酶解產(chǎn)物人參皂苷Rh2、Rh3的二氯甲烷層析分離

史 承， 吳 警， 富 瑤 瑤， 魚 紅 閃， 金 風(fēng) 燮

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

人參中的主要有效成分是人參皂苷[1]，一些稀有人參皂苷具有極高的生理活性。其中人參皂苷Rh2具有良好的抑制腫瘤細(xì)胞、誘導(dǎo)分化癌細(xì)胞、具有抗浸潤和抗轉(zhuǎn)移、增加免疫力、化學(xué)抗癌藥物的增效減毒、抗致癌物質(zhì)的性能，是配合放療、化療增效減毒的首選藥物。人參皂苷Rh3具有高抗癌作用，還可以誘導(dǎo)不同的HL-60細(xì)胞，使之成為形態(tài)學(xué)上的和功能上的粒細(xì)胞[2]。

在生產(chǎn)紅參或酶轉(zhuǎn)化處理人參二醇類皂苷 PPD 的過程中，人參二醇類皂苷20位和3位碳上的糖基被水解，生成 20(S,R)-Rg3和20(S,R)-Rh2等皂苷；其中Rg3皂苷20位碳上的—OH與22位碳上—H脫水生成反式的20、22碳烯Rg5和順式的20、22碳烯Rg5即Rk1；同樣Rh2皂苷20位碳上的—OH與22 位碳上—H容易脫水生成反式的20、22碳烯Rh3和順式的20、22碳烯Rh3即 Rk2。

但是這些衍生物在傳統(tǒng)紅參中的含量甚微[1]。本實(shí)驗(yàn)室成功地實(shí)現(xiàn)酶轉(zhuǎn)化法從人參二醇類皂苷生產(chǎn) Rh2等稀有皂苷；趙立亞等[3]應(yīng)用硅膠柱法分離人參二醇類皂苷，通過酶法改變?nèi)藚⒍荚碥仗腔?，成功得到稀有人參皂苷Rh2。呂迪等[4]應(yīng)用氯仿-甲醇作為洗脫液在常壓下對人參皂苷Rh2和Rh3混合物進(jìn)行硅膠柱分離，成功得到稀有人參皂苷Rh3。采用氯仿-甲醇作為硅膠柱分離的洗脫液，由于氯仿毒性較大、危險(xiǎn)性高、價(jià)格較貴、不容易購買，因此嘗試用二氯甲烷-甲醇作為硅膠柱的洗脫液對人參皂苷Rh2和Rh3進(jìn)行分離。其中20(S,R)-Rh2和順、反Rh3結(jié)構(gòu)如圖1所示。

1 材料與方法

1.1 材 料

人參皂苷Rh2、Rh3標(biāo)準(zhǔn)品和人參皂苷混合皂苷(Rh2、Rh3等)由本實(shí)驗(yàn)室提供；薄層層析板Silica gel 60-F254，德國Merck公司；硅膠，青島海洋化工廠；高效液相色譜儀Waters 2695-2996。

1.2 方 法

1.2.1 二氯甲烷-甲醇作為洗脫劑層析分離人參皂苷Rh2、Rh3

人參皂苷Rh2、Rh3的分離選用常壓硅膠柱層析法，采用二氯甲烷-甲醇作洗脫液分離。

制樣品膠：取待分離樣品10 g用盡少量的工業(yè)甲醇充分溶解。稱量80～100目硅膠75 g，將其加入到溶于甲醇的樣品液中，60～70 ℃邊加熱邊攪拌均勻，待其完全蒸干，制成樣品膠。

裝硅膠柱：脫脂棉鋪于玻璃硅膠柱底部，取300～400目硅膠600 g作為分離膠，用漏斗慢慢裝入到玻璃柱內(nèi)，使其鋪放均勻，并于下面抽真空使其緊實(shí)后，加入一層2～3 cm高的80～100目硅膠，起緩沖作用，再于其上加入已制好的樣品膠，最后于最上方鋪脫脂棉，待用。

梯度洗脫：柱裝好后，首先用二氯甲烷通柱，柱子打通后，以V(二氯甲烷)∶V(甲醇)= 7∶0.1～7∶0.3為流動相進(jìn)行梯度洗脫。此過程由薄層層析檢測監(jiān)控，調(diào)整洗脫液中二氯甲烷與甲醇的比例，根據(jù)薄層層析檢測結(jié)果收集洗脫液，每瓶收集250 mL，直至人參皂苷Rh2和Rh3被完全洗下。最后用純甲醇洗脫，點(diǎn)板至樣品全部洗下。

1.2.2 薄層層析法法(TLC)

用刻度毛細(xì)管吸取標(biāo)準(zhǔn)品及樣品，點(diǎn)樣于薄層層析板上。將點(diǎn)好樣品的薄層板放入層析缸的展開劑中，展開劑配比為V(二氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶1.8∶0.5，10%硫酸加熱顯色。

1.2.3 高效液相色譜法(HPLC)[5,6]

色譜儀，美國Waters 2695儀器；檢測器，Photodiode Array Detector Waters 2996儀器；色譜柱，Hypersil ODS2 5 μm (4.6 mm×200 mm)；工作溫度，20 ℃；柱溫，35 ℃；體積流量，1.0 mL/min；樣品進(jìn)樣量，10 μL；檢測波長，203 nm；流動相，乙腈-水。

樣品溶液的制備：精密稱取人參皂苷Rh2、Rh3各1 mg，用色譜醇定容至1 mL，搖勻，待用。

人參皂苷Rh2、Rh3流動相洗脫條件如表1、2所示。

表1 人參皂苷Rh2流動相梯度條件表Tab.1 Gradient Parameter of HPLC Mobile Phase

表2 人參皂苷Rh3流動相梯度條件表Tab.2 Gradient Parameter of HPLC Mobile Phase

2 結(jié)果與討論

2.1 二氯甲烷-甲醇作洗脫劑分離

人參皂苷Rh2和Rh3的混合物用常壓硅膠柱分離。10 g 樣品上硅膠柱，分別采用V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=7∶0.10、7∶0.13、7∶0.15、7∶0.18、7∶0.2、7∶0.3漸變梯度進(jìn)行洗脫。當(dāng)梯度達(dá)到7∶0.3時(shí)，人參皂苷Rh2和Rh3先后流出，第60瓶開始有Rh3單點(diǎn)洗下，第68瓶到第86瓶為Rh2和Rh3的混合物，從87瓶開始有Rh2單點(diǎn)出現(xiàn)直到112瓶。部分TLC跟蹤結(jié)果如圖2所示。

Rh3，人參皂苷 Rh3標(biāo)準(zhǔn)品；Rh2，人參皂苷Rh2標(biāo)準(zhǔn)品；樣，樣品；54～114，瓶號圖2 硅膠柱法分離人參皂苷Rh2和Rh3的TLC檢測Fig.2 Ginsenoside Rh2 and Rh3 separated by silica gel column on TLC

將洗脫出來的人參皂苷合并收集，濃縮干燥，收集稱重，各部分皂苷質(zhì)量見表3。

表3 人參皂苷分離收集表Tab.3 The collection of ginsenoside separation

得到較純的人參皂苷Rh2組分的質(zhì)量為2.47 g，得率為24.7%；較純的人參皂苷Rh3組分的質(zhì)量為0.41 g，得率為4.1%；人參皂苷Rh2和Rh3的混合部分的質(zhì)量為0.88 g，得率為8.8%；為了測定分離出人參皂苷Rh2和Rh3的純度，采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測。

2.2 高效液相色譜檢測樣品純度

利用高效液相色譜，對所分離出的人參皂苷Rh2和Rh3進(jìn)行純度檢測。

稱取l mg分離出的人參皂苷Rh2，溶于l mL色譜甲醇中，HPLC檢測結(jié)果如圖3所示。

圖3 人參皂苷Rh2高效液相色譜圖Fig.3 Ginsenoside Rh2 on HPLC

參照文獻(xiàn)[7]，從高效色譜圖可以看出，22.390 min出現(xiàn)的峰為人參皂苷20(S)-Rh2，23.039 min出現(xiàn)的峰為人參皂苷20(R)-Rh2，其純度可達(dá)到85%以上。

稱取l mg分離出的人參皂苷Rh3，溶于l mL色譜甲醇中，HPLC檢測結(jié)果如圖4所示。

圖4 人參皂苷Rh3高效液相色譜圖Fig.4 Ginsenoside Rh3 on HPLC

參照文獻(xiàn)[7]，從高效色譜圖可以看出，31.313 min出現(xiàn)的峰為人參皂苷順式的20、22碳烯Rh3，31.960 min出現(xiàn)的峰為人參皂苷反式的20、22碳烯Rh3，其純度可達(dá)到95%以上。

3 結(jié) 論

采用硅膠柱層析法，采用二氯甲烷-甲醇洗脫液分離得到的單組分人參皂苷Rh20.41 g，單組分人參皂苷Rh32.47 g，通過HPLC檢測，22.390 min出現(xiàn)的峰為人參皂苷20(S)-Rh2，23.039 min出現(xiàn)的峰為人參皂苷20(R)-Rh2，Rh2純度可達(dá)到85%以上。31.313 min出現(xiàn)的峰為順式的20、22碳烯人參皂苷Rh3即Rk2，31.960 min出現(xiàn)的峰為反式的20、22碳烯人參皂苷Rh3，純度可達(dá)到95%。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用二氯甲烷作為洗脫液成功分離出單體人參皂苷Rh2和Rh3，從高效液相色譜圖中看出，經(jīng)硅膠柱層析法分離得到的皂苷分別為人參皂苷20(R,S)-Rh2和順、反式20、22碳烯人參皂苷Rh3，本實(shí)驗(yàn)的研究為實(shí)現(xiàn)人參皂苷產(chǎn)業(yè)化提供了一定依據(jù)。

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