羊棲菜受精卵/胚胎低溫保存后的成活和發(fā)育

張玉榮, 逄少軍

（1. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所, 浙江 舟山 316100; 2. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071）

ZHANG Yu-rong1, PANG Shao-jun2

（1. Marine Fishery Institute of Zhejiang Province, Zhoushan, 316100, China; 2. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China）

羊棲菜受精卵/胚胎低溫保存后的成活和發(fā)育

張玉榮1, 逄少軍2

（1. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所, 浙江 舟山 316100; 2. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071）

通過(guò)實(shí)驗(yàn)生物學(xué)方法, 探討了采用5℃條件保存的多細(xì)胞和兩細(xì)胞狀態(tài)羊棲菜（Hizikia fusiformis）受精卵的成活和發(fā)育情況。結(jié)果表明, 相同保存和恢復(fù)培養(yǎng)條件下的羊棲菜受精卵, 兩細(xì)胞狀態(tài)的死亡率明顯高于多細(xì)胞狀態(tài)。5℃條件保存60 h多細(xì)胞狀態(tài)羊棲菜受精卵的死亡率均在10%左右, 同樣條件保存 48 h 兩細(xì)胞狀態(tài)受精卵死亡率高達(dá) 75%。在異地運(yùn)輸羊棲菜受精卵或者胚胎完成苗種培育的過(guò)程中, 應(yīng)當(dāng)同時(shí)考慮溫度、運(yùn)輸時(shí)間以及受精卵的發(fā)育階段等多個(gè)因素, 才能取得比較好的實(shí)際效果。

羊棲菜（Hizikia fusiformis）; 受精卵; 低溫保存; 成活和發(fā)育

羊棲菜（Hizikia fusiformis）隸屬褐藻門(mén), 墨角藻目, 馬尾藻科, 是暖溫帶-亞熱帶性海藻, 在我國(guó)沿海北自遼東半島南到廣東雷州半島以及在日本和朝鮮沿岸均有廣泛分布[1]。羊棲菜藻體肥厚多汁, 營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味好, 既能食用又能藥用, 是中國(guó)、日本、朝鮮和韓國(guó)沿海人民的傳統(tǒng)美食和中草藥, 被推崇為海洋蔬菜和健康長(zhǎng)壽品[2～4]。我國(guó)古代《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》中對(duì)羊棲菜藥用價(jià)值都有記載。羊棲菜人工栽培所使用的苗種在早期基本來(lái)自潮間帶, 隨著羊棲菜全人工苗種技術(shù)的誕生和日益成熟,利用雌雄異體親本同步受精技術(shù)來(lái)生產(chǎn)種苗在生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用[5～8]。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中, 為規(guī)避由于高水溫對(duì)幼苗的不利影響[9], 有時(shí)需要異地運(yùn)輸種菜完成苗種培育或者通過(guò)低溫保存的方式異地運(yùn)輸受精卵和胚胎。目前人們對(duì)羊棲菜受精卵或者胚胎在低溫條件下的存活和發(fā)育規(guī)律所知甚少, 而低溫保存海藻種質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)在多數(shù)經(jīng)濟(jì)海藻中得到廣泛的應(yīng)用[10]。 本項(xiàng)研究的主要目的就是探討羊棲菜在不同發(fā)育階段, 經(jīng)過(guò)不同時(shí)間的低溫處理后的存活和生長(zhǎng)發(fā)育情況, 旨在為改善羊棲菜全人工苗種工藝提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 羊棲菜親本

羊棲菜為2008年5月初采自浙江省南麂島, 利用保溫盒空運(yùn)至青島, 雌雄各20枝、每枝長(zhǎng)約20 cm,置于中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋生物種質(zhì)庫(kù)種質(zhì)培養(yǎng)室80 L （65 cm×45 cm×35 cm） PP水箱恢復(fù)培養(yǎng),水溫 20℃, 培養(yǎng)的最高自然太陽(yáng)光光強(qiáng) 400 μmol/（m2?s）[11～13]。材料培養(yǎng)期間, 每天流水換水一遍,并添加NaNO3和KH2PO4, 添加的終濃度達(dá)到10 g/m3和1 g/m3水體。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng), 卵子和精子排放后, 對(duì)不同時(shí)間段的受精卵進(jìn)行低溫5℃保存。本實(shí)驗(yàn)共使用了兩批多細(xì)胞和兩細(xì)胞狀態(tài)受精卵。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

羊棲菜卵子在受精后的16 h開(kāi)始從生殖托自然脫落, 脫落的受精卵都處于多細(xì)胞的胚胎階段。從實(shí)際操作角度, 運(yùn)輸脫落的胚胎比運(yùn)輸尚黏附在生殖托上的受精卵要容易得多。但是為了全面了解不同階段的存活和生長(zhǎng)情況, 采取了 2個(gè)發(fā)育階段的材料, 即受精后8 h和24 h的2細(xì)胞和多細(xì)胞材料。

1.2.1 多細(xì)胞狀態(tài)5℃保存

受精24 h的羊棲菜受精卵, 經(jīng)鏡檢基本發(fā)育到多細(xì)胞的胚胎狀態(tài)。待大部分自然脫落后, 取適量放入200 mL燒杯, 加適量消毒PES（Provasli Enriched Water）[14], 放入5℃冰箱保存。放置0, 6, 12, 24, 30, 36,48, 54, 60, 72, 78, 96 h 后, 分別取適量放入9 cm培養(yǎng)皿中, 在倒置顯微鏡下檢查和統(tǒng)計(jì)假根發(fā)生率和胚胎的死亡率。之后, 加入適量的PES, 在21℃光照培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng), 光強(qiáng) 190 μmol/（m2?s）。分別統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)48, 96, 144 h后的死亡率。除特殊說(shuō)明, 實(shí)驗(yàn)中均用光度計(jì)（SAMPO-LX1330A）記錄光照強(qiáng)度, 每48 h更換培養(yǎng)基。

1.2.2 兩細(xì)胞狀態(tài)5℃保存

受精8 h的羊棲菜受精卵, 經(jīng)鏡檢多數(shù)為兩細(xì)胞狀態(tài)。取適量放入200 mL燒杯, 加適量PES, 5℃冰箱保存。保存0, 24, 48, 96 h和 120 h后, 分別取出并統(tǒng)計(jì)死亡率和假根產(chǎn)生率。之后加適量PES, 21℃光照培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng), 光強(qiáng) 190 μmol /（m2?s）。統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)48 h后的存活和死亡率。

2 結(jié)果

2.1 多細(xì)胞狀態(tài)5℃保存

2.1.1 多細(xì)胞狀態(tài) 5℃保存, 取出時(shí)假根發(fā)生的比例

5℃條件保存多細(xì)胞狀態(tài)羊棲菜胚胎（受精 24 h后）在48 h以?xún)?nèi), 隨著時(shí)間的延長(zhǎng), 個(gè)體發(fā)生假根的比例從10%上升到80%; 當(dāng)保存的時(shí)間超過(guò)50 h后,假根的發(fā)生便停止 （圖 1）。意味著 50 h 是一個(gè)分界點(diǎn)。

離任審計(jì)指的是審查、核實(shí)地勘單位法定代表人在任職期間內(nèi)所需要承擔(dān)的經(jīng)濟(jì)責(zé)任，并對(duì)經(jīng)濟(jì)責(zé)任展開(kāi)一定的分析，此舉有助于規(guī)范并引導(dǎo)相關(guān)人員的經(jīng)營(yíng)思想與經(jīng)營(yíng)活動(dòng)，因此離任審計(jì)工作對(duì)地質(zhì)勘查單位而言意義非凡。然而現(xiàn)如今我國(guó)有關(guān)地質(zhì)勘查單位的離任審計(jì)工作存在許多尚未解決的問(wèn)題，嚴(yán)重滯緩相關(guān)單位的工作，有效地發(fā)現(xiàn)并解決離任審計(jì)工作任務(wù)已成為當(dāng)務(wù)之急。

圖1 在5℃保存不同時(shí)間的多細(xì)胞狀態(tài)羊棲菜胚胎（受精24 h后）產(chǎn)生假根的比率平均值變化（n=5）Fig. 1 Percentage of 24-h old multi-cellular embryos ofHizikia fufiformisthat developed rhizoids after being stored at 5℃for various hours. Values are means ± standard deviations （n= 5）

2.1.2 多細(xì)胞狀態(tài) 5℃保存, 取出放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)時(shí)的死亡率

5℃條件保存多細(xì)胞狀態(tài)羊棲菜胚胎（受精 24 h后）的死亡率, 96 h內(nèi)均低于5%, 在保存了120 h后死亡率迅速增加, 但是在保存了216 h的死亡率仍然低于 45%（圖 2）。

圖2 在5℃保存不同時(shí)間的多細(xì)胞狀態(tài)羊棲菜受精卵（受精24 h后）的死亡率平均值（n=5）Fig. 2 Mortality of 24-h old multi-cellular embryos ofHizikia fufiformisthat were stored at 5℃ for various hours. Values are means ± standard deviations（n= 5）

2.1.3 多細(xì)胞狀態(tài)5℃保存, 恢復(fù)培養(yǎng)后的死亡率

5℃條件保存多細(xì)胞狀態(tài)的羊棲菜胚胎（受精 24 h后）, 經(jīng)過(guò)48 h恢復(fù)培養(yǎng)后, 保存60 h以?xún)?nèi)的羊棲菜受精卵的死亡率均在10%左右（圖3）, 而且細(xì)胞發(fā)育良好（圖4）, 72 h后死亡率迅速增加, 96 h為80%。當(dāng)保存時(shí)間達(dá)到120 h時(shí), 沒(méi)有胚胎能夠恢復(fù), 死亡率達(dá)到100%。

2.2 兩細(xì)胞狀態(tài)5℃保存

2.2.1 兩細(xì)胞狀態(tài) 5℃保存, 取出放入培養(yǎng)箱時(shí)的假根率和死亡率

圖3 在5℃保存不同時(shí)間的多細(xì)胞狀態(tài)羊棲菜胚胎（受精24 h后）, 取出后恢復(fù)培養(yǎng)48 h后的死亡率平均值（n= 5）Fig. 3 Mortality of 24-h old multi-cellular embryos ofHizikia fufiformisthat were stored at 5℃ for various hours followed by a 48-h recovery culture period at standard culture conditions. Values are means ± standard deviations （n= 5）

圖4 受精24 h后多細(xì)胞狀態(tài)羊棲菜胚胎（A）和在5℃保存24 h后再在標(biāo)準(zhǔn)條件下（21℃, 190 μmol /（m2?s）） 恢復(fù)培養(yǎng)48 h后（B）, 其存活和形成長(zhǎng)的假根狀況（標(biāo)尺是100 μm）Fig. 4 Embryos ofHizikia fusiformisat 24 h post-fertilization （A）, and the embryos stored at 5℃ for 24h followed by a 48 h recovery in standard culture conditions （B）

3 討論

處在不同發(fā)育階段的羊棲菜受精卵進(jìn)行低溫保存后的存活和生長(zhǎng)迥然不同：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 經(jīng)過(guò)48 h恢復(fù)培養(yǎng)后, 5℃保存60 h的多細(xì)胞狀態(tài)羊棲菜受精卵的死亡率只有 10%, 而兩細(xì)胞狀態(tài)羊棲菜受精卵保存48 h后死亡率則為75%。因此在相同低溫保存和常溫恢復(fù)培養(yǎng)條件下, 羊棲菜多細(xì)胞狀態(tài)的胚胎存活率明顯高于兩細(xì)胞受精卵階段。在實(shí)際操作過(guò)程中, 受精卵的實(shí)際發(fā)育階段是決定后期存活率的關(guān)鍵因素。

表1 在5℃條件下保存的兩細(xì)胞受精卵分別在0, 24, 48,72 h后取出, 再恢復(fù)性培養(yǎng)48 h的死亡率和產(chǎn)生假根的比率（n=6）Tab. 1 Mortality and rates of rhizoid development of the 2-celled zygotes after 0, 24, 48 and 72-h storage at 5℃ and followed by a 48-h recovery under standard culture conditions （n= 6）

圖5 5℃保存的2個(gè)細(xì)胞的受精卵在保存120 h后取出,出現(xiàn)的單細(xì)胞、兩細(xì)胞和三細(xì)胞受精卵產(chǎn)生長(zhǎng)假根的情況（箭頭所示, 標(biāo)尺為100 μm）Fig. 5 Rhizoid development （arrows） from one-, two-, or three-celled zygotes after stored at 5℃ for 120 h（bar equals to 100 μm）

低溫保存后產(chǎn)生假根的時(shí)間問(wèn)題：在羊棲菜苗種實(shí)際培育過(guò)程中, 產(chǎn)生假根的時(shí)間十分關(guān)鍵, 附苗時(shí)間必須根據(jù)產(chǎn)生假根時(shí)間確定。附苗過(guò)遲, 容易導(dǎo)致后期脫苗[15,16]。采用低溫保存受精卵也是如此。從本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看, 無(wú)論是2細(xì)胞的受精卵還是多細(xì)胞胚胎采用低溫保存都不能阻止假根的形成,而只能延緩假根形成和生長(zhǎng)速度。這個(gè)特點(diǎn)對(duì)異地運(yùn)輸受精卵或者胚胎完成采苗是個(gè)困難, 要求必須在假根形成之前完成運(yùn)輸和布苗。至于詳細(xì)的假根發(fā)生和長(zhǎng)度定量測(cè)定需要將來(lái)更加細(xì)致的研究闡釋。對(duì)于異地運(yùn)輸受精卵或者胚胎而言, 掌握時(shí)間的長(zhǎng)短和溫度的控制同樣重要。在動(dòng)物水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中, 利用充氧塑料袋運(yùn)輸魚(yú)苗或者貝類(lèi)幼體已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用, 而在藻類(lèi)苗種培育過(guò)程中, 尚沒(méi)有先例。作者在2008年, 利用低溫運(yùn)輸受精卵的方法完成了大規(guī)模苗種采集, 并且獲得了成功。本文的研究結(jié)果, 將對(duì)馬尾藻屬海藻的苗種培育技術(shù)革新提供重要的技術(shù)支持。

致謝:作者感謝實(shí)驗(yàn)室技術(shù)員高素芹, 宋春華, 張京浦等同事的幫助。

[1] 曾呈奎. 海帶養(yǎng)殖學(xué)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1962.

[2] 張展, 劉建國(guó), 劉吉東. 羊棲菜的研究綜述[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2002, 23（3）: 68-74.

[3] Hwang E K, Park C S, Baek J M. Artificial seed production and cultivation of the edible brown alga,Sargassum fulvellum（Turner） C. Agardh: developing a new species for seaweed cultivation in Korea[J]. J App Phycol, 2006, 18: 251-257.

[4] Kirihara S, Fujikawa Y, Notoya M. Axenic tissue culture ofSargassum confusumC., Agardh （Phaeophyta）as a source of seeds for artificial marine forests[J]. J Mar Biotechno, 2007, 5: 142-146.

[5] 孫建璋, 方家仲, 朱植豐.羊棲菜Sagassum fusifome（Harv.）Setch 繁殖生物學(xué)的初步研究[J].浙江水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào), 15（4）: 243-249.

[6] 逄少軍, 費(fèi)修綆, 肖天, 等. 羊棲菜生殖托的離體培養(yǎng)的初步研究[J]. 海洋科學(xué), 2000, 24（3）: 1-3.

[7] 逄少軍, 費(fèi)修綆, 肖天, 等. 通過(guò)控制卵子和精子的排放實(shí)現(xiàn)羊棲菜人工種苗的規(guī)?；a(chǎn)[J]. 海洋科學(xué), 2001, 25（4）: 53-54.

[8] Pang S J, Shan T F, Zhang Z H,et al. Cultivation of the intertidal brown algaHizikia fusiformis（Harvey）Okamura: mass production of zygote-derived seedlings under commercial cultivation conditions, a case study experience[J]. Aquac Res. 2008, 39（13）: 1408-1415.

[9] Gillespie R D, Critchley A T. Assessment of spatial and temporal variability of threeSargassumspecies （Fucales, Phaeophyta） from KwaZulu-Natal, South Africa[J]. Phycol Res, 2001, 49: 241-249.

[10] 李廣武, 鄭從義, 唐兵. 低溫生物學(xué)[M]. 長(zhǎng)沙: 湖南科學(xué)技術(shù)出版社, 1998. 105-111.

[11] Pang S J, Chen L T, Zhuang D G,et al. Cultivation of the brown algaHizikia fusiformis（Harvey） Okamura:enhanced seedling production in tumbled culture[J].Aquaculture, 2005, 245: 321-329.

[12] Pang S J, Gao S Q, Sun J Z. Cultivation of the brown algaHizikia fusiformis（Harvey） Okamura: controlled fertilization and early development of seedlings in raceway tanks in ambient light and temperature[J]. J Appl Phycol, 2006, 18: 723-731.

[13] Pang S J, Zhang Z H, Zhao H J, et al. Cultivation of the brown alga Hizikia fusiformis （Harvey） Okamura:stress resistance of artificially raised young seedlings revealed by chlorophyll fluorescence measurement [J].J Appl Phycol, 2007, 19: 557-565.

[14] Starr R, Zeikus J A. ETEX-the culture collection of algae at the unversity of Texas at Austin[J]. J Phycol,1987, 23（Suppl.）: 41-47.

[15] Zou D H, Gao K S, Run Z X. Seasonal pattern of reproduction ofHizikia fusiforme（Sargassaceae, Phaeophyta） from Nanao Island, Shantou, China[J]. J App Phycol, 2006, 18: 195-201.

[16] Hwang E K, Cho Y C, Sohn C H. Reuse of holdfasts inHizikiacultivation[J]. J Korean Fish Soc, 1999, 32 （1）:112-116.

Survival and growth performance of zygotes/embryos of the brown alga Hizikia fusiformis after low temperature treatments

ZHANG Yu-rong1, PANG Shao-jun2

（1. Marine Fishery Institute of Zhejiang Province, Zhoushan, 316100, China; 2. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China）

Received: Nov., 25, 2008

Key words:Hizikia fusiformis; zygotes; low temperature; cultivation

Abstract:Hizikia fusiformishas been an important export-orientated brown alga in China. Large-scale cultivation relies on the supply of seedlings that are derived from sexual reproduction. With the development of the technique of synchronized fertilization, more and more seedlings are now produced via sexual reproduction. In this investigation, we performed a series of experiments to understand how zygotes of this alga develop and grow after short-term treatments at low temperature. Multi-celled embryos or two-cell zygotes ofH. fusiformiwere preserved at 5℃, for varied durations. The development of rhizoids, survivals of individuals, and growth performances were investigated.The results showed that the death rate of the two-cell zygote was conspicuously higher than that of the multi-cell zygote under the same conservation and recovering culture condition. The mortality of the multi-cell embryos was 10% after 60 h at 5℃, while that of the two-celled zygotes reached 75% after being preserved under the same condition. Discoveries in this investigation paved the way for transporting zygotes or embryos of this alga for completion of seedlings production over distance along the coast.

（本文編輯: 張培新）

Q178

A

1000-3096（2010）12-0070-05

2008-11-25;

2009-04-10

國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目 （2006AA10A412, 2006AA10A416）; 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30671596, 30471327）; 國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)工作項(xiàng)目（2006DKA30470-017）

張玉榮（1984-）, 女, 江蘇徐州人, 碩士, 從事大型藻種質(zhì)保存研究: 逄少軍, 通信作者, E-mail: sjpang@ms.qdio.ac.cn, 電話(huà): 0532-82898831