單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)在環(huán)境毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

汪承潤(rùn)，王臣，姜傳軍，王昊，程濤，陳敬宇，胡玲玲，陳芬芬

（淮南師范學(xué)院 生命科學(xué)系，安徽 淮南 232001）

單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)在環(huán)境毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

汪承潤(rùn)，王臣，姜傳軍，王昊，程濤，陳敬宇，胡玲玲，陳芬芬

（淮南師范學(xué)院 生命科學(xué)系，安徽 淮南 232001）

介紹了植物細(xì)胞核DNA損傷的單細(xì)胞凝膠電泳的檢測(cè)方法，依次包括載玻片的預(yù)處理和編號(hào)、細(xì)胞核的分離、包埋、解旋、電泳、中和、脫水、染色、攝像及其結(jié)果的軟件分析等過(guò)程。并應(yīng)用該方法檢測(cè)了暴露于鎘離子污染后的蠶豆幼苗葉片組織細(xì)胞核的DNA損傷程度。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)單、易行，適合在環(huán)境毒理學(xué)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科研中推廣和應(yīng)用。

單細(xì)胞凝膠電泳（SCGE）；環(huán)境毒理學(xué)；DNA損傷；遺傳毒性；實(shí)驗(yàn)教學(xué)

1984年，Ostling等[1]首次提出了單細(xì)胞凝膠電泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)技術(shù)，并利用該技術(shù)在中性條件下檢測(cè)γ射線引起的DNA雙鏈斷裂。因其細(xì)胞拖尾形狀頗似彗星，又稱彗星試驗(yàn)(Comet Assay)。1988年，Singh等[2]在此基礎(chǔ)上加以改進(jìn)并建立了堿性單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)，不僅可以檢測(cè)DNA單、雙鏈斷裂，還可用來(lái)檢測(cè)堿性不穩(wěn)定位點(diǎn)、DNA交聯(lián)和不完全切除修復(fù)位點(diǎn)等，因此大大提高了SCGE檢測(cè)的敏感性。這是一種測(cè)定和研究單個(gè)細(xì)胞DNA鏈斷裂的新技術(shù)，與傳統(tǒng)的DNA損傷檢測(cè)方法相比，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、樣品量少、無(wú)需放射性標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛，應(yīng)用于人和動(dòng)物細(xì)胞核DNA損傷和修復(fù)的研究[3-9]。雖經(jīng)多次改良，但最常用的還是堿性SCGE方法。近年來(lái)，SCGE技術(shù)也逐步推廣到真核單細(xì)胞微生物和植物細(xì)胞核DNA損傷的研究[10-15]。然而，由于植物細(xì)胞的特殊性和細(xì)胞核取材方法的限制，國(guó)內(nèi)學(xué)者在該方面開(kāi)展的研究工作報(bào)道較少。深感遺憾的是，多數(shù)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)教材只介紹以動(dòng)物組織細(xì)胞或培養(yǎng)的動(dòng)物或人體單細(xì)胞為研究對(duì)象的SCGE方法，而關(guān)于植物細(xì)胞SCGE實(shí)驗(yàn)方法的詳細(xì)介紹未見(jiàn)報(bào)道?，F(xiàn)將本課題組在教學(xué)和科研過(guò)程中改進(jìn)的SCGE操作方法和注意事項(xiàng)介紹如下，供同行借鑒和參考。

1、植物組織細(xì)胞核SCGE操作流程

1.1 載玻片的預(yù)處理

在100 mL燒杯中配制適量1%（m/v）正常熔點(diǎn)瓊脂糖(100 mL比較適宜)，加熱完全溶解后置于50-60℃水浴鍋中恒溫保存。手持預(yù)冷后的載玻片的磨砂端，將載玻片立即浸沒(méi)其中（非磨砂載玻片浸沒(méi)于液面下部分約占玻片長(zhǎng)度2/3左右），輕輕擺動(dòng)玻片，2-3秒鐘后取出玻片，垂直放置 （如圖1-2所示），室溫干燥過(guò)夜。

圖1

圖2

圖3

1.2 載玻片的編號(hào)

由于堿性電泳液腐蝕性極高（pH＞13），用記號(hào)筆等工具標(biāo)記組別又極易脫落。本課題組成員研究發(fā)現(xiàn)，若用解剖針等鋒利工具在玻片的磨砂端或非磨砂玻片的手持端刻下處理組組別，如A-1，A-2…（如圖3所示），則可徹底解決電泳過(guò)程中標(biāo)記脫落的問(wèn)題。

1.3 細(xì)胞核的分離

取新鮮葉片，立即平鋪于塑料培養(yǎng)皿中（冰盒內(nèi)），在葉片上滴加 1ml預(yù)冷的細(xì)胞核提取液（50mM Tris-HCl，10mM Na2EDTA，100 mM NaCl，0.1%TritonX-100，pH 7.4）濕潤(rùn)葉片。在暗室內(nèi)的紅光或黃光下，用鑷子夾住葉片的一側(cè)邊緣，用刀片沿同一方向輕輕切劃葉片成細(xì)絲狀 （如圖4所示），再加入1-2ml核提取液，用刀片將葉片碎片集中于提取液中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，以便細(xì)胞核脫落于液體中。若分離后的液體顏色較淺，則可繼續(xù)切劃第二個(gè)葉片。然后用孔徑50μm的尼龍布過(guò)濾核提取液，在4℃和1000rpm條件下離心5 min，棄上清，加入100μL核提取液懸浮細(xì)胞核，冰盒內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

補(bǔ)充兩個(gè)問(wèn)題：（1）植物根尖分生組織細(xì)胞核也可應(yīng)用上述方法進(jìn)行分離；根尖若經(jīng)冰凍保存，則可用玻璃棒輕輕擠壓即可釋放出細(xì)胞核，后續(xù)步驟同上。（2）野外采集的樣品若需長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)輸，則必須冰凍和避光保存。

圖4

圖5

圖6

1.4 細(xì)胞核的包埋：

取上述細(xì)胞核懸液，按照1:3的比例與1.5% (m/v)低熔點(diǎn)瓊脂糖(用去離子水配制)輕輕混勻（也可根據(jù)細(xì)胞核密度調(diào)整該比例），取100μL該混合液輕輕滴加于預(yù)處理后的載玻片上,覆以蓋玻片，以便細(xì)胞核均勻分布（如圖5所示）。然后將玻片排列于濕盒內(nèi)（如圖6所示），用黑色塑料袋包被，轉(zhuǎn)移至4℃冰箱，靜置10 min，以便細(xì)胞核與低熔點(diǎn)瓊脂糖冷凝。冷凝后的膠板上可以再鋪0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖作為第二層膠，也可以省略，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 解旋與電泳：

將上述冷凝后的膠板去掉蓋玻片，放置于水平電泳槽，含細(xì)胞核的一端朝向正極（如圖7所示），在新配制的 4℃預(yù)冷的堿性電泳液（200mM Na2EDTA、10M NaOH，pH＞13）中浸沒(méi)20 min左右，促使DNA充分解旋（此過(guò)程也具有加速RNA降解的作用）。在細(xì)胞核中，DNA附著于核基質(zhì)上，在強(qiáng)堿性溶液作用下，超螺旋DNA結(jié)構(gòu)解旋變?yōu)樗沙跔?斷鏈和堿性易變性區(qū)段則變成斷片，并暴露出負(fù)電荷基團(tuán)。在電場(chǎng)力作用下，松動(dòng)的DNA鏈以及斷片向陽(yáng)極遷移，從而形成外觀類似彗星的拖尾。一般來(lái)說(shuō)，DNA斷片愈多，彗尾就愈長(zhǎng)，核DNA的損壞程度就愈大。

解旋結(jié)束后，通過(guò)調(diào)節(jié)電泳液液面高度控制電泳條件（25V，300mA）。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，摸索空白對(duì)照組細(xì)胞核彗尾長(zhǎng)度較小，而污染物處理組彗尾長(zhǎng)度（可能）發(fā)生變化的電泳時(shí)間，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)參數(shù)。

圖7

圖8

1.6 膠板的中和與染色

電泳結(jié)束，將膠板轉(zhuǎn)移并排列于塑料盤或相應(yīng)容器內(nèi)（如圖8所示），添加中和液（0.4M Tris-HCl, pH 7.5），浸沒(méi)膠板。15 min后小心傾除中和液，代之以無(wú)水乙醇浸沒(méi)膠板。10-15min后回收乙醇，取出膠板，室溫下晾干。干燥后的膠板可在4℃環(huán)境下保存數(shù)月。染色前將膠板浸沒(méi)于去離子水4-5分鐘，取出后傾斜膠板，并用吸水紙小心吸去殘留水跡。每張膠板滴加20μL適宜濃度的熒光染色劑(吖啶橙、溴化乙錠（EB）、碘化丙啶等)，其中EB濃度稀釋至0.1%（m/v）以下，顏色呈微紅色即可。用干凈載波片輕輕推平熒光染色劑，使之均勻分布，避光染色5分鐘后，手持膠板磨砂端，將膠板另端浸沒(méi)于盛有去離子水的燒杯中，輕輕擺動(dòng)數(shù)秒，洗滌殘留染色液，再用吸水紙小心吸去殘留水跡，加蓋玻片，即可在熒光顯微鏡下觀察并拍攝彗星細(xì)胞圖片。上述第3-5步驟均要求在紅光或黃光下操作完成。

1.7 圖像的采集與分析

將帶有蓋玻片的膠板固定于載物臺(tái)上,選擇綠光激發(fā)波長(zhǎng)590 nm激發(fā)視野,應(yīng)用10×目鏡和10×物鏡,將細(xì)胞核放大100倍即可觀察到清晰圖像（也可增加放大倍數(shù)）。通常每個(gè)劑量組至少具備3個(gè)平行，每個(gè)平行2張玻片，每張玻片至少隨機(jī)觀察和拍攝25個(gè)細(xì)胞核。若樣品中細(xì)胞核密度過(guò)低，或處理過(guò)程中細(xì)胞核裂解過(guò)度、膠脫落等均可導(dǎo)致可觀察到的細(xì)胞核數(shù)量不足，需改進(jìn)和重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

彗星圖像分析方法一般包括:（1）目鏡測(cè)微尺測(cè)量法；（2）兩腳規(guī)測(cè)量法；（3）圖像分析軟件(如Lucia、Auto Gentox、CometScore等分析軟件)分析法。每個(gè)細(xì)胞核DNA損傷的測(cè)定指標(biāo)一般包括：（1）尾長(zhǎng)（Tai length）；(2）尾部DNA含量（Tai DNA %）；（3）尾矩(Tail moment)，即尾長(zhǎng)與尾部DNA百分含量的乘積。有時(shí)還包括核直徑、尾部光密度、總光密度和彗星總長(zhǎng)度、尾慣量等指標(biāo)，通常選擇尾長(zhǎng)和尾矩作為分析指標(biāo)。同時(shí)尚需測(cè)定DNA拖尾率，即彗星細(xì)胞隨機(jī)出現(xiàn)的頻率（%）。

2、在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

2.1 受試植物幼苗的培養(yǎng)與染毒處理

蠶豆種子（Vicia faba L.）為淮南當(dāng)?shù)亓?xí)見(jiàn)品種（青皮豆）。種子用0.1%(m/v)次氯酸鈉溶液浸沒(méi)10min后，自來(lái)水充分漂洗，室溫下浸泡24h后再轉(zhuǎn)移至23°C培養(yǎng)箱內(nèi)催芽，待根尖延伸至2cm左右時(shí)開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。篩選根尖長(zhǎng)短基本一致的幼苗，轉(zhuǎn)移至盛有Hoagland營(yíng)養(yǎng)液[16]的水槽中懸浮培養(yǎng)，每個(gè)水槽培養(yǎng)10個(gè)幼苗，1天后分別更換成用該營(yíng)養(yǎng)液配制的 Cd2+梯度溶液 （0、4、8、12 μM，pH 5.3?5.5）。水槽放置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)條件為：白天15h，23°C，光照強(qiáng)度200 μmol m-2sec-1；夜晚9h，19°C，相對(duì)濕度均在75-80%之間。每天上、下午分別曝氣4h，兩天更換一次染毒溶液，6天后取葉片或根尖分離細(xì)胞核。

2.2 SCGE過(guò)程

載玻片的預(yù)處理、細(xì)胞核的分離、包埋、解旋、電泳等過(guò)程同上所述。

2.3 SCGE結(jié)果的分析方法

染色后的膠板在熒光顯微鏡下放大100倍觀察并拍攝圖片，結(jié)果如圖9所示。本課題組一直應(yīng)用CometScore分析軟件分析SCGE電泳圖片，方法和步驟如下：首先應(yīng)用Photoshop軟件從“模式”中將原圖片的彩色轉(zhuǎn)換為“灰度”，文件以BMP和OS/2格式保存?zhèn)溆?。再通過(guò)CometScore軟件打開(kāi)并分析上述圖片，得到一系列關(guān)于Tai length、Tai DNA、Tail moment等數(shù)值。最后應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（分析過(guò)程從略）。

本實(shí)驗(yàn)的分析結(jié)果表明，梯度Cd2+溶液誘導(dǎo)了蠶豆幼苗葉片組織細(xì)胞核DNA的損傷，并且呈現(xiàn)一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系（r2=0.805，p＜0.05）。

由此可見(jiàn)，應(yīng)用上述實(shí)驗(yàn)方法即可容易檢測(cè)到環(huán)境污染物作用下的植物組織細(xì)胞核的DNA損傷程度，與對(duì)照組比較即可初步診斷Cd2+對(duì)植物細(xì)胞核的遺傳毒性的大小。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程的訓(xùn)練，不僅要讓學(xué)生掌握植物細(xì)胞核SCGE的實(shí)驗(yàn)技能，而且要引導(dǎo)學(xué)生把這種方法應(yīng)用于環(huán)境污染物的生態(tài)毒性的診斷與評(píng)價(jià)。

圖9 蠶豆葉片組織細(xì)胞核的單細(xì)胞凝膠電泳圖片（100×）

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G642.423

A

1009-9530（2010）05-0084-03

2010-07-10

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20877032）；污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（PCRRF08011）

汪承潤(rùn)(1966-)，男，安徽金寨人，淮南師范學(xué)院生命科學(xué)系副教授，博士，主要從事環(huán)境毒理學(xué)研究。