲醇(終體積分?jǐn)?shù)為0.5%)。96 h后結(jié)束誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE電泳分析表達(dá)情況。

1.2.5 SJL表達(dá)產(chǎn)物純化

將誘導(dǎo)表達(dá)后的發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心，收集上清液。在上清液中加入硫酸銨至飽和度達(dá)40%，4 ℃沉淀過夜后離心，取上清液，補(bǔ)加硫酸銨至飽和度達(dá)到60%，4 ℃沉淀過夜后離心，沉淀用0.02 mol/L的磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)溶解、透析，得到粗酶液。

稱取12 g CM52-纖維素，用蒸餾水浸泡后裝柱，經(jīng)預(yù)處理后將粗酶液上柱，先用0.02 mol/L的磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)洗脫，再用由緩沖液配制的KCl溶液(60、120、180、240、300 mmol/L)進(jìn)行分級梯度洗脫，體積流量為1 mL/min。用分布收集器收集(每管收集3 mL)。取峰值管中的流出液，用SDS-PAGE電泳檢測。采用Bradford方法[7]分別測定誘導(dǎo)表達(dá)后和純化后的蛋白含量，比濁法[8]測定表達(dá)后和純化后的酶活力。

2 結(jié)果與討論

2.1 SJL基因的擴(kuò)增結(jié)果

從新鮮的海參腸組織中提取總RNA，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。提取的RNA條帶清晰，28S rRNA和18S rRNA條帶之間沒有模糊條帶，提取成功，可用作模板進(jìn)行RT-PCR。RT-PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。在圖中約400 bp處有明顯的條帶，而且條帶明亮，擴(kuò)增成功。

M，500 bp DNA Marker；1，提取的總RNA樣品圖1 總RNA提取Fig.1 Extraction of total RNA

M，100 bp DNA Marker；1，SJL的PCR產(chǎn)物；2，陰性對照

2.2 重組畢赤酵母的構(gòu)建

重組表達(dá)載體pPIC9K-SJL轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115后，涂布于MD固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落，所有菌株均為組氨酸利用正常型，即His+型。再經(jīng)MD和MM固體培養(yǎng)基確定其表型均為Muts，即甲醇利用緩慢型，與理論相符。經(jīng)G418篩選，在質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL的YPD平板培養(yǎng)基上，共得到7株有活性的高拷貝轉(zhuǎn)化子，并通過菌落PCR驗(yàn)證，引物為HS-1和HS-2，結(jié)果見圖3。圖中顯示泳道2在400 bp處有條帶，而作為陰性對照的泳道1在此處沒有條帶，說明菌株中確實(shí)含有SJL基因。

M，100 bp DNA Marker；1，陰性對照；2，重組畢赤酵母

2.3 SJL的誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)酵結(jié)果

重組SJL畢赤酵母菌株經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)液體發(fā)酵，并定時(shí)取樣分析。將處理的樣品經(jīng)12%的SDS-PAGE凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖4。泳道1為陰性對照，在14.3 ku處無條帶，而泳道2～5分別為24、48、72、96 h時(shí)取的樣品，在14.3 ku處均有條帶，而且72 h時(shí)表達(dá)量最高。表達(dá)出的蛋白分子質(zhì)量大小與雞蛋清溶菌酶的相符。

M，Protein MW Marker；1，陰性對照；2～5，誘導(dǎo)24～96 h時(shí)發(fā)酵上清液圖4 SJL誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expressed SJL

2.4 SJL表達(dá)產(chǎn)物的純化

發(fā)酵液的上清液經(jīng)硫酸銨沉淀和離子交換層析后，其純化結(jié)果見圖5。利用Bradford方法測得表達(dá)后和純化后的蛋白總量，比濁法測定表達(dá)后和純化后的總活力。經(jīng)計(jì)算，表達(dá)后的發(fā)酵上清液的比活力為6.3 U/mg，純化后的SJL比活力為26.9 U/mg，純化倍數(shù)為4.3倍，總活力回收率為28.1%。

M，Protein MW Marker；1，硫酸銨沉淀后粗酶液；2，純化后的SJL圖5 純化后的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purified SJL

3 結(jié) 論

目前，海參溶菌酶(SJL)基因的全序列測序工作已由本實(shí)驗(yàn)室完成并提交到GenBank[9],并且SJL已經(jīng)在大腸桿菌中得到了成功表達(dá)[10]，但產(chǎn)品得率較低，原因是SJL在胞內(nèi)表達(dá)以包涵體形式存在，所以純化步驟較繁瑣。由于SJL來源于真核細(xì)胞，所以在理論上真核細(xì)胞比原核細(xì)胞更有利于該酶的表達(dá)，而且畢赤酵母的翻譯后修飾功能，能夠使SJL得到正確的加工和折疊。另外，分泌型表達(dá)載體pPIC9K的使用，也促使該純化過程比原核細(xì)胞的胞內(nèi)表達(dá)得到簡化。本研究結(jié)果表明，SJL已在畢赤酵母中得到成功的表達(dá)，純化后的比活力為26.9 U/mg，比在大腸桿菌中表達(dá)純化后的比活力[10]提高了40%，但與天然SJL相比仍存在一定的差距[11]。影響SJL產(chǎn)量和活性的因素很多，如培養(yǎng)條件、外源基因自身結(jié)構(gòu)特性、蛋白酶降解、糖基化及純化工藝等。因此，今后還要對發(fā)酵條件和純化工藝作進(jìn)一步研究，必要時(shí)還可對菌種進(jìn)行改良。

i-型(i-type)溶菌酶作為溶菌酶家族的一個(gè)新成員，近年來得到了廣泛的研究[12]。該重組海參溶菌酶畢赤酵母工程菌的成功構(gòu)建為進(jìn)一步研究海洋生物新型溶菌酶的生物活性及其工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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